értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

komponens az ampicillin rezisztens pJKI132 plazmid, amely az IS30 transzpozázt kódolja
(14. ábra).
Első lépésként a Tn10 transzpozon segítségével a pJKI336 plazmid transzfere után random
mutagenezist hajtottunk végre. Ennek során a konjugációs donor az E. coli S17-1 pJKI336
Ap R , Km R törzs volt, amely a SE2102 Cm R recipiens törzsbe juttatta át a Tn10 transzpozon
konstrukciót hordozó pJKI336 plazmidot. A konjugáció után az inszerciót szenvedett,
kanamycin (és kloramfenikol) rezisztens SE2102 baktériumokra szelektáltunk. A mutagenezis
során a transzpozíciós gyakoriság 1x10 -5 és 3x10 -5 értékek között változott recipiens
baktériumra vonatkoztatva. A S. Enteritidis 11/2102 törzsön közel 3000 egyedi kanamycin
rezisztens inszerciós mutánst állítottunk elő. Ebből a mutáns gyűjteményből kellett
kiválasztanunk azokat a mutánsokat, amelyek a Tn10 inszerciót a virulencia plazmidon
szenvedték el. A vizsgálat végrehajtására egy olyan PCR-es szűrőrendszert terveztünk, amely
segítségével képesek voltunk az inszerciókat detektálni a virulencia plazmid egy viszonylag
nagy, 6 kb-os régiójában, az spv operonon (spvRABCD, Chu és mtsai., 1999). A tesztelendő
szakasz méretét úgy választottuk meg, hogy az elég nagy „felületet” nyújtson a véletlenszerű
mutagenezishez, ugyanakkor az is fontos szempont volt, hogy lehetőség szerint egy, vagy
néhány egyszerű PCR reakcióval lehessen dolgozni. (5 Mb-os Salmonella genommal
számolva, feltételezve, hogy a virulencia plazmid csak egy kópiában van jelen,
hozzávetőlegesen 800 mutáns közül egyben számíthattunk találatra egy 6 kb-os plazmid
szakasz tesztelése esetén.)
A tesztelő PCR rendszer primereit úgy terveztük meg, hogy az operon szélein elhelyezkedő
spvR és spvD génekből az operon közepe felé író két primer (spvfor, spvrev) és az IS10 végre
specifikus IS10L primerek kombinációja csak akkor adjon pozitív reakciót, ha ott jelen van a
Tn10 inszerció (12. ábra). Mivel a Taq polimeráz optimális esetben sem képes 6 kb hosszú
szakasz átírására, ezért az összeállított PCR csak akkor ad jelet, ha inszerció történt az spv
régióban. Így ezzel a módszerrel a mutánsok „poolozott” tesztelése is lehetségessé vált.
65