értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.3. Eredmények<br />
4.3.1. Előzetes eredmények<br />
Az előző fejezetben tárgyalt irányított transzpozon mutagenezis rendszerrel sikerült négy nem<br />
mozgó Salmonella Enteritidis 11 törzset létrehoznunk. Ezek közül háromnak (SE11/2102,<br />
2107, 2520) az inszerció pontos helye is ismert volt, így ezekkel dolgoztunk tovább. Első<br />
lépésként szükségesnek láttuk a mutánsokban még jelenlévő, fúziós transzpozáz termelő<br />
pFOL1111 plazmid kiűzését. Erre több okból is szükség volt: (i) a transzpozáz jelenlétében<br />
fennállt a veszélye az esetleges további genetikai átrendeződéseknek a vakcina jelölt<br />
törzsekben, (ii) a tervezett genetikai beavatkozásokhoz szükségünk volt az ampicillin<br />
markerre (amelyet a pFOL1111, a flagellin bénítás során használt fúziós transzpozáz termelő<br />
plazmid is hordoz), (iii) a soron következő állatkísérletre való tekintettel az antibiotikum<br />
rezisztens plazmid jelenlétét nem tartottuk kívánatosnak. A plazmid űzését a hagyományos,<br />
etídium-bromidos passzálási módszerrel hajtottuk végre. Öt passzálási lépés után a<br />
megvizsgált telepek mindegyike ampicillinre érzékeny volt mindhárom mutáns esetében (100,<br />
vagy több megvizsgált telep között nem találtunk rezisztens kolóniát) – vagyis a transzpozáz<br />
termelő plazmid nagy hatékonysággal eliminálódott.<br />
A következő lépésként naposcsibe modellen hasonlítottuk össze a nem mozgó mutánsok és a<br />
szülői törzs virulencia tulajdonságait (részletesen lásd: 5. fejezet). Ezen előzetes vizsgálatok<br />
alapján a három törzs között naposcsibe szerv-inváziós tulajdonságaik tekintetében nem<br />
mutatkozott lényeges eltérés, míg a legmagasabb vakbél titert a SE11/2102 törzs érte el, így a<br />
további kísérletek céljából ezt a mutánst választottuk ki.<br />
4.3.2. Virulencia plazmid űzési eredmények hagyományos módszerekkel<br />
A Salmonella virulencia plazmid kiűzését a nem mozgó SE11/2102 törzsből elsőként a<br />
hagyományos, etídium-bromidos táplevesben való passzálással, magas, szubletális<br />
hőmérsékleten való passzálással, valamint ezek kombinációjával próbáltuk elérni.<br />
A plazmidot hordozó törzset négy különböző koncentrációjú (20, 30, 40 és 50 µg/ml) EtBr-ot<br />
tartalmazó táplevesbe oltottuk. Az inkubálást 37 ºC-on és szubletális hőmérsékleten (41-43<br />
ºC) végeztük álló és rázatott tenyészettel egyaránt. A törzset naponta friss, rázatott EtBr-os<br />
63