értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

Azokat a nyolcas csoportokat, amelyek a csoportos PCR-rel pozitívnak bizonyultak
fölbontottuk, vagyis az abban szereplő mutánsokból egyenként templátot preparáltunk, majd
ezekkel a templátokkal a PCR-t megismételtük.
A PCR reakció az alábbi program szerint zajlott: a kezdeti 94°C-os 3 perces denaturáció után
35-szörös ismétlésben:
94°C-on 20 másodperc denaturáció,
55°C-on 60 másodperc primerkötődés,
72°C-on 180 másodperc szintézis.
A 35 ciklus után egy 72 °C-os, 7 perces végső extenziós lépés következett. Majd 4 °C-os
tárolás következett felhasználásig.
Szekvencia analízis:
A pozitív mutánsok PCR termékeit az IS10L primerrel szekvenáltattuk, hogy
megbizonyosodjunk az inszerció pontos helyéről. A szekvenálásokat a gödöllői
Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ szolgáltató laboratóriumában végeztettük ABI
Prism 301 Genetic Analyser (Applied Biosystems) készülék segítségével.
A szekvenciák összehasonlítását NCBI GenBank adatbanki adatokkal az NCBI BLAST
szoftvercsomag blastn (standard nucleotide-nucleotide BLAST) és BLAST 2 Sequences
similarity search (Altschul és mtsai. 1990) programjaival végeztük.
Deléciógenerálás IS30 transzpozáz segítségével
Az SE 612 jelű mutánst, mely a fentiek alapján az inszerciót az spv operonban, vagyis a
virulencia plazmidon hordozta a pJKI132 IS30 transzpozáz termelő plazmiddal
transzformáltuk. A transzpozáz termelődést IPTG segítségével indukálva, öt lépésig
passzáltuk és az egyes passzálási lépésekből kloramfenikol tartalmú lemezre szélesztettünk.
Az így nyert egyedi telepek közül 100-100 telepet kiválasztva steril fogpiszkálóval átoltottuk
kanamycin-kloramfenikol, valamint csak kloramfenikol tartalmú táptalajra. Itt kiválogattuk a
kanamycin érzékeny telepeket, (amelyek elszenvedték az IS30 által kiváltott deléciót) és
vizsgáltuk a rezisztenciájukat elvesztett mutánsok arányát az egyes passzálási lépésekben. A
kiválasztott érzékeny telepeket a virulencia plazmid jelenlétére a plazmid specifikus parBS és
spvC primerekkel tovább teszteltük.
62