értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

4.2.6. Transzpozon alapú plazmid űzés
Törzsek:
Donor : E. coli S17-1 pJKI 336 Ap R , Km R
Recipiens : Salmonella Enteritidis 11/2102 Cm R , fliD -
Transzpozon mutagenezis:
A mutagenezis során először az IS10 transzpozont (Km R ) hordozó pJKI 336 plazmid
(Ap R ) természetes konjugációval átkerül a Salmonella sejtbe. Mivel azonban itt defektív
replikációs origója miatt nem tud fennmaradni, így a transzpozíció megtörténte után a
pJKI336 plazmid elvész a sejtből (Ap S ). A konjugáció után a transzpozon inszerciót hordozó,
plazmidot elvesztett Cm R ,Km R ,Ap S Salmonella Enteritidis 11/2102 sejtekre szelektálunk.
A konjugáció részletes menetét lásd a 3.2.6. részben.
Csoportos („poolozott”) PCR-es tesztelés:
Az előzőekben kiválogatott mutánsok közül PCR-es teszteléssel próbáljuk megtalálni
azokat, melyek az inszerciót a virulencia plazmidjukon szenvedték el. A tesztelés során az spv
operont vizsgáltuk két primerpár (IS10L-spvfor és IS10L-spvrev) segítségével, melyek csak
akkor adnak reakciót, ha az inszerciós szekvencia (IS10-származék) az spv területére
ékelődött be. Mivel a tesztelés során a pozitív választ adó mutánsokat kerestük, a vizsgálatot
„poolozott” mintákkal, vagyis több törzset egyszerre tesztelve lehetett végezni.
A tesztelés menete:
1. PCR templát preparálásához a tisztított, egyedi mutánsainkat ELISA lemezen, 100 µl
Cm tartalmú LB levesbe oltjuk.
2. Inkubáció, 37°C, O/N
3. A mutánsokat nyolcasával (az ELISA lemez oszlopaiként) összegyűjtjük: a 100 µl
tenyészeteket egy Eppendorf csőbe mérjük.
4. Centrifugálás 10000 rpm-en, 5 percig (összegyűjtjük a sejteket).
5. Elöntjük a felülúszót, a sejteket 100 µl steril MQ-vízbe visszavesszük.
6. Forralás 20 percig.
7. Fagyasztás 20 percig, -20°C-on.
8. Centrifugálás maximum sebességen, 15 percig.
9. A felülúszót új csőbe tesszük át, ez lesz a PCR templát.
61