értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

Polimeráz láncreakció (PCR)
A plazmid űzési munkák során használt PCR primerek szekvenciái és fontosabb adatai a VIII.
táblázatban találhatók. A PCR paraméterei a 2.2.2. pontban leírtakkal azonosak, kivéve a
primer csatolási hőmérsékleteket, amelyeket a VIII. táblázatban a primerszekvenciák mellett
tüntettünk fel. A transzpozon inszerció tesztelő PCR-t a 4.2.6. pontban később részletesen
ismertetjük.
VIII. táblázat A plazmid űzési munkák során használt PCR primerek fontosabb adatai
Név Cél gén Szekvencia (5’-3’) Referencia Tm
IS10L IS10 IR TTAAGATCTA CAAGATGTGT ATCCACCTTA AC
spvfor spvR AGGAGATATT ATGGATTTCT TGATTAA
spvrev spvD
TGTAAGCTAG GAAGTATGTT GGATG
par1 parBS GGCGTCAATG GTTGAGATGA CT
par2 parBS GTCCAGTTCA TCCTGAACCA CT
spvC-1 spvC CCCATAAATA GGCCTAATCT
spvC-2 spvC
TTACTCTGTC ATCAAACGAT
60
Jelen munka 55ºC
Chu
1999
és mtsai.,
Haneda és mtsai.,
2001
53ºC
60ºC
Plazmid DNS tisztítás
A plazmidok tisztítása rendszerint a Birnboim-Dolly féle lúgos gyors plazmid izolálás szerint
(Birnboim és Dolly, 1979) történt, kivéve a nagyméretű Salmonella virulencia plazmid
izolálását, amelyet Kado-Liu módszere szerint végeztünk (Kado és Liu, 1981).
4.2.5. Plazmid űzési kísérletek hagyományos (fizikai-kémiai) módszerekkel
Etídium-bromidos (EtBr) és szubletális hőmérsékleten való passzálás: A plazmidot tartalmazó
törzset 2 ml különböző koncentrációjú (20, 30, 40 és 50 µg/ml) EtBr-ot tartalmazó LB
táplevesbe oltottuk. Az inkubálást 37 ºC-on és szubletális hőmérsékleten (41-43 ºC) végeztük
álló és rázatott tenyészettel egyaránt. A törzset naponta friss, EtBr-os LB levesbe átoltva
összesen 40 lépésig passzáltuk. A tenyészetekből minden ötödik passzálási lépés után mintát
vettünk úgy, hogy a tenyészetet LB tápagar felszínén egyes telepre szélesztettük, majd az így
nyert izolált egyedi telepeket a plazmid jelenlétére PCR-rel teszteltük.