értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

More documents

Recommendations

Info

Rövidítések jegyzéke Ap: ampicillin BTK: bróm-timol kékes agar CEF: csirke embrió fibroblaszt (chicken embryo fibroblast) CIG: az IS30 konszenzus szekvenciája (consensus of insertions in genome of E. coli) Cm: kloramfenikol DAS ELISA: Double antibody sandwich Enzyme –linked immunosorbent assay DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium IPTG: izopropiltio-β-D-galaktozid IS: inszerciós szekvencia Km: kanamycin LB: Luria-Bertani tápleves MEM: minimal essential medium MQ: MilliQ szűrt víz Nal: nalidixinsav O/N: éjszakán át tartó inkubáció (over night) PAGE: poliakril-amid PBS: foszfát puffer PCR: polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) RV: Rappaport-Vassiliadis dúsító SCV: Salmonellát hordozó vakuólum (Salmonella containing vacuole) SDS: nátrium dodecil szulfát SOC: (super optimal catabolite repression broth) SPF: meghatározott pathogénektől mentes állat (sppecified pathogen free) SPI: Salmonella pathogenitási sziget (Salmonella pathogenicity island) TAE: tris acetát EDTA puffer TBE: tris borát EDTA puffer TE: tris EDTA oldat Tn: transzpozon TSB: tripton szója leves TTSS: hármas típusú szekréciós rendszer (Type three secretion system) 6
Összefoglalás Munkánk elsődleges célja olyan transzpozon mutagenezis rendszerek kidolgozása és kipróbálása volt, melyek segítségével Salmonella Enteritidis törzsek markerezése és virulencia csökkentése érhető el, távlati vakcina fejlesztések céljából. Részletesebben: 1. A Salmonella Enteritidis és néhány egyéb érdekes szerovariáns törzseinek PCRes vizsgálata flagellin termelés és flagellin fázisváltás szempontjából. 2. Salmonella flagellin génekre kidolgozott irányított transzpozon-mutagenezis rendszer létrehozása és működésének vizsgálata annak érdekében, hogy flagella mentes, ezáltal markerezett vakcinajelölt törzset állítsunk elő. 3. A markerezett törzs virulenciájának csökkentése a virulencia plazmid kiűzésével. 4. Az így előállított Salmonella Enteritidis vakcina jelölt törzsek korai védőhatásának vizsgálata. Munkánk első lépésében egy PCR-es tesztelő rendszert terveztünk, amely alkalmasnak bizonyult Salmonella törzsek flagellin termelő génjeinek és a flagellin fázisváltó rendszer elemeinek vizsgálatára. E módszerrel megerősítettük, hogy a Salmonella Enteritidis törzsek flagellin fázisváltásra való képtelenségének oka, hogy azokból mindig hiányzik a salmonellákra jellemző fázisváló rendszer és csak a fliC gén, valamint annak operátor szekvenciája van jelen. Annak érdekében, hogy a vakcina jelölt törzseinket molekuláris markerrel lássuk el, irányított transzpozon-mutagenezis rendszert dolgoztunk ki a Salmonella flagellin génekre. Ennek során a flagellin represszor fljA gént fúzionáltattuk az IS30 transzpozáz génjével, majd az így létrejött IS30-FljA fúziós fehérje működését a Salmonella Enteritidis 11 jelű törzsünkben vizsgáltuk. A módszer segítségével több flagellin bénított mutánst állítottunk elő. A hagyományos módszerekkel nehezen kiűzhető, nagyméretű Salmonella virulencia plazmid kiűzésére új, transzpozon alapú eljárást dolgoztunk ki. A módszer a flagellin mentes S. Enteritidisben nagy (50% feletti) virulencia plazmid űzési gyakorisággal működött. Az előállított nem mozgó (SE2102) valamint „virulencia plazmid mentes, nem mozgó” (SE∆155) Salmonella Enteritidis 11 származékok virulencia tulajdonságait in vitro (sejtkultúrán), és in vivo körülmények között (naposcsibe modellen) vizsgáltuk. A szülő törzshöz képest mind a SE2102, mind a SE∆155 mutáns in vitro sejt inváziós képessége igen jelentősen csökkent. Szintén csökkent in vivo körülmények között a mutánsok naposcsibe szerv inváziós képessége, míg a vakbélben elért élő csíraszámok nem változtak jelentősen. A SE11 törzs egyik, virulencia plazmid mentes, nem mozgó mutánsának korai védekező képességet stimuláló hatását vizsgálva megállapítottuk, hogy egyszeri alkalmazással a ráfertőző vad virulens törzs szerv inváziójával szemben a szülő törzshöz hasonló mértékű, jelentős, az élet első négy hetében jól érvényesülő korai védelmet nyújtott. 7
Page 1 and 2: Szent István Egyetem Állatorvos-t
Page 3 and 4: Tartalomjegyzék Rövidítések jeg
Page 5: 5.2. Anyagok és módszerek 77 5.2.
Page 9 and 10: Azokat a szalmonellákat, amelyek k
Page 11 and 12: A S. Gallinarum-Pullorumtól eltér
Page 13 and 14: Salmonella pathogenitási sziget 2
Page 15 and 16: kitüremkedések jelennek meg és k
Page 17 and 18: feltehetően a vezikulumokat mozgat
Page 19 and 20: tapasztalatunk az egyes élő orál
Page 21 and 22: 2. A flagellin rendszer és PCR-es
Page 23 and 24: 2.2 Anyagok és módszerek 2.2.1. B
Page 25 and 26: I. Táblázat A vizsgált Salmonell
Page 27 and 28: 2.3. Eredmények és megbeszélés
Page 29 and 30: hixL Nincs inverzió P hin hixR flj
Page 31 and 32: Amint a bevezetőben már említett
Page 33 and 34: 3.1.2. Transzpozonokon alapuló mut
Page 35 and 36: 3.2. Anyagok és módszerek 3.2.1.
Page 37 and 38: Ligálás -2 µl (kb. 20-50 ng) vek
Page 39 and 40: 7. Konjugációs lépés: összekev
Page 41 and 42: leolvasási keretben a PstI hasít
Page 43 and 44: S. Enteritidis 11 operátor fli C T
Page 45 and 46: Elvégezve a kísérletet (8. ábra
Page 47 and 48: 9. ábra A vad típusú (+) és a n
Page 49 and 50: 3.3.5. Az FljA-IS30 fúziós transz
Page 51 and 52: 3.4. Megbeszélés A mobilis geneti
Page 53 and 54: teszttel vizsgálva lényegesen gye
Page 55 and 56: Továbbra is nyitott maradt viszont
Page 57 and 58:
11. ábra A S. Enteritidis virulenc
Page 59 and 60:
4.2. Anyagok és módszerek 4.2.1.B
Page 61 and 62:
4.2.6. Transzpozon alapú plazmid
Page 63 and 64:
4.3. Eredmények 4.3.1. Előzetes e
Page 65 and 66:
komponens az ampicillin rezisztens
Page 67 and 68:
13. ábra Az SE 612 Km R törzs azo
Page 69 and 70:
Az IS30 transzpozáz indukciója me
Page 71 and 72:
15. ábra Különböző deléciós
Page 73 and 74:
Mindezek ellenére sajnos a klasszi
Page 75 and 76:
meg segítségükkel: Tn5-sacB (Hyn
Page 77 and 78:
követelmények között a hatékon
Page 79 and 80:
4. Az inkubáció után a felülús
Page 81 and 82:
XII. táblázat A real-time PCR-ek
Page 83 and 84:
XIII. táblázat A védőhatás viz
Page 85 and 86:
5.3. Eredmények 5.3.1. Az in vitro
Page 87 and 88:
log10 CFU/ml 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,
Page 89 and 90:
csökkentő munkáknak, azonban el
Page 91 and 92:
Az állatkísérleti rendszer megeg
Page 93 and 94:
pozitív minták 90,00% 80,00% 70,0
Page 95 and 96:
% pozitivitás 120 100 80 60 40 20
Page 97 and 98:
XVI. táblázat A korai védelmet v
Page 99 and 100:
XVIII. táblázat A korai védelmet
Page 101 and 102:
5.4. Megbeszélés Munkánk utolsó
Page 103 and 104:
naposcsibéknek (CEVA), melyek felt
Page 105 and 106:
Záró megbeszélés Mint az irodal
Page 107 and 108:
kísérleti fertőzése kapcsán k
Page 109 and 110:
Kísérleteink további célja volt
Page 111 and 112:
Az előállított nem mozgó (SE210
Page 113 and 114:
Barrow PA. The paratyphoid salmonel
Page 115 and 116:
Desmidt M, Ducatelle R, Haesebrouck
Page 117 and 118:
Hassan JO, Curtiss R 3rd. Developme
Page 119 and 120:
Kingsley RA, Baumler AJ. Host adapt
Page 121 and 122:
Nagy B, Kovács S, Milch H, Bitay Z
Page 123 and 124:
Szmollény G, Tóth I, Rásky K, P
Page 125 and 126:
Zhou D, Mooseker MS, Galan JE. Role
Page 127 and 128:
3. Nógrády N., Imre A., Nagy B. (
Page 129:
Köszönetnyilvánítás Őszintén
show all

értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?