értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

megváltoztatható, és a fúziós transzpozáz a gazdaszervezetek széles tartományában
működőképes.
Az IS30 transzpozázra vonatkozó eredmények ismeretében lehetségesnek tűnt a tervezett
Salmonella vakcina markerezési munkák végrehajtásához egy flagellin génekre tervezett,
IS30 alapú irányított mutagenezis rendszer kialakítása. A Salmonella Enteritidis flagellin
rendszerének PCR-es vizsgálata alapján (2. fejezet) a monofázisos szerovariánsban
megtalálható a fliC operátor szekvencia, amely közvetlenül az egyetlen flagellin
struktúrgénként jelenlévő fliC mellett helyezkedik el, így kézenfekvő célpontot kínál az
irányított mutagenezishez. Ismert az operátor DNS kötő fehérjéje is, az FljA represszor, amely
ráadásul a S. Enteritidis törzsekben nem található meg. Így az FljA-val történő irányított
mutagenezis az eredeti represszor zavaró hatásától mentes környezetben hajtható végre. A
kísérlet végrehajtásához ezért egy olyan fúziós fehérjét hoztunk létre, amely az IS30
transzpozázból és az annak C-terminálisához kapcsolt FljA flagellin represszorból állt.
A fúziós konstrukció elkészítése után első lépésként annak aktivitását vizsgáltuk a kiválasztott
S. Enteritidis 11 törzsben. Mutagenezist végeztünk mind a vad típusú IS30 transzpozázzal,
mind az általunk készített IS30-FljA fúziós konstrukcióval, és azt tapasztaltuk, hogy a két
transzpozáz között nincs jelentős eltérés a transzpozíciós gyakoriság tekintetében, a vad típus
8,31x10 -5 -1,44x10 -4 míg a fúziós transzpozáz 1,62x10 -4 -1,78x10 -4 közötti értékeket produkált.
Ezen adatok megegyeznek a természetes gazda Escherichia coliban mérhető 10 -4 -10 -5
értékekkel, tehát a vad és a fúziós fehérje is megfelelő aktivitást mutat S. Enteritidisben.
Irányított és kontroll Salmonella mutánsok gyűjtése céljából három-három párhuzamos
mutagenezist végeztünk a SE11 törzsön mind a fúziós, mind a vad típusú transzpozázzal. Az
irányított és a kontroll mutagenezisből összesen 600-600 egyedi mutáns (Ap R , Cm R ) SE11
telepet izoláltunk, úgy, hogy a független kísérletekből egyenként 200-200, mutánst
választottunk ki, ezzel is csökkentve a testvér kolóniák kiválasztásának esélyét. Az izolált
mutánsok mozgási képességét fenotípusos mozgásteszttel megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy
az irányított, IS30-FljA fúziós transzpozázzal sikerült összesen négy nem mozgó mutáns
törzset előállítanunk (4/600 ≈ 0,7%), ezzel szemben a kontroll, vad IS30-cal nyert mutánsok
között nem találtunk egyetlen nem mozgó törzset sem (0/600 = < 0,17 %). A négy nem
mozgó mutáns három független kísérletből származott, tehát nem egy mutáns utódtelepeit
izoláltuk. Még szembeötlőbbnek tűnt a két módszer közötti különbség azon mutánsok számát
tekintve, amelyek nem vesztették el ugyan teljesen a mozgásképességüket, de a lágyagaros
52