értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

3.3. Eredmények
3.3.1. Előzetes kísérleti eredmények
Amint azt a 2.3. fejezetben már részletesen ismertettük, az irányított mutagenezis
előkísérleteiként öt Salmonella szerovariáns több, mint 70 törzsét vizsgáltuk meg különböző
flagellin gének jelenlétére. A megvizsgált öt szerovariáns (S. Enteritidis, S. Typhimurium, S.
Hadar, S. Gallinarum és S. Abortusequi) előszűrése a mutagenezis szempontjából fontos fljB,
hin, hixL, hixR, fliC, fliC operátor és fljA szekvenciákra irányult. A vizsgálatok azt mutatták,
hogy a S. Enteritidis törzsekben, (ellentétben a tesztelt mozgásképes egyéb Salmonella
szerovariánsok mindegyikével, így a S. Typhimuriummal) csak egyetlen flagellin gén, a fliC
és a fliC operátor szekvenciája van jelen (2.3. fejezet, III. táblázat), mely utóbbi egyben az
FljA represszor fehérje kötődési helye.
Az, hogy a S. Enteritidis csak egy flagellin génnel rendelkezik, s hogy ugyanakkor e mellett a
gén mellett jelen van az FljA kötőhelye (a fliC operátor), ideális mutagenezis célponttá teszi
ezt a szerovariánst.
3.3.2. A mutagenezis rendszer kidolgozása
Az előzőekben leírtak alapján a S. Enteritidis fliC génjének irányított transzpozon
mutagenezisére koncentráltunk, mely régióban célszekvenciaként a fliC gén operátora
szerepel.
A transzpozáz termelő konstrukciót (6. ábra) úgy hoztuk létre, hogy az IS30 transzpozáz Cterminális
régiójához fuzionáltuk a fliC operátor represszorát, az FljA-t kódoló szakaszt.
Ehhez alapvektorként rendelkezésre állt az Amp R pJKI132 plazmid (Farkas és mts. 1996)
melyben az IS30 transzpozáz gén expressziója egy indukálható tac promóter kontrollja alatt
áll. Irányított mutagenezissel az IS30 utolsó kódonja után a megfelelő leolvasási keretbe egy
PstI hasítóhely került beépítésre, így lehetővé vált erre a helyre gének klónozása. Első
lépésként az fljA gént amplifikáltuk úgy, hogy a PCR-hez használt primerek 5’ végei a
megfelelő leolvasási keretben tartalmazták a klónozáshoz szükséges PstI hasítóhelyeket.
A fúziós transzpozázt termelő pFOL1111 plazmid (6. ábra) készítésekor a pJKI132 plazmid
HindIII helyén a 0,78 kb-os HindIII fragmentet cseréltük a pMSZ165 (Szabó és mtsai., 2003)
1,3 kb-os fragmentjére. Ez utóbbi tartalmazta a az IS30 utolsó kódonja után a megfelelő
40