értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

A fúziós fehérje termelődésének ellenőrzése
- A fehérje termelő baktérium egy éjszakás levestenyészetéből 0,5 ml-t átoltottuk 4,5 ml,
antibiotikummal kiegészített LB táplevesbe, majd egy órán át rázatva inkubáltuk 37°C-on.
- Az így felfrissített tenyészetet két 2 ml-es részre osztjuk, melyek közül az egyiket 10 µl 100
mM-os IPTG oldattal indukáltuk. Az indukálatlan és az IPTG-vel indukált tenyészeteket
tovább inkubáltuk 3 órán át, 37 °C-on.
- A baktérium tenyészeteket 0,5 ml fiziológiás sóoldattal mostuk.
- A mosott tenyészetet felvettük 200 µl SDS mintapufferben, melyet 20 µl merkeptoetanollal
egészítettünk ki.
- A teljes fehérje kivonáshoz a szuszpenziót 5 percig forraltuk.
- Az így nyert minták 3 µl-ét 8%-os poliakrilamid gélen futtattuk
- A gélt Coomassie Brilliant Blue festékkel festettük.
3.2.5. Szekvencia analízis
A GCG program-csomag (Wisconsin Package Version 10.2) felhasználásával történt. A
szekvenciák összehasonlítását NCBI GenBank adatbanki adatokkal az NCBI BLAST
szoftvercsomag blastx (BLAST Nucleotide query - Protein db), blastn (standard nucleotidenucleotide
BLAST) és BLAST 2 Sequences similarity search (Altschul és mtsai. 1990)
programjaival végeztük.
3.2.6. Transzpozon mutagenezis baktérium konjugációval
1. A donor és recipiens törzsek leoltása ferde agarról a megfelelő antibiotikumokkal
kiegészített 2 ml LB levesbe .
2. Inkubáció, 37°C, O/N, rázatva
3. Centrifugáltuk a tenyészetek 1,5 ml-ét 10000 rpm-en, 5 percig (összegyűjtjük a sejteket).
4. Mostuk a sejteket 1 ml steril fiziológiás sóoldattal, hogy megszabaduljunk az
antibiotikumok maradványaitól.
5. Centrifugálás 10000 rpm-en, 5 percig.
6. Reszuszpendáltuk a sejteket 1 ml steril fiziológiás sóoldattal.
38