értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

Ligálás
-2 µl (kb. 20-50 ng) vektor DNS-t
-5 µl (kb. 100-200 ng) fragment DNS-t
-2 µl ligáz puffert
-1 µl (5 egység) T4 ligáz enzimet
-10 µl H2O-t összekevertünk, egy éjszakán át inkubáltuk 15 C°-on.
Elektrokompetens sejtek készítése
-200 ml LB-ben antibiotikum mellett (ha szükséges volt) növesztettük a sejteket, míg elérték a
600 nm-en mért 0,5-0,8 közötti optikai denzitást.
- 15 percig 5000 g-vel 4 C°-on centrifugáltuk.
- A sejteket szuszpendáltuk 200 ml ionmentes vízben.
- 15 percig 6000 g-vel 4 C°-on centrifugáltuk.
- Szuszpendálás 100 ml ionmentes vízben.
- 15 percig 6000 g-vel 4 C°-on centrifugáltuk.
- Ismét szuszpendáltuk 100 ml ionmentes vízben.
- 15 percig 6000 g 4 C°-on centrifugáltuk.
- A sejteket 4 ml 10%-os glicerin oldattal mostuk
- 20 percig 7000 g 4 C°-on centrifugáltuk.
- A sejteket 0,4 ml 10%-os glicerin oldatban felszuszpendáltuk
- Az így elkészült kompetens sejteket 40 µl-enként Eppendorf csövekbe szétosztva -70 C°-on
tároltuk.
Elektroporálásos transzformálás
- A plazmid DNS preparátum 1 µl-ét hozzáadtuk 40µl kompetens sejthez
- A keveréket 2 mm elektród távú speciális, elektroporáláshoz alkalmas küvettába helyeztük
át, majd
- Az elektroporátor (BTX) beállítása után (50µF kapacitás, 129Ω ellenállás), a fegyverzeteken
eső 0,9 kV feszültségel sokkoltuk.
- Elektromos sokk után, a baktériumokat SOC közegben, 1,5 órán át, 37°C-on, közepes
erőséggel rázatva növesztettük.
- A transzformált sejteket különböző hígításban a megfelelő antibiotikumot tartalmazó LB
lemezekre szélesztettük, s a lemezeket 37°C-on, éjszakán át inkubáltuk.
37