értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Ligálás<br />
-2 µl (kb. 20-50 ng) vektor DNS-t<br />
-5 µl (kb. 100-200 ng) fragment DNS-t<br />
-2 µl ligáz puffert<br />
-1 µl (5 egység) T4 ligáz enzimet<br />
-10 µl H2O-t összekevertünk, egy éjszakán át inkubáltuk 15 C°-on.<br />
Elektrokompetens sejtek készítése<br />
-200 ml LB-ben antibiotikum mellett (ha szükséges volt) növesztettük a sejteket, míg elérték a<br />
600 nm-en mért 0,5-0,8 közötti optikai denzitást.<br />
- 15 percig 5000 g-vel 4 C°-on centrifugáltuk.<br />
- A sejteket szuszpendáltuk 200 ml ionmentes vízben.<br />
- 15 percig 6000 g-vel 4 C°-on centrifugáltuk.<br />
- Szuszpendálás 100 ml ionmentes vízben.<br />
- 15 percig 6000 g-vel 4 C°-on centrifugáltuk.<br />
- Ismét szuszpendáltuk 100 ml ionmentes vízben.<br />
- 15 percig 6000 g 4 C°-on centrifugáltuk.<br />
- A sejteket 4 ml 10%-os glicerin oldattal mostuk<br />
- 20 percig 7000 g 4 C°-on centrifugáltuk.<br />
- A sejteket 0,4 ml 10%-os glicerin oldatban felszuszpendáltuk<br />
- Az így elkészült kompetens sejteket 40 µl-enként Eppendorf csövekbe szétosztva -70 C°-on<br />
tároltuk.<br />
Elektroporálásos transzformálás<br />
- A plazmid DNS preparátum 1 µl-ét hozzáadtuk 40µl kompetens sejthez<br />
- A keveréket 2 mm elektród távú speciális, elektroporáláshoz alkalmas küvettába helyeztük<br />
át, majd<br />
- Az elektroporátor (BTX) beállítása után (50µF kapacitás, 129Ω ellenállás), a fegyverzeteken<br />
eső 0,9 kV feszültségel sokkoltuk.<br />
- Elektromos sokk után, a baktériumokat SOC közegben, 1,5 órán át, 37°C-on, közepes<br />
erőséggel rázatva növesztettük.<br />
- A transzformált sejteket különböző hígításban a megfelelő antibiotikumot tartalmazó LB<br />
lemezekre szélesztettük, s a lemezeket 37°C-on, éjszakán át inkubáltuk.<br />
37