értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola

cégek termékei. A restrikciós emésztésekhez ugyancsak a Fermentas illetve a Boehringer-
Mannheim féle pufferrendszereket használtuk.
Az általunk használt T4 DNS ligáz enzim az MBI Fermentas terméke volt.
Polimeráz láncreakció (PCR)
A PCR-rel előállított klónozandó fragmentumok amplifikálásához hibajavító aktivitással is
rendelkező Pwo polimerázt, míg a tesztelésekhez Taq polimerázt használtunk. A PCR
paraméterei az előző fejezet 2.2.2. pontjában leírtakkal azonosak voltak. Az fljA gén
klónozásához használt fljANtermPstfor és fljACtermPstrev primerek szekvenciái a II.
táblázatban találhatóak.
Plazmid DNS tisztítás
A Birnboim-Dolly féle lúgos gyors plazmid izolálás szerint (Birnboim és Dolly, 1979) történt:
- E. coli sejteket 2 ml antibiotikumtartalmú LB-ben egy éjszakán át növesztettük
- 1,5 ml-t Eppendorf csőbe öntve centrifugáltuk (2’, 10000 g)
- 100 µl lízis (I-es) oldatban felszuszpendáltuk, 10’ inkubálás jégen
- 200 µl alkalikus SDS (II-es) oldatot hozzáadva óvatosan kevertük, 5’ inkubálás szobahőn
- 150 µl 3 M nátrium-acetát (III-as) oldatot (pH 4,8) hozzáadtunk, 15’ inkubálás jégen
- centrifugálás (15’, 12000 g), felülúszóhoz 1 ml tömény etanolt adva inkubáltuk: 15’ -20 ºC
- centrifugálás (15’, 12000 g)
- a kiülepedett DNS-t kétszer 70%-os etanollal mostuk
- szárítás, feloldás 70 µl TE-ben
Restrikciós emésztés
1-5 µl plazmid DNS-t, amely 50-200 ng DNS-nek felel meg (Birnboim-Dolly módszer szerint
tisztítva)
2 µl puffert (Boehringer-Mannheim vagy Fermentas pufferrendszer szerint)
10 egység (1 µl) restrikciós endonukleázt (kettős emésztésnél 1 µl a másik enzimből is)
desztillált vízzel 20 µl-re kiegészítettünk
36