értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
cégek termékei. A restrikciós emésztésekhez ugyancsak a Fermentas illetve a Boehringer-<br />
Mannheim féle pufferrendszereket használtuk.<br />
Az általunk használt T4 DNS ligáz enzim az MBI Fermentas terméke volt.<br />
Polimeráz láncreakció (PCR)<br />
A PCR-rel előállított klónozandó fragmentumok amplifikálásához hibajavító aktivitással is<br />
rendelkező Pwo polimerázt, míg a tesztelésekhez Taq polimerázt használtunk. A PCR<br />
paraméterei az előző fejezet 2.2.2. pontjában leírtakkal azonosak voltak. Az fljA gén<br />
klónozásához használt fljANtermPstfor és fljACtermPstrev primerek szekvenciái a II.<br />
táblázatban találhatóak.<br />
Plazmid DNS tisztítás<br />
A Birnboim-Dolly féle lúgos gyors plazmid izolálás szerint (Birnboim és Dolly, 1979) történt:<br />
- E. coli sejteket 2 ml antibiotikumtartalmú LB-ben egy éjszakán át növesztettük<br />
- 1,5 ml-t Eppendorf csőbe öntve centrifugáltuk (2’, 10000 g)<br />
- 100 µl lízis (I-es) oldatban felszuszpendáltuk, 10’ inkubálás jégen<br />
- 200 µl alkalikus SDS (II-es) oldatot hozzáadva óvatosan kevertük, 5’ inkubálás szobahőn<br />
- 150 µl 3 M nátrium-acetát (III-as) oldatot (pH 4,8) hozzáadtunk, 15’ inkubálás jégen<br />
- centrifugálás (15’, 12000 g), felülúszóhoz 1 ml tömény etanolt adva inkubáltuk: 15’ -20 ºC<br />
- centrifugálás (15’, 12000 g)<br />
- a kiülepedett DNS-t kétszer 70%-os etanollal mostuk<br />
- szárítás, feloldás 70 µl TE-ben<br />
Restrikciós emésztés<br />
1-5 µl plazmid DNS-t, amely 50-200 ng DNS-nek felel meg (Birnboim-Dolly módszer szerint<br />
tisztítva)<br />
2 µl puffert (Boehringer-Mannheim vagy Fermentas pufferrendszer szerint)<br />
10 egység (1 µl) restrikciós endonukleázt (kettős emésztésnél 1 µl a másik enzimből is)<br />
desztillált vízzel 20 µl-re kiegészítettünk<br />
36