értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
értekezés - Állatorvostudományi Doktori Iskola
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
3.1.2. Transzpozonokon alapuló mutagenezis rendszerek<br />
A mobilis genetikai elemek (IS elemek, transzpozonok) mint mozgékony, áthelyeződésre<br />
képes DNS szakaszok, képesek a gazdaszervezet genomjába integrálódni, és ott mutációkat<br />
létrehozni. Ezzel a genom kutatásának és átalakításának kiváló eszközei lehetnek. Az<br />
inszerciók által generált mutációknak igen fontos előnye, hogy nem csupán fenotípusuk<br />
detektálható, hanem egyúttal ”fizikailag” is megjelölik a mutáns gént. Ily módon hatékony<br />
inszerciós mutagenezist tesznek lehetővé, melynek révén mutációkat hoznak létre vagy<br />
véletlenszerűen, vagy közel véletlenszerűen, ez utóbbi esetben mutációs célpontként<br />
kiválasztva bizonyos szekvencia-mintázatokat („hot-spot”).<br />
A bakteriális eredetű IS30 inszerciós szekvencia (Dalrymple és mts. 1984) egy részletesen<br />
tanulmányozott mozgékony elem, mely 1221 bp hosszú és egyetlen nagy nyitott leolvasási<br />
kerete a 44,3 kDa méretű transzpozáz fehérjét kódolja. Az elem két szélén 26 bázispár<br />
hosszúságú IR végek (inverted repeat, fordított irányú ismétlődés) találhatók.<br />
Génátrendeződés esetén az IR végek mellett hasítódik ki az elem. Azonban ezt a reakciót<br />
megelőzi az elem igen aktív transzpozíciós intermedier formájának kialakulása (Olasz és<br />
mtsai, 1993, Kiss és Olasz 1999), amely két azonos orientációban egymáshoz kapcsolódó IS<br />
elemből áll – jelölése: (IS30)2 –, amely közel 1000-szer nagyobb transzpozíciós gyakorisággal<br />
jellemezhető, mint a monomer forma. A transzpozíció során az (IS30)2 struktúra megoldódik,<br />
s az így kialakult inszerciós termék már stabil.<br />
Az IS30 rendelkezik saját targetspecificitással. A „hot spot” szekvenciái egy konszenzussal<br />
jellemezhetők, amely azonban a legtöbb pozícióban nem szigorúan meghatározott (Olasz és<br />
mtsai, 1998).<br />
A transzpozáz fehérje, amely a reakciót katalizálja, mind cisz, mind transz helyzetben aktív,<br />
ami azt jelenti, hogy a transzpozáz gén az aktív (IS30)2 struktúrától különválasztható.<br />
3.1.3. Az irányított mutagenezis rendszer felépítése<br />
Az általunk itt kidolgozott mutagenezis rendszerrel célunk volt, hogy az IS30 transzpozáz<br />
célszekvencia specificitásának irányt szabjunk azáltal, hogy az FljA flagellin represszor<br />
(DNS-kötő) fehérjét kapcsoljuk hozzá. Ezzel egy olyan transzpozon inszerciós mutagenezis<br />
rendszert kívántunk létrehozni, amely képes az inszerciókat a fliC operátor régióra – ami az<br />
33
Change language