Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

alacsony dózisú (rövid idejő) 302nm-es UV átvilágítással (AITM-26 transzluminátor, Alpha
Innotech Corporation, USA) vizsgáltuk, majd kb 500mg mennyiségő amplikont tartalmazó
géldarabkát vágtunk ki a géllemezbıl és QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Németország)
segítségével kitisztítottuk az elegybıl a DNS-t a gyártó utasításai szerint.
A kitisztított PCR termékek nukleotid sorrendjének vizsgálatát az esetek egy részében a
MTA Szegedi Biológiai Kutató Központjában, más mintákat a gödöllıi Mezıgazdasági
Biotechnológiai Kutatóközpontban „Abi-Prism 310 genetic analyzer” (Perkin-Elmer Corp.,
Wellesley, MA, USA) automata szekvenálón végeztettük fluoreszcens alapú direkt
szekvenálással, amely során a termékeket mindkét irányban megvizsgálták. A
szekvenáláshoz használt primerek azonosak voltak az általunk a PCR reakcióban
használtakkal.
5.14. Szekvencia elemzés
A szekvenáló reakció során leolvasott nukleotid-sorrendeket BLAST homológiakeresı
program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) segítségével azonosítottuk a génbanki
vírusgenomokkal. A komplementer szál átfordításához és a két szál összehasonlításához
AlignPlus 4 (Scientific and Educational Software, Cary, NC, USA) és Clustal X (Thomson és
mtsai, 1997) programokat használtuk. Az eltérıen leolvasott nukleotidoknál a kromatográfiás
görbék egyedi ellenırzésével és összehasonlításával állapítottuk meg a helyes szekvenciát. A
szekvenált genomrészleteket a National Centre for Biotechnology Information (NCBI)
adatbankban megtalálható rokon vírusok szekvenciájával vetettük össze.
5.15. Filogenetikai vizsgálatok
A filogenetikai törzsfa létrehozásakor a Phylip v3.5 programcsomagot használtuk
(http://evolution.gnetics.washington.edu/phylip.html; Felsenstein, 1989) az egyenként 465 bp
hosszúságú nukleotid-blokkok összeállításához, a szekvencia-párok közötti távolságot
Kimura 2 paraméteres model (Kimura, 1980) segítségével határoztuk meg.
A fa megjelenítése TreeView programmal történt (Page, 1996). A genetikai rokonságot
mutató filogenetikai fa úgy van ábrázolva (rooted), hogy legısibbnek a japán referencia
törzset (NC_003790) véljük és mutatjuk. A törzsfa megbízhatóságát 1000-szer megismételt
„bootstrap” újramintázási elemzéssel igazoltuk.
39