Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

polimeráz láncreakciót Omnigene Thermal Cycler (Hybaid, USA) automata készülékben
hajtottuk végre. Minden futtatásban szerepelt negatív és pozitív kontroll is. A negatív kontroll
templát helyett kétszer desztillált vizet tartalmazott, míg pozitív kontrollnak a kereskedelmi
forgalomban használt, fertızı bronchitis vírus elleni vakcina törzset használtuk, melyet Dr.
Farsang Attila (ÁOGyTI, Budapest) volt szíves rendelkezésünkre bocsátani.
5.11. Gélelektroforézis (vizualizáció)
Vizsgálataink során a reakcióelegybıl 10µl-t trisz-borát-etilén-diamin-tetraacetát (TBE)
pufferben oldott, 0,5µg/ml etídium-bromidot tartalmazó, 1%-os, illetve a kisebb
molekulatömegő termékek esetén 2%-os agarózgélben (SeaKem® FMC BioProducts,
Rockland, Maine, USA) elektromos térben futtattunk (elektroforetizáltunk) 6-8V/cm
feszültség mellett 1 óráig. A termék méretét GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas,
Vilnius, Litvánia) DNS létrával ellenıriztük. Ezt követıen a gélt 302nm-es ultraibolya fény
(UV) átvilágítással (AITM-26 transzluminátor, Alpha Innotech Corporation, USA) vizsgáltuk
és az adatokat Kodak DS Electrophoresis Documentation and Analysis System leképezı
készüléken, a Kodak Digital Science 1D program segítségével számítógépes információ
formájában tároltuk.
5.12. A kontamináció veszélyének kivédése
PCR vizsgálatok során minden munkafázist (szervhomogenizálás, RNS kivonás, PCR
összeállítás, vizualizáció) a laboratórium elkülönülı helyiségeiben végeztünk, a mintákat
tartalmazó Eppendorf csöveket csak gumikesztyőben érintettük meg. Valamennyi PCR
reakciót, különös tekintettel a nested PCR vizsgálatokra, steril PCR munkaállomásban
mértünk össze. Minden mintánál pipetta hegyet cseréltünk, továbbá minden esetben szőrıvel
ellátott hegyet alkalmaztunk. A reverz transzkripciót és az azt követı PCR-t egylépéses kit
felhasználásával végeztük. A munkafázisok, valamint a minták feldolgozása között steril
gumikesztyőt cseréltünk a kontamináció lehetıségének minimálisra csökkentése érdekében.
5.13. Szekvenálás
A ORF1 régióhoz tapadó specifikus primerpárok által felerısített terméket (amplikont)
TBE pufferben oldott, 0,5µg/ml etídium-bromidot tartalmazó, 0,8%-os agarózgélben
(Standard Low-mr Agarose Gel, Bio-Rad, Richmond, CA, USA) elektromos térben futtattuk
(elektroforetizáltuk) 6-8 V/cm feszültség mellett kb. 3 óráig. Az amplikon helyzetét rövid,
38