Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

0,8µM-t, továbbá 2µl amplifikált terméket és 1,5U (egység) Taq DNA polimerázt
használtunk a megfelelı pufferközegben (MBI Fermentas, Vilnius, Litvánia).
Ebben a reakcióban a sokszorosítást 25 ciklusban végeztük (94°C, 30mp; 52°C 40mp;
és 72°C, 50mp). Ezután a végsı láncszintézis befejezéséhez a mintákat 5 percig 72°C-on
tartottuk. A terméket agargél-elektroforézissel tettük láthatóvá a késıbbiekben (5.11.) leírt
módszer szerint.
5.10. Az IBV kimutatására használt RT-PCR
Az „N 784” és „N 1145” primerek esetén irodalomban leírt reakció-körülményeket
alkalmaztuk. Az „avian corona f és r” primerpár esetében az alábbi leírás szerint végeztük a
vizsgálatokat.
Az RT-PCR-t ebben az esetben is a reverz transzkripció és PCR egymás utáni
elvégzésére alkalmas QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Németország)
felhasználásával „egylépéses” rendszerben végeztük.
Minden 10µl reakcióelegy 2µl ötszörös töménységő puffert, 2,5mM végsı
magnéziumklorid (MgCl2) koncentrációt, 0,4mM dezoxiribonukleotid-trifoszfát (dNTP)
keveréket, 10 egység (U = unit) ribonukleáz gátlót (Ribonuclease Inhibitor, Fermentas,
Vilnius, Litvánia), mindkét primerbıl 1µM-t, valamint 0,4µl polimeráz enzim mixet (E. coli
baktériumban expresszált Omniscript és Sensiscript reverz-transzkriptáz rekombináns
heterodimer enzimek és ugyancsak E. coli baktériumban expresszált HotStarTaq DNS
polimeráz rekombináns enzim) tartalmazott. Templát RNS-bıl minden esetben 1µl-t adtunk a
reakcióelegyhez.
A reverz transzkripció 50ºC-on 30 perc alatt játszódott le. Ezután a denaturáció
következett 95ºC-on 15 percig a reverz transzkriptázok inaktiválására, a polimeráz
láncreakcióhoz szükséges polimeráz enzim aktiválására, valamint a kezdeti nukleinsav
szétválasztásra. A PCR reakció elsı 4 ciklusában a szétválasztás 94ºC-on 40 másodperc, a
primerkapcsolódás - a specificitás növelése érdekében - 55ºC-on 50 másodperc és a
láncszintézis 72ºC-on 1 perc volt. A második rész 34 ciklusból állt, amelynek lépései a
következık voltak: a szétválasztás 94ºC-on 40 másodperc, a primerkapcsolódás 50ºC-on 50
másodperc és a láncszintézis 72ºC-on 1 perc. A kezdeti 5°C-kal magasabb tapadási
hımérséklet alkalmazása a specifikusabb primerkapcsolódást szolgálta. A leírt
primerkapcsolódási hımérséklet valamennyi primerpár esetében mőködött. A láncszintézisek
teljes befejezését 10 perces inkubációval végeztük el 72°C-on. A reverz transzkripciót és a
37