Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

5.8. ANV RT-PCR
Az RT-PCR-t a reverz transzkripció és PCR egymás utáni elvégzésére alkalmas
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) felhasználásával ún.
„egylépéses” rendszerben végeztük. Minden 50µl reakcióelegy 10µl ötszörös töménységő
puffert, 2,5mM végsı magnéziumklorid (MgCl2) koncentrációt, 0,4mM dezoxiribonukleotid-
trifoszfát (dNTP) keveréket, 20 egység (U = unit) ribonukleáz gátlót (Ribonuclease Inhibitor,
Fermentas, Vilnius, Lithuania), mindkét primerbıl 40pmol-t, valamint 2µl polimeráz enzim
mixet (Escherichia coli baktériumban expresszált Omniscript és Sensiscript reverz-
transzkriptáz rekombináns heterodimer enzimek és ugyancsak E. coli baktériumban
expresszált HotStarTaq DNS polimeráz rekombináns enzim) tartalmazott. Templát RNS-bıl
minden esetben 5µl-t adtunk a reakcióelegyhez.
A reverz transzkripció 50ºC-on 30 perc alatt játszódott le. Ezután a szétválasztás
(denaturáció) következett 95ºC-on 15 percig a reverz transzkriptáz inaktiválására, valamint a
kezdeti nukleinsav szétválasztásra. A PCR reakció 40 ciklusból állt, amelynek lépései a
következık voltak: szétválasztás 94ºC-on 40 másodperc, a primerkapcsolódás 55ºC-on 45
másodperc és a láncszintézis 72ºC-on 1 perc. A láncszintézisek teljes befejezését 10 perces
inkubációval végeztük el 72°C-on. Az ANV kimutatására alkalmazott valamennyi primerpár
esetében 55ºC-os primerkapcsolódási hımérsékletet, és azonos reakciókörülményeket
használtunk. A reverz transzkripciót és a polimeráz láncreakciót Omnigene Thermal Cycler
(Hybaid, USA) automata készülékben hajtottuk végre. Minden futtatásban szerepelt negatív
és pozitív kontroll is. A negatív kontroll templát helyett kétszer desztillált vizet tartalmazott,
míg pozitív kontrollnak a referencia törzset használtuk, melyet Dr. Palya Vilmos (CEVA-
Phylaxia, Budapest) volt szíves rendelkezésünkre bocsátani.
5.9. ANV nested PCR
A PCR reakció érzékenységének és specificitásának javítására nested PCR reakciót
dolgoztunk ki, amelyben az RT-PCR során a „Nested külsı A és B” primerekkel (4.
táblázat) kapott terméket használtuk templátként. Az RT-PCR során alkalmazott program
megegyezett a korábban (5.8.) leírtakkal, a kapott termék méretét gél-futtatással ellenıriztük
az 5.10. pontban leírtak szerint.
A második PCR-nél alkalmazott reakcióelegy 4mM dezoxiribonukleotid-trifoszfát
(dNTP) keveréket és 1,5mM MgCl2-t tartalmazott. A „Nested belsı A és B” primerekbıl
36