Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

5.7. Primertervezés
A munka során több primerpárt terveztünk és használtunk fel, a 4. táblázat és a 7. ábra
a legfontosabb jellemzıiket és az ANV genomban elfoglalt helyüket mutatja be. A
tervezéshez a Primer Designer 4 SECentral (Scientific and Educational Software Cary, NC,
USA) illetve a Primer 2.0 programot használtuk. A primereket a Mezıgazdasági
Biotechnológiai Kutatóközpont (Gödöllı) szintetizálta. A primerpárok alkalmasak voltak
diagnosztikai vizsgálatok megerısítésére és filogenetikai elemzésekre is. A nested PCR-hez
két, az ORF1-re tervezett primerpárt állítottunk össze, hogy a primerek a konzervatív
szakaszon megtapadva biztosan eredményezzenek terméket. A diagnosztikai kimutatásra
használt primerek, amelyek a filogenetikai vizsgálatok alapját adták, szintén az ORF1-en
helyezıdtek el, ugyanis az ORF2-re tervezett primerpárok – feltehetıen a strukturális
fehérjék nagy változékonysága miatt – nem adtak PCR terméket. Az ORF2, illetve a teljes
genom vizsgálatára további primerpárokat terveztünk.
4. táblázat: Az ANV kimutatására tervezett primerek helyezıdése
Neve Szekvenciája Helye* Termék
„Nested külsı A”
„Nested külsı B”
„Nested belsı A”
„Nested belsı B”
Fa-primer A
Fa-primer B
ORF2 - F
ORF2 - R
5'-TGCCTGGTCCATAATGTTAC-3'
5'-AATCTCATCAGCGAGGTCTT-3'
5'-CGGCTTCCGTTATCTAACTG-3'
5'-GAGAACCTTGGCTTGAGATG-3'
5'-AGA TAC GCT TGC TCG TCT TG-3'
5'-CCT CTA ACC GGC GAT ATT CT-3'
5’-CCA GCT CAC AAG CGA GTT AC-3’
5’-CTG TGC CTC CAG TAT TGA AG-3’
34
1213-1232
2010-2029
1327-1346
1632-1651
1678-1697
2266-2285
5945-5964
6334-6353
hossza
816bp
324bp
607bp
408bp
*A megadott számok az ANV referencia törzs génbankban megtalálható (NC_003790)
genom szekvenciájára utalnak
Az IBV fertızés megerısítésre vagy kizárására elıször az irodalomban leírt
diagnosztikai primerpárokat és reakció körülményeket (Farsang és mtsai, 2002), majd saját