Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...
Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...
Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
5.4. Bakteriológiai vizsgálat<br />
A hullák májából és vékonybelébıl rutin bakteriológiai vizsgálatot végeztünk, melynek<br />
során véres- és Drigalski-agarra szélesztettünk a vizsgálni kívánt szervekbıl. A táptalajokat<br />
24 órán keresztül 37ºC-on inkubáltuk aerob körülmények között.<br />
5.5. Transzmissziós elektronmikroszkópos morfológiai vizsgálat<br />
Az általunk diagnosztikai célból frissen elvéreztetett állatokból 1mm 3 mérető<br />
vesedarabkákat 24 órán át 4ºC-on 4%-os pufferolt paraformaldehid oldatban fixáltunk. A<br />
mintákat tartósítás után 1% ozmium-tetroxiddal kezeltük. A fixált mintákat felszálló etil-<br />
alkohol sorban dehidráltuk, majd szintetikus rezinbe (Durcupan ACM, Fluka, Switzerland)<br />
ágyaztuk be. Ultravékony metszeteket vágtunk belılük, majd uranil-acetáttal és ólom-citráttal<br />
kontrasztfestést végeztünk és az így elıkészített metszeteket transzmissziós<br />
elektronmikroszkóppal vizsgáltuk (JEM 1011, JEOL Ltd., Tokyo, Japán).<br />
5.6. Vírus RNS tisztítása<br />
A mélyfagyasztott szövetmintákat kiolvasztottuk, majd apró darabokra vágtuk a<br />
szervrészeket. A kb. rizsszemnyi szövetdarabokat steril porcelán dörzscsészében és steril<br />
homok hozzáadásával homogenizáltuk. A szövetek pépesítése után 1,5ml steril foszfáttal<br />
pufferolt fiziológiás sóoldatot (phosphate-buffered saline, PBS) adtunk a mintához,<br />
Eppendorf csıbe öntöttük és 6000*g szöggyorsulással 10 percig centrifugáltuk a sejttörmelék<br />
leülepítése érdekében. A centrifugált minta felülúszóját használtuk vírusizolálás céljára.<br />
A kórokozó genetikai anyagának tisztításához a QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen,<br />
GmbH, Hilden, Németország) RNS tisztító készletet használtuk a gyártó utasításai szerint<br />
(Nakazato és Edmonds, 1972). Röviden: 140µl vírusszuszpenziót adtunk 560µl<br />
lízispufferhez, amely hordozó RNS-t (carrier RNA) is tartalmazott egy 1,5ml-es Eppendorf<br />
csıben. Vortex segítségével megkevertük az oldatot, majd 10 percig szobahımérsékleten<br />
inkubáltuk. Feltárás után 560µl abszolút etanolt adtunk az elegyhez, majd az alkoholos<br />
kicsapást követıen a mintát szilikagél membránra adszorbeáltuk úgy, hogy a kapott oldat<br />
felét centrifugálható, szőrıvel ellátott oszlopra mértük és 6000*g szöggyorsulással egy percig<br />
centrifugáltuk. A lecsepegett folyadékot eltávolítottuk, a maradék oldatot is a szőrıre mértük,<br />
majd ismét centrifugáltuk a mintát. Ezután különbözı etanol tartalmú mosóoldattal<br />
eltávolítottuk a szennyezı elemeket, és a kötıdött RNS-t 60µl eluáló pufferrel leoldottuk az<br />
adszorbensrıl.<br />
33