Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

5.4. Bakteriológiai vizsgálat
A hullák májából és vékonybelébıl rutin bakteriológiai vizsgálatot végeztünk, melynek
során véres- és Drigalski-agarra szélesztettünk a vizsgálni kívánt szervekbıl. A táptalajokat
24 órán keresztül 37ºC-on inkubáltuk aerob körülmények között.
5.5. Transzmissziós elektronmikroszkópos morfológiai vizsgálat
Az általunk diagnosztikai célból frissen elvéreztetett állatokból 1mm 3 mérető
vesedarabkákat 24 órán át 4ºC-on 4%-os pufferolt paraformaldehid oldatban fixáltunk. A
mintákat tartósítás után 1% ozmium-tetroxiddal kezeltük. A fixált mintákat felszálló etil-
alkohol sorban dehidráltuk, majd szintetikus rezinbe (Durcupan ACM, Fluka, Switzerland)
ágyaztuk be. Ultravékony metszeteket vágtunk belılük, majd uranil-acetáttal és ólom-citráttal
kontrasztfestést végeztünk és az így elıkészített metszeteket transzmissziós
elektronmikroszkóppal vizsgáltuk (JEM 1011, JEOL Ltd., Tokyo, Japán).
5.6. Vírus RNS tisztítása
A mélyfagyasztott szövetmintákat kiolvasztottuk, majd apró darabokra vágtuk a
szervrészeket. A kb. rizsszemnyi szövetdarabokat steril porcelán dörzscsészében és steril
homok hozzáadásával homogenizáltuk. A szövetek pépesítése után 1,5ml steril foszfáttal
pufferolt fiziológiás sóoldatot (phosphate-buffered saline, PBS) adtunk a mintához,
Eppendorf csıbe öntöttük és 6000*g szöggyorsulással 10 percig centrifugáltuk a sejttörmelék
leülepítése érdekében. A centrifugált minta felülúszóját használtuk vírusizolálás céljára.
A kórokozó genetikai anyagának tisztításához a QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen,
GmbH, Hilden, Németország) RNS tisztító készletet használtuk a gyártó utasításai szerint
(Nakazato és Edmonds, 1972). Röviden: 140µl vírusszuszpenziót adtunk 560µl
lízispufferhez, amely hordozó RNS-t (carrier RNA) is tartalmazott egy 1,5ml-es Eppendorf
csıben. Vortex segítségével megkevertük az oldatot, majd 10 percig szobahımérsékleten
inkubáltuk. Feltárás után 560µl abszolút etanolt adtunk az elegyhez, majd az alkoholos
kicsapást követıen a mintát szilikagél membránra adszorbeáltuk úgy, hogy a kapott oldat
felét centrifugálható, szőrıvel ellátott oszlopra mértük és 6000*g szöggyorsulással egy percig
centrifugáltuk. A lecsepegett folyadékot eltávolítottuk, a maradék oldatot is a szőrıre mértük,
majd ismét centrifugáltuk a mintát. Ezután különbözı etanol tartalmú mosóoldattal
eltávolítottuk a szennyezı elemeket, és a kötıdött RNS-t 60µl eluáló pufferrel leoldottuk az
adszorbensrıl.
33