Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

Mivel a DNS-fragmentum mennyisége minden egyes lépésben megkétszerezıdik, az
amplifikáció exponenciális. E három lépésbıl (denaturálás vagy szétválasztás,
primerkapcsolódás, láncszintézis) álló ciklus nagyszámú (kb. 30-szoros) ismétlése
eredményeként vizuálisan értékelhetı mennyiségő specifikus DNS keletkezik, amelyet
gélben elektroforetizálva választunk el a fel nem használt primerektıl és szabad
nukleotidoktól, majd etídium-bromid jelöléssel teszünk láthatóvá.
A PCR kivitelezése során a reakció valamennyi komponensét (templát DNS, primerek,
polimeráz enzim, nukleotidok) összemérjük, a ciklusok pontos végrehajtásáról automata
gondoskodik. Egy-egy reakciólépés ideje 1-2 perc, így a teljes mővelet csak néhány órát vesz
igénybe. A megsokszorozott DNS-fragmentumot számos további molekuláris biológiai
technikával vizsgálhatjuk. A betegségekért felelıs kórokozók, vagy génmutációk
felismerésére, DNS-szintő diagnosztikájára is lehetıség kínálkozik (Reiss, 1991; Kiss és
mtsai, 1997; Towsend és mtsai, 1998).
4.9. Egyes PCR technikák és nukleinsavvizsgáló módszerek rövid leírása
Polimeráz láncreakció (PCR): A fentiekben leírt (4.8.) PCR technika olyan in vitro
nukleinsav sokszorozó eljárás, melynek specificitását és érzékenységét a reakcióban
alkalmazott, rövid, általában 18-25 bázispár hosszúságú oligonukleotid primerek biztosítják
(Mullis és mtsai, 1992). A PCR technika lehetıvé teszi fixált szövetminták vizsgálatát is, ami
az elváltozások retrospektív értékelésére is alkalmas, így a betegségek akár több évre
visszamenıen nyomon követhetıvé válnak (Singh és mtsai, 2005). Az eredmények
értékelésénél figyelembe kell venni a DNS lehetséges károsodását és lebomlását. Mai
tudásunk szerint a 200 bázis-párnál hosszabb DNS szakaszok néhány évig maradnak egyben,
ezért nagy szakaszokat közrefogó primerek használatát retrospektív vizsgálatok esetén
kerülni kell (McOrist és mtsai, 1994).
Az eredetileg kifejlesztett PCR technika alapján a kutatási igényeknek megfelelıen a
módszert továbbfejlesztették, és számos változatát dolgozták ki, melyek közül legtöbbet a
diagnosztikában is rendszeresen alkalmaznak (Belák és Ballagi-Pordány, 1993; Loda és
DeLellis, 1994; Biksi és mtsai, 1998). Ezek nagyobb részét PhD munkám során alkalmaztam,
ezért célszerőnek látom rövid ismertetésüket.
RT-PCR: A mintából kivont RNS-t reverz transzkriptáz enzim segítségével átalakítjuk
komplementer cDNS-sé, és ez utóbbit használjuk fel a PCR-ben templátként. RNS-vírusok
29