Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...
Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...
Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Mivel a DNS-fragmentum mennyisége minden egyes lépésben megkétszerezıdik, az<br />
amplifikáció exponenciális. E három lépésbıl (denaturálás vagy szétválasztás,<br />
primerkapcsolódás, láncszintézis) álló ciklus nagyszámú (kb. 30-szoros) ismétlése<br />
eredményeként vizuálisan értékelhetı mennyiségő specifikus DNS keletkezik, amelyet<br />
gélben elektroforetizálva választunk el a fel nem használt primerektıl és szabad<br />
nukleotidoktól, majd etídium-bromid jelöléssel teszünk láthatóvá.<br />
A PCR kivitelezése során a reakció valamennyi komponensét (templát DNS, primerek,<br />
polimeráz enzim, nukleotidok) összemérjük, a ciklusok pontos végrehajtásáról automata<br />
gondoskodik. Egy-egy reakciólépés ideje 1-2 perc, így a teljes mővelet csak néhány órát vesz<br />
igénybe. A megsokszorozott DNS-fragmentumot számos további molekuláris biológiai<br />
technikával vizsgálhatjuk. A betegségekért felelıs kórokozók, vagy génmutációk<br />
felismerésére, DNS-szintő diagnosztikájára is lehetıség kínálkozik (Reiss, 1991; Kiss és<br />
mtsai, 1997; Towsend és mtsai, 1998).<br />
4.9. Egyes PCR technikák és nukleinsavvizsgáló módszerek rövid leírása<br />
Polimeráz láncreakció (PCR): A fentiekben leírt (4.8.) PCR technika olyan in vitro<br />
nukleinsav sokszorozó eljárás, melynek specificitását és érzékenységét a reakcióban<br />
alkalmazott, rövid, általában 18-25 bázispár hosszúságú oligonukleotid primerek biztosítják<br />
(Mullis és mtsai, 1992). A PCR technika lehetıvé teszi fixált szövetminták vizsgálatát is, ami<br />
az elváltozások retrospektív értékelésére is alkalmas, így a betegségek akár több évre<br />
visszamenıen nyomon követhetıvé válnak (Singh és mtsai, 2005). Az eredmények<br />
értékelésénél figyelembe kell venni a DNS lehetséges károsodását és lebomlását. Mai<br />
tudásunk szerint a 200 bázis-párnál hosszabb DNS szakaszok néhány évig maradnak egyben,<br />
ezért nagy szakaszokat közrefogó primerek használatát retrospektív vizsgálatok esetén<br />
kerülni kell (McOrist és mtsai, 1994).<br />
Az eredetileg kifejlesztett PCR technika alapján a kutatási igényeknek megfelelıen a<br />
módszert továbbfejlesztették, és számos változatát dolgozták ki, melyek közül legtöbbet a<br />
diagnosztikában is rendszeresen alkalmaznak (Belák és Ballagi-Pordány, 1993; Loda és<br />
DeLellis, 1994; Biksi és mtsai, 1998). Ezek nagyobb részét PhD munkám során alkalmaztam,<br />
ezért célszerőnek látom rövid ismertetésüket.<br />
RT-PCR: A mintából kivont RNS-t reverz transzkriptáz enzim segítségével átalakítjuk<br />
komplementer cDNS-sé, és ez utóbbit használjuk fel a PCR-ben templátként. RNS-vírusok<br />
29