Mándoki - Állatorvostudományi Doktori Iskola - Szent István ...

vizsgálati módszerré vált, és így elınyeit nem szabad figyelmen kívül hagyni. Ezek az
elınyök a következık:
- Rendkívül gyors, vagyis beállított, mőködı rendszerek mellett a minta-elıkészítés, a
tényleges vizsgálat és a vizualizáció folyamata néhány órán belül eredményt ad. A
módszertıl függıen a diagnosztikában elsıdleges „igen - nem” (fertızött - nem fertızött)
válasz mellett a vizsgálat bizonyos kórokozók esetében még tipizálásra is képes.
- Mindemellett érzékeny is, hiszen akár már 5-10 kópiát is képes kimutatni a keresett
nukleinsavból. Tisztában kell lennünk emellett azzal is, hogy ez az érzékenység még hátrányt
is jelenthet a pozitív eredmény megállapítása és a tényleges kórkép kialakulása közötti
összefüggés mérlegelésekor. Ugyanis gyakran a PCR pozitivitás nem jelenti egyértelmően a
tünetek kialakulásával kísért megbetegedés megjelenését, mivel ez utalhat akár rövid idıvel a
mintavétel elıtt végzett állatorvosi preventív tevékenységre (vakcinázásra) is.
A primertervezés, a PCR vizsgálatok, a klónozás és a többi molekuláris biológiai
módszer, valamint az elımunkálatok és eredményértékelés elvégzéséhez egyre jobb
szoftverek, vegyszerek, sıt kitek kaphatók megkönnyítve ezzel a kutató és a diagnoszta
munkáját, nem is említve az interneten fellelhetı hatalmas adatmennyiséget.
A feladat elvégzéséhez a kórokozó - szerencsés esetben a génbankban rendelkezésre
álló - szekvenciája alapján olyan genomszakaszt kell keresni, amely specifikus a kórokozóra,
ugyanakkor nincs jelen az adott állatfaj genomjában. A választás során mindenképpen
figyelembe kell venni, hogy a kiválasztott szekvencia megfelelı konzervativitással
rendelkezzen, hogy az esetleges mutációk ellenére az adott kórokozó genotípusainak széles
skáláját ki tudja mutatni. Mindezek a munkálatok fıként irodalomkutatásra és számítógépes
összehasonlító vizsgálatokra alapozódnak. Majd sor kerül a primerek szintetizáltatására és az
optimális reakciókörülmények kidolgozására. A pozitív kontroll minta többféle módon
elıállítható: természetes esetbıl, ha a kiválasztott régióból származó termék szekvenálásával
igazolást nyer a genom nagymértékő hasonlósága vagy egyezése, a referencia törzs
felhasználásával, illetve pl. szövettenyészeten izolált vírus pozitív kontrollként való
alkalmazásával. A pozitív PCR termékeket agaróz-gél elektroforézissel mutatjuk ki. A pozitív
kontrollal azonos mérettartományban futó DNS darabkákat például szekvenálással lehet
félreérthetetlenül azonosítani a téves diagnózis elkerülése érdekében.
A PCR alapú diagnosztikai módszerek felhasználását baromfiállományokban a kedvezı
költség/haszon-elemzés is támogatja. Bár a polimeráz láncreakció kivitelezése fejlett
10