1 Gyors-kinetika módszerek A módszerek jelentősége Milyen ...

Gyors-kinetika módszerek
2009. március 9.
Nyitrai Miklós
Milyen módszerekről tanulunk?
-„stopped-flow” vagy megállított áramlású reaktor
-„surface plasmon resonance” vagy felületi plazmon
rezonancia
-„flash photolysis” vagy villanófény fotolízis
-…módszerek és alkalmazásaik.
A reakciókinetikai mérési módszerek
jellemző időfelbontása
„lombik-reakció”
megállított áramlás
(stopped flow)
villanófény-fotolízis
(flash photolysis)
fotonszámlálás
(photon counting)
10 0 10 -3 10 -6 10 -9 10 -12
s ms μs ns ps
Forrás: Keszei Ernő előadásanyaga
A módszerek jelentősége
A biológiai mechanizmusok megértése;
Biológiai folyamatok időskálája;
A ms skálán való mérések.
A módszerek közös
tulajdonsága
Alkalmasak gyors, pl. a milliszekundumos
időskálán lezajló folyamatok követésére.
Kulcsszavak
stopped flow vagy stopped-flow,
gyorskinetikai mérés,
abszorpció, fluoreszcencia,
fecskendő, mixer (keverő),
vizsgálati cella,
reakció, reagens, oldat
sebességi állandó
Vándorló melanocita (Victor SMALL).
1

„A”
dugattyú
Megállított áramlású reaktor
(„stopped-flow”)
2. lépés: az áramlások megállítása
Fényforrás
Keverő
A dugattyúk vezérlése
Miért ez a neve?
Hogyan működik?
Milyen alkalmazásai vannak?
1. lépés: a folyadékok áramoltatása
Fényforrás
„A”
dugattyú
Keverő
http://www.photophysics.com/sx20.php A dugattyúk vezérlése
t = 0 időpont
Mérőcella
A folyamat egybenpl.
fluoreszcencia vagy fény
szórás
Fényforrás
„A”
dugattyú
Keverő
A reakció elkezdődik
Mérőcella
„B”
dugattyú
„B”
dugattyú
„STOP”
dugattyú
STOP jel
„STOP”
dugattyú
Megállító
érzékelő
A dugattyúk megállnak! vezérlése
Nagy nyomás vagy léptető motor Megállító
STOP!!!
érzékelő
Fényforrás
„A”
dugattyú
Mérőcella
Nagy nyomás vagy léptető motor
pl. fluoreszcencia vagy fény
szórás
Keverő
A dugattyúk vezérlése
Mérőcella
„B”
dugattyú
„B”
dugattyú
pl. abszorbció A holtidő fogalma és
jelentősége
„STOP”
dugattyú
pl. abszorbció
„STOP”
dugattyú
Megállító
érzékelő
3. lépés: a kinetikai mérés
A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés
kezdete között eltelt idő.
Tipikusan 0,5-1 ms.
2

Termosztált
A megállított áramlású reaktor
alkalmazásai
Kötődési és disszociációs kinetika vizsgálata
fehérje-fehérje, vagy fehérje-ligandum
kölcsönhatások esetében.
Vizsgálati tér
Abszorpció és
Fluoreszcencia (anizotrópia) mérés
Villanófény fotolízis
Hasonlóan az előbbiekhez, itt is a nulla időpont
definiálása a kritikus.
Mit mérünk?
Egy alkalmas spektroszkópiai jelet.
Feltétel: változzon a reakció során!
A szokásos spektroszkópiai jelek:
-Fluoreszcencia intenzitás
-Abszorbció
-Fényszórás
Fecskendők és keverés
A módszer alapelve
Alapállapotban nem reagáló, passzív szubsztrát
alkalmazása;
A szubsztrát fénnyel aktiválható;
Lézer villanással aktiváljuk;
Mérjük a létrejövő folyamat kinetikáját.
A
B
A
A
B
A
B
B
3

Lézer
villanás!
A
B
Az alkalmazás alapelve
Partner A, aktív
Partner Partner B A, is passzív aktív
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg
üveg
Polarizált fény
Megvilágítás
Nincs Létrejön reakció!! a reakció!!
A
B
A
A működés alapelve
A
B
Áramlási cella
A
B
B
Visszavert fény
Partner B
Partner A
Detektálás
Milyen hatások befolyásolják a szöget?
Felületi plazmon rezonancia
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg
üveg
Polarizált fény
A szenzogram
üveg
Az elhajlás szöge függ:
1) A hullámhossztól.
2) A hőmérséklettől.
fény
3) A törésmutatótól. Polarizált
rezonancia jel
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg
II.
I.
idő
intenzitás
Rezonancia jel
(kRU)
kötődés disszoc.
konc.
0 2 4 6 8 1
0
E
Visszavert fény
regenerálás
Idő
(perc)
Intenzitás csökkenés!
I. II.
szög
Visszavert fény
II.
I.
A kötődés
hatására
módosul.
4

Rezonancia jel
A módszer jellemzői, előnyei
A vizsgált fehérjék, peptidek, lipidek,
hatóanyagok jellemzése jelölés nélkül.
Valós időben követhetőek a folyamatok.
Kis mintaméretek, chip alapú alkalmazás.
Összetett folyamatok vizsgálata
kötődés disszociáció
konc.
0 2 4 6 8 10
A mérés elrendezése
regenerálás
Idő
(perc)
Immobilizálás
a) Közvetlenül a molekula felülethez kapcsolása
(direkt);
b) Egy közvetítő kötődő molekula immobilizálása
(indirekt).
a b
Alkalmazások
-affinitások meghatározása (KA vagy KD );
-kinetikai mérések (kassz vagy kdissz );
-hatóanyag specificitás vizsgálata;
-kötődő komponensek izolálása keverékből;
-fehérjék, peptidek, lipidek kötődésének vizsgálata.
Folyamatok rendűsége és a
molekularitás kapcsolata
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
5

Nulladrendű reakció
A reakció kezdeti időpontjában (t 0 ) a kiindulási anyag (A)
koncentrációja c Ao = konstans, a terméké (c B ) pedig nulla,
vagyis:
A nulladrendű reakcióban a komponensek koncentrációja lineárisan
változik az idő függvényében (kiindulási anyag, termék).
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
Másodrendű reakció
A másodrendű reakcióban a komponensek koncentrációja hiperbola
függvény szerint változik az idő függvényében (kiindulási anyag, termék).
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
A gyors-kinetikai módszere
alkalmazásai
-Megállított áramlású reaktor
-Villanófény fotolízis
Elsőrendű reakció
Az elsőrendű reakcióban a komponensek koncentrációja
exponenciálisan változik az idő függvényében (kiindulási anyag, termék).
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g
Energetika
Az eredményes ütközéshez
a molekuláknak aktív
állapotba kell jutni,
többletenergiával kell
rendelkezni.
A küszöbenergia és az
átlagos energia közötti
különbség az aktiválási
energia.
fluoreszcencia intenzitás
Példa az alkalmazásra 1.
sebességi állandó (s -1 )
idő (s) ATP (microM)
A kagylóból származó miozin kölcsönhatása ATP-vel.
amplitúdó (%)
6

Példa az alkalmazásra 2.
Emlős izom miozin izoformák vizsgálata
villanófény fotolízis módszer segítségével.
Az izom ‘szabályozásának’
egyébb módjai
A kinetikai paraméterek és a
testméret összefüggései
V 0 x 10 6 m/s)
8
6
4
Mouse IIB
Rat IIB
Rab IIX
Rat IIX
2
Pig IIA
Rat soleus
Rab I
Pig I
0
0 200 400 600 800
K AD (μM)
Mi történik, ha
úttorlaszt emelünk a
kinezin elé?
A miozin nehézlánc izoformák
•MyHC-β (sziv) ≡ MyHC-I
•MyHC-IIa
•MyHC-IIb
•MyHC-IIx/d
Példa az alkalmazásra 3.
Flash-photolysis, vagy villanófény fotolízis mérések
A kinezinek vizsgálata
Általában: hogyan válik le a kinezin a
mikrotubulusokról?
M-K
M-K.ATP
M-K.ADP.P i
M-K.ADP
M-K
M-K.ADP.P i
M+K.ADP
?
7

T
ATP binding
to the trailing
head triggers
the binding of
the leading
head to MT
D
T
MT
The trailing head hydrolyses the
ATP, dissociate from MT and
become the leading head
D
Mesterséges úttorlasz: a T93N mutáns!
D
MT
Következtetés
?
T93N T93N
Ha úttorlaszt emelünk a kinezin elé, leválik a
ikrotubulusról.
D
k (s -1 )
k (s-1)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
K340, ATP
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
K430, ATP
[ATP] (μM)
k3tmeas
k3tcor
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
D
T
[ADP] (μM)
ATP
Kinetikai mérések
ATP
MT
D
T93N
MT
kobs
kcor
P i
k (s -1 )
k (s -1 )
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
K340, ADP
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
K430, ADP
[ADP] (μM)
ADP
kobs
kcor
kobs
kcor
ADP
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
[ADP] (μM)
D
D
T93N
D
8