1 Gyors-kinetika módszerek A módszerek jelentősége Milyen ...
1 Gyors-kinetika módszerek A módszerek jelentősége Milyen ...
1 Gyors-kinetika módszerek A módszerek jelentősége Milyen ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Gyors</strong>-<strong>kinetika</strong> <strong>módszerek</strong><br />
2009. március 9.<br />
Nyitrai Miklós<br />
<strong>Milyen</strong> <strong>módszerek</strong>ről tanulunk?<br />
-„stopped-flow” vagy megállított áramlású reaktor<br />
-„surface plasmon resonance” vagy felületi plazmon<br />
rezonancia<br />
-„flash photolysis” vagy villanófény fotolízis<br />
-…<strong>módszerek</strong> és alkalmazásaik.<br />
A reakció<strong>kinetika</strong>i mérési <strong>módszerek</strong><br />
jellemző időfelbontása<br />
„lombik-reakció”<br />
megállított áramlás<br />
(stopped flow)<br />
villanófény-fotolízis<br />
(flash photolysis)<br />
fotonszámlálás<br />
(photon counting)<br />
10 0 10 -3 10 -6 10 -9 10 -12<br />
s ms μs ns ps<br />
Forrás: Keszei Ernő előadásanyaga<br />
A <strong>módszerek</strong> <strong>jelentősége</strong><br />
A biológiai mechanizmusok megértése;<br />
Biológiai folyamatok időskálája;<br />
A ms skálán való mérések.<br />
A <strong>módszerek</strong> közös<br />
tulajdonsága<br />
Alkalmasak gyors, pl. a milliszekundumos<br />
időskálán lezajló folyamatok követésére.<br />
Kulcsszavak<br />
stopped flow vagy stopped-flow,<br />
gyors<strong>kinetika</strong>i mérés,<br />
abszorpció, fluoreszcencia,<br />
fecskendő, mixer (keverő),<br />
vizsgálati cella,<br />
reakció, reagens, oldat<br />
sebességi állandó<br />
Vándorló melanocita (Victor SMALL).<br />
1
„A”<br />
dugattyú<br />
Megállított áramlású reaktor<br />
(„stopped-flow”)<br />
2. lépés: az áramlások megállítása<br />
Fényforrás<br />
Keverő<br />
A dugattyúk vezérlése<br />
Miért ez a neve?<br />
Hogyan működik?<br />
<strong>Milyen</strong> alkalmazásai vannak?<br />
1. lépés: a folyadékok áramoltatása<br />
Fényforrás<br />
„A”<br />
dugattyú<br />
Keverő<br />
http://www.photophysics.com/sx20.php A dugattyúk vezérlése<br />
t = 0 időpont<br />
Mérőcella<br />
A folyamat egybenpl.<br />
fluoreszcencia vagy fény<br />
szórás<br />
Fényforrás<br />
„A”<br />
dugattyú<br />
Keverő<br />
A reakció elkezdődik<br />
Mérőcella<br />
„B”<br />
dugattyú<br />
„B”<br />
dugattyú<br />
„STOP”<br />
dugattyú<br />
STOP jel<br />
„STOP”<br />
dugattyú<br />
Megállító<br />
érzékelő<br />
A dugattyúk megállnak! vezérlése<br />
Nagy nyomás vagy léptető motor Megállító<br />
STOP!!!<br />
érzékelő<br />
Fényforrás<br />
„A”<br />
dugattyú<br />
Mérőcella<br />
Nagy nyomás vagy léptető motor<br />
pl. fluoreszcencia vagy fény<br />
szórás<br />
Keverő<br />
A dugattyúk vezérlése<br />
Mérőcella<br />
„B”<br />
dugattyú<br />
„B”<br />
dugattyú<br />
pl. abszorbció A holtidő fogalma és<br />
<strong>jelentősége</strong><br />
„STOP”<br />
dugattyú<br />
pl. abszorbció<br />
„STOP”<br />
dugattyú<br />
Megállító<br />
érzékelő<br />
3. lépés: a <strong>kinetika</strong>i mérés<br />
A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés<br />
kezdete között eltelt idő.<br />
Tipikusan 0,5-1 ms.<br />
2
Termosztált<br />
A megállított áramlású reaktor<br />
alkalmazásai<br />
Kötődési és disszociációs <strong>kinetika</strong> vizsgálata<br />
fehérje-fehérje, vagy fehérje-ligandum<br />
kölcsönhatások esetében.<br />
Vizsgálati tér<br />
Abszorpció és<br />
Fluoreszcencia (anizotrópia) mérés<br />
Villanófény fotolízis<br />
Hasonlóan az előbbiekhez, itt is a nulla időpont<br />
definiálása a kritikus.<br />
Mit mérünk?<br />
Egy alkalmas spektroszkópiai jelet.<br />
Feltétel: változzon a reakció során!<br />
A szokásos spektroszkópiai jelek:<br />
-Fluoreszcencia intenzitás<br />
-Abszorbció<br />
-Fényszórás<br />
Fecskendők és keverés<br />
A módszer alapelve<br />
Alapállapotban nem reagáló, passzív szubsztrát<br />
alkalmazása;<br />
A szubsztrát fénnyel aktiválható;<br />
Lézer villanással aktiváljuk;<br />
Mérjük a létrejövő folyamat kinetikáját.<br />
A<br />
B<br />
A<br />
A<br />
B<br />
A<br />
B<br />
B<br />
3
Lézer<br />
villanás!<br />
A<br />
B<br />
Az alkalmazás alapelve<br />
Partner A, aktív<br />
Partner Partner B A, is passzív aktív<br />
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg<br />
üveg<br />
Polarizált fény<br />
Megvilágítás<br />
Nincs Létrejön reakció!! a reakció!!<br />
A<br />
B<br />
A<br />
A működés alapelve<br />
A<br />
B<br />
Áramlási cella<br />
A<br />
B<br />
B<br />
Visszavert fény<br />
Partner B<br />
Partner A<br />
Detektálás<br />
<strong>Milyen</strong> hatások befolyásolják a szöget?<br />
Felületi plazmon rezonancia<br />
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg<br />
üveg<br />
Polarizált fény<br />
A szenzogram<br />
üveg<br />
Az elhajlás szöge függ:<br />
1) A hullámhossztól.<br />
2) A hőmérséklettől.<br />
fény<br />
3) A törésmutatótól. Polarizált<br />
rezonancia jel<br />
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg<br />
II.<br />
I.<br />
idő<br />
intenzitás<br />
Rezonancia jel<br />
(kRU)<br />
kötődés disszoc.<br />
konc.<br />
0 2 4 6 8 1<br />
0<br />
E<br />
Visszavert fény<br />
regenerálás<br />
Idő<br />
(perc)<br />
Intenzitás csökkenés!<br />
I. II.<br />
szög<br />
Visszavert fény<br />
II.<br />
I.<br />
A kötődés<br />
hatására<br />
módosul.<br />
4
Rezonancia jel<br />
A módszer jellemzői, előnyei<br />
A vizsgált fehérjék, peptidek, lipidek,<br />
hatóanyagok jellemzése jelölés nélkül.<br />
Valós időben követhetőek a folyamatok.<br />
Kis mintaméretek, chip alapú alkalmazás.<br />
Összetett folyamatok vizsgálata<br />
kötődés disszociáció<br />
konc.<br />
0 2 4 6 8 10<br />
A mérés elrendezése<br />
regenerálás<br />
Idő<br />
(perc)<br />
Immobilizálás<br />
a) Közvetlenül a molekula felülethez kapcsolása<br />
(direkt);<br />
b) Egy közvetítő kötődő molekula immobilizálása<br />
(indirekt).<br />
a b<br />
Alkalmazások<br />
-affinitások meghatározása (KA vagy KD );<br />
-<strong>kinetika</strong>i mérések (kassz vagy kdissz );<br />
-hatóanyag specificitás vizsgálata;<br />
-kötődő komponensek izolálása keverékből;<br />
-fehérjék, peptidek, lipidek kötődésének vizsgálata.<br />
Folyamatok rendűsége és a<br />
molekularitás kapcsolata<br />
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g<br />
5
Nulladrendű reakció<br />
A reakció kezdeti időpontjában (t 0 ) a kiindulási anyag (A)<br />
koncentrációja c Ao = konstans, a terméké (c B ) pedig nulla,<br />
vagyis:<br />
A nulladrendű reakcióban a komponensek koncentrációja lineárisan<br />
változik az idő függvényében (kiindulási anyag, termék).<br />
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g<br />
Másodrendű reakció<br />
A másodrendű reakcióban a komponensek koncentrációja hiperbola<br />
függvény szerint változik az idő függvényében (kiindulási anyag, termék).<br />
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g<br />
A gyors-<strong>kinetika</strong>i módszere<br />
alkalmazásai<br />
-Megállított áramlású reaktor<br />
-Villanófény fotolízis<br />
Elsőrendű reakció<br />
Az elsőrendű reakcióban a komponensek koncentrációja<br />
exponenciálisan változik az idő függvényében (kiindulási anyag, termék).<br />
http://hu.wikipedia.org/wiki/Reakci%C3%B3sebess%C3%A9g<br />
Energetika<br />
Az eredményes ütközéshez<br />
a molekuláknak aktív<br />
állapotba kell jutni,<br />
többletenergiával kell<br />
rendelkezni.<br />
A küszöbenergia és az<br />
átlagos energia közötti<br />
különbség az aktiválási<br />
energia.<br />
fluoreszcencia intenzitás<br />
Példa az alkalmazásra 1.<br />
sebességi állandó (s -1 )<br />
idő (s) ATP (microM)<br />
A kagylóból származó miozin kölcsönhatása ATP-vel.<br />
amplitúdó (%)<br />
6
Példa az alkalmazásra 2.<br />
Emlős izom miozin izoformák vizsgálata<br />
villanófény fotolízis módszer segítségével.<br />
Az izom ‘szabályozásának’<br />
egyébb módjai<br />
A <strong>kinetika</strong>i paraméterek és a<br />
testméret összefüggései<br />
V 0 x 10 6 m/s)<br />
8<br />
6<br />
4<br />
Mouse IIB<br />
Rat IIB<br />
Rab IIX<br />
Rat IIX<br />
2<br />
Pig IIA<br />
Rat soleus<br />
Rab I<br />
Pig I<br />
0<br />
0 200 400 600 800<br />
K AD (μM)<br />
Mi történik, ha<br />
úttorlaszt emelünk a<br />
kinezin elé?<br />
A miozin nehézlánc izoformák<br />
•MyHC-β (sziv) ≡ MyHC-I<br />
•MyHC-IIa<br />
•MyHC-IIb<br />
•MyHC-IIx/d<br />
Példa az alkalmazásra 3.<br />
Flash-photolysis, vagy villanófény fotolízis mérések<br />
A kinezinek vizsgálata<br />
Általában: hogyan válik le a kinezin a<br />
mikrotubulusokról?<br />
M-K<br />
M-K.ATP<br />
M-K.ADP.P i<br />
M-K.ADP<br />
M-K<br />
M-K.ADP.P i<br />
M+K.ADP<br />
?<br />
7
T<br />
ATP binding<br />
to the trailing<br />
head triggers<br />
the binding of<br />
the leading<br />
head to MT<br />
D<br />
T<br />
MT<br />
The trailing head hydrolyses the<br />
ATP, dissociate from MT and<br />
become the leading head<br />
D<br />
Mesterséges úttorlasz: a T93N mutáns!<br />
D<br />
MT<br />
Következtetés<br />
?<br />
T93N T93N<br />
Ha úttorlaszt emelünk a kinezin elé, leválik a<br />
ikrotubulusról.<br />
D<br />
k (s -1 )<br />
k (s-1)<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
K340, ATP<br />
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000<br />
K430, ATP<br />
[ATP] (μM)<br />
k3tmeas<br />
k3tcor<br />
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000<br />
D<br />
T<br />
[ADP] (μM)<br />
ATP<br />
Kinetikai mérések<br />
ATP<br />
MT<br />
D<br />
T93N<br />
MT<br />
kobs<br />
kcor<br />
P i<br />
k (s -1 )<br />
k (s -1 )<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
20<br />
18<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
K340, ADP<br />
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000<br />
K430, ADP<br />
[ADP] (μM)<br />
ADP<br />
kobs<br />
kcor<br />
kobs<br />
kcor<br />
ADP<br />
0<br />
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000<br />
[ADP] (μM)<br />
D<br />
D<br />
T93N<br />
D<br />
8