Motorfehérjék

Motorfehérjék
(2009. november 17.)
Motorfehérjék
1. Specifikus citoszkeletális
filamentumhoz kapcsolódnak
2. A filamentum mentén
elmozdulnak, illetve erőt
fejtenek ki
3. ATP-t bontanak
Motorfehérjék közös tulajdonságai
N
1. Szerkezet
N-terminális globuláris fej:
motor domén, nukleotidot köt és hasít
C
specifikus kötôhely a megfelelô citoszkeletális polimer számára
C-terminálisan: funkcionalitást biztosító kötôhely
2. Mechanika, mûködés
Alapelv: ciklusos mûködés
Motor -> kötôdés a polimerhez -> húzás -> disszociáció -> relaxáció
1 mechanikai ciklusban 1 molekula ATP hidrolizálódik.
A ciklus során különbözô motorfehérje-nukleotid intermedierek.
A mechanikai ciklusban elmozdulás (izotóniás viszonyok)
vagy erôkifejlôdés (izometriás viszonyok) történik.
• Emlékeztető, tartalom
Citoszkeletonnal asszociált fehérjék
Különböző funkciójú fehérjék nagy csoportja, mely a citoszkeletális
rendszer egyes filamentumaihoz specifikusan kapcsolódik
Csoportosítás:
A. Filamentális rendszer szerint
1. Aktin-asszociált (pl. miozin)
2. MT-asszociált (pl. tau)
3. IF-asszociált
B. Kapcsolódás geometriája szerint
1. Véghez kapcsolódó („capping”, pl. gelsolin)
2. Oldalról kapcsolódó (pl. tropomiozin)
C. Funkció szerint
1. Keresztkötő
a. Gélformáló (pl. filamin, spektrin)
b. Kötegformáló (pl. a-aktinin, fimbrin, villin)
2. Polimerizációt befolyásoló
a. Depolimerizáló („severing”, pl. gelsolin)
b. Stabilizáló (pl. profilin, tropomiozin)
3. Motorfehérjék
A motorfehérjék típusai
1. Aktin-alapú: miozin fehérjecsalád.
Konvencionális (miozin II) és nemkonvencionális miozinok
Miozin I-XVIII osztályok
2. Mikrotubulus alapú
a. Dinein
Ciliáris (flagelláris) és citoplazmás dineinek. MW~500kDa
A mikrotubuluson a minusz vég irányába mozognak
b. Kinezin
Neuronokban, axonális vezikulum transzportért felelôsek
Kinezin fehérjecsalád: konvencionális kinezinek + izoformák. MW~110 kDa
A mikrotubuluson a plusz vég irányába mozognak
3. Nukleinsav alapú
DNS és RNS polimerázok
A DNS szál mentén mozognak és erôt fejtenek ki
1

Az ATP hidrolízis ciklusa
Rigor
Other cell functions for actin and myosin
A miozin az aktin plusz vége felé mozog.
Kinezin
séma
2

Munka arány (“duty ratio”)
r = δV
v
δ=munka- vagy lépéstávolság
V=ATPáz sebesség
v=motilitási sebesség
Processzív motor: r->1
pl. kinezin, DNS-, RNS-polimeráz
munkaciklus nagy részében kapcsolt állapotban
egymaga képes a terhét továbbítani
Nonprocesszív motor: r->0
pl. miozin
munkaciklus nagy részében szétkapcsolt állapotban
sokaság mûködik együtt
Egyetlen motorfehérje áltel kifejtett erô: néhány pN.
A polimerizáció követésére szolgáló
módszer
fluoreszcencia
Pirén fluoreszcencia (az aktin Cys374-en)
Monomer
filamentum
ATP hidrolízis
ciklus
τ on
Kapcsol
t
τ on
Szétkapcsolt
τ off
r =
τon +τ off
A motorfehérje munkaciklusa
Munka arány:
= τ on
τ total
In vitro csúszási
sebesség:
v = δ
τ on
δ=munka- vagy lépéstávolság;
V=ATPáz sebesség; v=motilitási sebesség
munkacsapás
kapcsolás szétkapcsolás
visszacsapás
Kapcsolt idô:
τ on = δ
v
Módszerek a motorfehérjék és partnerfehérjéik
vizsgálatára
normalised
Relatív
pyrene
pirén
fluorescence
fluoreszcencia
Formin FH2 domén hatása
a polimerizáció sebességére
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Elongációs elongation sebesség rate
1.0
0.5
Dia1
Dia3
0.0
0 5 10 15 20
mDia1 or mDia3 (μM)
0 10 20
time Idő (min) (perc)
30
Az FH2 domén lassította a polimerizációt.
δ = munkatávolság
Ciklusidô:
τ total = 1
V
3

lézercsipesz
A ‘stopped-flow’ rendszer
http://www.hi-techsci.co.uk/scientific/stoppedflow.html
Egyedi motorfehérje által kifejtett erő
mérése lézercsipesszel
lézercsipesz
mikrogyöngy
Egyedi motorfehérje által kifejtett erő mérése
lézercsipesszel, három mikrogyöngy elrendezésben.
mikroszkóp
fedőlemez
In vitro motilitási próba
miozin
F-aktin
Az in vitro motilitási próba aktin
filamentum és miozin motorfehérje
esetére.
Különböző méretű műanyag gyöngyök (0.5, 1, 3µm) N-WASP-al
bevonva a motilitás próba oldatban (aktin, Arp2/3, ADF/Cofilin,
gelsolin és profilin).
Vándorló keratocita (Vic. Small). ‘Aktivált’ üvegbot (átmérő 1µm, hossz 30 µm) a motilitás assayben.
4

(A. Verkovsky)
‘Tread-milling’: taposómalom Biofizikai módszerek a citoszkeleton tanulmányozására
A polimerizáció követésére szolgáló
módszer
fluoreszcencia
Pirén fluoreszcencia (az aktin Cys374-en)
Monomer
filamentum
A ‘stopped-flow’ rendszer
http://www.hi-techsci.co.uk/scientific/stoppedflow.html
-Fluoreszcencia spektroszkópia
-Fluoreszcencia mikroszkópia
-Atomerő mikroszkópia
-EPR spektroszkópia
-Kalorimetria
-In vitro motilitás próbák
…stb
mikroszkóp
fedőlemez
normalised
Relatív
pyrene
pirén
fluorescence
fluoreszcencia
Formin FH2 domén hatása
a polimerizáció sebességére
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Elongációs elongation sebesség rate
1.0
0.5
Dia1
Dia3
0.0
0 5 10 15 20
mDia1 or mDia3 (μM)
0 10 20
time Idő (min) (perc)
30
Az FH2 domén lassította a polimerizációt.
In vitro motilitási próba
miozin
F-aktin
Az in vitro motilitási próba aktin
filamentum és miozin motorfehérje
esetére.
5

lézercsipesz
(A. Verkovsky)
Egyedi motorfehérje által kifejtett erő
mérése lézercsipesszel
lézercsipesz
mikrogyöngy
Egyedi motorfehérje által kifejtett erő mérése
lézercsipesszel, három mikrogyöngy elrendezésben.
Különböző méretű műanyag gyöngyök (0.5, 1, 3µm) N-WASP-al
bevonva a motilitás próba oldatban (aktin, Arp2/3, ADF/Cofilin,
gelsolin és profilin).
Vándorló keratocita (Vic. Small). ‘Aktivált’ üvegbot (átmérő 1µm, hossz 30 µm) a motilitás assayben.
‘Tread-milling’: taposómalom
6