Ultracentrifuga

Szedimentáció,
Elektroforézis
Kollár Veronika
2010. 11. 25.

Makromolekulák analízise
és elválasztása

Szedimentáció
Miért van szükség centrifugálásra?
A nehézségi erıtérben való ülepítés a 2-50 µm tartományban
alkalmazható, az ennél kisebb részecskék ülepítéséhez a gravitációs
erıtér nem elegendı, ezért centrifugális erıteret kell alkalmazni.
Theodor Svedberg – 1920-as években megalkotta az elsı ultracentrifugát
(N>10000 min-1 (N>10000 min ) -1 )
Ultracentrifuga
Preparatív Analitikai
Különbözı mérető ill. moláris
tömegő komponensek elkülönítése
méret vagy a moláris tömeg
meghatározása

Szedimentáció
Koncentráció eloszlás viszonyok az UC cellájában
Milyen erık hatnak a centrifugában lévı részecskére?

Meddig gyorsul a részecske?
Szedimentáció
F s=F c-F f
A centrifugális erı és a felhajtóerı különbsége addig mozgatja a részecskéket
gyorsuló mozgással a tengelytıl kifelé, amíg (a sebesség növekedésével) az
ellenkezı irányú súrlódási erıvel egyensúlyba nem kerül.
ρ,m

Szedimentációs sebességi módszer
Erıegyensúly esetén:
F
c
+ Ff
+ Fs
fv
=
2
mrω
=
−
0
m 2
ρ0rω
ρ
F = F −
s
c
F
2⎛
ρ0
⎞
= mrω
⎜1−
⎟
⎝ ρ ⎠
Ezután a részecske sebessége már csak olyan arányba nı, ahogy
távolodik a forgástengelytıl. Az erık kiegyenlítıdése után a sebesség
nem lesz konstans, mert a térerı helyfüggı.
S
=
v
2
rω
⎛ ρ0
⎞
m⎜1−
⎟
=
⎝ ρ ⎠
f
Szedimentációs állandó: S 1 Svedberg=10 -13 s
f

Mire jó?
Meghatározhatom a részecske/molekula tömegét
Ha meghatározzuk a sebességet (v) és a centrifugális gyorsulást
(rω 2 ), akkor a részecske tömege számolható:
Ehhez tudnom kell az f alakfaktort, de…
Meghatározhatom a részecske/molekula alakját
D – diffúziós állandó
k - Boltzmann állandó
R - egyetemes gázállandó
N - Avogadro-szám 6*1023 A tömeg meghatározásához a szedimentációs sebességi módszert kombinálni
kell diffúziós mérésekkel.

Szedimentációs egyensúlyi módszer
Ha a részecskék elérik a csı falát, egyensúly áll be, a nettó sebesség nulla lesz;
Ha csak a centrifugális erı hatnak a molekulák a legkisebb energiájú
helyen (az edény alján) helyezkednének el.
DE!
A mikroszkópikus mozgások folytatódnak
A csı falának közelében kialakul a részecskéknek egy eloszlása.
A tengelytıl mért két különbözı r1, illetve r2 távolságban az n1 és n2
molekulakoncentráció arányát a Bolztmann-eloszlásból kapjuk meg:
E-helyzeti energia

Az energiák különbsége felírható
Adott kísérletben az r1 és r2 pozíciók energiájának a különbségét a rotor
szögsebessége határozza meg.
A molekulák annál szőkebb r intervallumban helyezkednek el, ,minél nagyobb a
rotor szögsebessége.
Szedimentációs egyensúly létrejön
Vesszük a ln-t

A kapott egyenletbıl a tömeg kiszámolható!
A módszer elınye a szedimentációs sebességi módszerhez képest:
Az eredmények nem függenek az alaki faktortól
Egy probléma lehet: sőrőség meghatározása
Sőrőség grádiens ultracentrifugálás

Sőrőség grádiens ultracentrifugálás
Nagy sőrőségő, de kis molekulatömegő anyagok centrifugálásánál az
egyensúly beálltakor sőrőséggradiens keletkezik. Pl.: CsCl
Egy dalton molekulatömeg különbség már kimutatható a módszerrel
(Pl.:Meselson-Stahl kísérlet)
Pl.:Meselson-Stahl kísérlet
Az E.coli baktériumokat 15 N táptalajon
tenyésztették,majd átették ıket 14 N táptalajra.
Egy generációsidı elteltével az összes DNS a
hibrid sőrőséget mutatta centrifugálás során
A második generációban a 14 N DNS sőrőségének
megfelelı sáv is megjelenik a hibrid sáv mellett.
Ez a DNS szemikonzervatív replikációjának
bizonyítéka.

Analitikai ultracentrifuga
Az ülepedési határfelületnél
kialakult koncentráció-gradiens
egyben törésmutatógradienst is
jelent.
Ezt a törésmutató-gradienst
tudja az ultracentrifuga
schlieren-optikája csúcs
formájúra alakítani (deriválni).
Ennek a csúcsnak az idıbeli
elmozdulását kell filmre
rögzíteni és ezeken a
felvételeken mérhetık ki a
szedimentációs állandó
számításához szükséges
adatok.

Az üllepedı meniszkusz többféle optikával követve:
Schlieren optika
Idıben mérve a front
vándorlását kiszámítható a
szedimentációs állandó
s
1 ⋅
= ω
d
ln
dt
r

Differenciál centrifugálás

a cp
a cp
Számolási példa
Mekkora fordulatszámot kell beállítani a 10 cm-es rotorral
rendelkezı centrifugán, 15000 g-t kell alkalmaznunk két fehérje
elválasztásához?
RCF
=
a
cp
RCF= 15000g a= 15000x10=150000
2
= ω r =
2
4π
2
n
2⎛
N ⎞
= 4 π ⎜ ⎟ r = 0,
011N
⎝ 60⎠
N
=
a
cp
0,
011r
2
r
2
r
g
n- másodpercenkénti
fordulatszám
N- percenkénti
fordulatszám
r-sugár (m)

Elektroforézis
Mi történik egy töltött molekulával, ha elektromos térbe kerül?
+
E
1. Coulomb erı 2. Surlódási erı
F C=ZeE
E=elektromos térerő
e=elemi töltés
z=töltések száma
A részecskéknek, molekuláknak elektromos erıtér hatására bekövetkezı
transzlációs mozgását elektroforézisnek nevezik.
+Ze
fv
ZeE
-
Ff = f v
v=sebesség
f=alaki faktor (súrlódási
állandó)

Erıegyensúly esetén állandó vándorlási sebesség:
Elektroforetikus mozgékonyság
ZeE = fv
(egységnyi elektromos mozgási térre vonatkoztatott sebesség):
l – t idő alatt megtett út
t – idő
U – feszültségkülönbség
d – membrán hossz
v =
l
t
u el =
ld
Ut
E =
U
d

Elektroforézis fajtái
I. Szabad elektroforézis
II. Kapilláris elektroforézis
III. Gélelektroforézis 1. Agaróz géleletroforézis
2. Poliakrilamid gélelektroforézis
3. Grádiens gélelektroforézis
4. Izoelektromos fókuszálás
5. Kétdimenziós elektroforézis
IV. Blotting technikák
1. Southern Blot
2. NorthernBlot
3. Western Blot

kapilláris
II. Kapilláris elektroforézis
Elektromos térben az oldott anyagok különbözı sebességgel
vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelıen:
• kis méret, nagy töltés –nagy mozgékonyság/gyors
• nagy méret, kis töltés –kis mozgékonyság/ lassú
puffer
minta
elektród
nagyfeszültségő
tápegység
detektor
puffer
elektród
Az elektroforézis egy vékony 25-75 µm
belsı átmérıjő, pufferoldattal töltött
kapillárisban történik.
Detektálás: OD, λ = 200 nm
Dr. Gáspár Attila: Kapilláris elektroforézis

A módszer alapja
Elektroozmotikus áramlás (EOF)
Kapilláris falán kialakuló
kettısréteg
a
b
c
Az elektroozmotikus áramlás kialakulása
negatív töltéső kvarc kapilláris belsı felülete (Si-O-)
hidratált kationok győlnek össze a felület közelében
tömegáramlás alakul ki az elektromos tér létrehozása miatt

Vándorlás:
1. Kationok
2. Töltés nélküli
részecskék
3. Anionok
Az EOF egy másik fontos elınye, hogy az gyakorlatilag az összes
részecskét, függetlenül azok töltésétıl, azonos irányú mozgásban tartja.
Kapilláris Elektroforézis elınyei:
Csekély hıfejlıdés
Rövid mérési idı
Nagy elválasztási hatékonyság
Minimális mintatérfogat (1-10 nl)
Könnyen automatizálható

III./1. Agaróz géleletroforézis
Alapelv: a nukleinsavak megfelelı puffer oldatban negatív
töltésőek, ezért egyenáram hatására a pozitív pólus felé
vándorolnak
Agaróz:
-térhálós szerkezető poliszacharidláncokat tartalmaz
-a kisebb méretőek gyorsabban vándorolnak („futnak”)
Gélfestés:
a nukleinsavak láthatóvá tételét szolgálja
Etídium-bromid:
kovalensen kötıdik a nukleinsavakhoz
Bekötıdve fluoreszkál UV hatására
UV alatt a nukleinsavak láthatóak

III/2. SDS- Poliakrilamid gélelektroforézis
• gél pórusnagysága a
monomerek koncentrációjától
függ;
• leghatékonyabb, rutinszerően
alkalmazott fehérje elválasztási
módszer.
Összetevık:
APS- elindítja a polimerizációt
Temed- szabadgyök,
katalizálja a polimerizációt
Bisz-akrilamid-crosslinker
SDS- anionos detergens
A fehérje apoláros részéhez
kapcsolódik
Lefedi a + régiókat
Minden fehérjét anionossá tesz
Akrilamid + biszakrilamid + perszulfát → poliakrilamid

III/4. Izoelektromos fókuszálás
Bizonyos makromolekulák, melyekben savas és
bázikus csoportok is találhatóak, ha változik a közeg
pH-ja össztöltésüket megváltoztatják.
Pl.: fehérjék
Magas pH – negatív
Alacsony pH – pozitív nettó töltés
De egy bizonyos pH-n az össztöltés nulla –
izoelektromos pont
Az elektroforézis pH gradiensben végezzük
A fehérjék az izoelektromos pontjuknak megfelelı pH-ig vándorolnak

III./5. Kétdimenziós elektroforézis
Csökkenı méret
Csökkenı pH

IV. A Southern, Northern és Western
Elektroforézissel a DNS, RNS
vagy fehérje molekulák méret
szerint elválaszthatók.
A gélben elválasztott molekulák
filterre blottolhatók.
A filteren hibridizációval
azonosíthatók a próbával
homológ fragmentek,
ellenanyag festéssel
pedig a kérdéses fehérje.
Southern-nel a gén DNS-e,
Northern-nel a gén RNS-szinten
történı kifejezıdése,
Western-nel a fehérje
kifejezıdése vizsgálható.
technikák

IV./1. Southern Blot
1. A vizsgálandó DNS-t restrikciós
enzimekkel emésztjük.
2. Gélelektroforézis során a méret
szerinti elválasztás nem lesz
tökéletes, mivel sok hasonló
mérető, de eltérı szekvenciájú
DNS fragmentumot kapunk az
emésztés során
3. DNS fragmentumok
denaturálása
4. Átvitel nitrocellulóz membránra
5. Jelölés (hibridizálás)
komplementer DNS próbával
festett gél autoradiogram
6. Az azonos hosszúságú, de eltérı szerkezető
fragmentumokat a jelölés után autoradiográfiával tesszük
láthatóvá.

1. SDS-gél
2. Átblottolás nitrocellulóz
membránra
3. Jelölés elsődleges monoklonális
antitesttel – ez specifikusan köt
4. Másodlagos antitest, ehhez
színváltozással járó reakciót
katalizáló enzim kapcsolódik.
5. Enzimszubsztrát hozzáadása
6. Jel detektálása
IV./3. Western Blot

Köszönöm a figyelmet!