Természetes hatóanyagok jelentőségének vizsgálata máj- és ...
Természetes hatóanyagok jelentőségének vizsgálata máj- és ...
Természetes hatóanyagok jelentőségének vizsgálata máj- és ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.4.2.4.6. FMO1-enzim aktivitásának meghatározása<br />
Az enzimaktivitás meghatározását Pike <strong>és</strong> mtsai (171) alapján kis módosítással<br />
végeztük, Merck Hitachi Lachrom HPLC-vel. Az inkubáló elegyből metil-alkohollal,<br />
ill. triklórecetsavval a fehérjét kicsaptuk, majd 8500 g-n, 10 percig 0ºC-on<br />
centrifugáltuk. A metabolit mennyiségét a felülúszóból határoztuk meg. A<br />
szubsztrátként használt benzidamin 5 perces inkubálást követően benzidamin-N-oxiddá<br />
alakul. A metabolit mennyisége HPLC-vel mérhető UV detektálással 306 nm-en. Az<br />
módszer paraméterei: izokratikus elúció, Purospher C18e oszlop, eluens összetétel:<br />
58/42=metil-alkohol/0,1M ammónium-acetát puffer, 15 perces futtatás. Az<br />
enzimaktivitást az 1 perc alatt keletkezett metabolit mennyiségét pmol-ban kifejezve, 1<br />
mg fehérjére vonatkoztatva határoztuk meg.<br />
4.4.3. Szöveti redoxi-paraméterek meghatározása<br />
4.4.3.1. Konjugáltdién-tartalom<br />
A szövetnedves <strong>máj</strong>homogenizátumok konjugáltdién-koncentrációját AOAC módszer<br />
alapján határoztuk meg (5). A mintákat izo-oktánnal (1g minta/5 ml izo-oktán) 2 percen<br />
keresztül intenzíven extraháltuk Vortex k<strong>és</strong>zülékkel, majd az extrakciót tovább<br />
folytattuk szobahőmérsékleten, levegőtől elzárva, sötét helyen, 24 órán keresztül. A<br />
minta izo-oktános fázisát 232 nm-en fotometráltuk.<br />
4.4.3.2. Hidrogén-donor aktivitás<br />
A biológiai minták H-donor aktivitását a 4.2.4.2. pontban leírtak szerint határoztuk<br />
meg. A vizsgálatokhoz 50-50 μl plazmát, 10 mg/ml-es szérum marha albuminra<br />
beállított <strong>máj</strong>homogenizátumot <strong>és</strong> bélmucosa-homogenizátumot használtunk. Az<br />
abszorbanciát a 30 perces 37 ºC-os inkubációt, majd a 10 perces centrifugálást (3000<br />
rpm-en) követően olvastuk le Specord UV-Vis spektrofotométerrel (19, 90).<br />
4.4.3.3. Redukákóképesség<br />
A minták redukálóképességének meghatározása a 4.2.4.3. pontban ismertetett Oyaizu<br />
módszerrel történt (164). A vizsgálatokhoz 200 μl biológiai mintát (plazma, 10 mg/mles<br />
<strong>máj</strong>homogenizátum, bélmucosa-homogenizátum) használtunk. A minták<br />
redukálóképességét aszkorbinsav ekvivalensben fejeztük ki (μmol AS/g protein).<br />
51
Change language