Természetes hatóanyagok jelentőségének vizsgálata máj- és ...
Természetes hatóanyagok jelentőségének vizsgálata máj- és ...
Természetes hatóanyagok jelentőségének vizsgálata máj- és ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.4.2.4.2. Citokróm-b5 koncentráció meghatározása<br />
A citokróm-b5 mennyiségének meghatározása Greim (84) módszere alapján történt. A<br />
4.3.1.2. pont szerint elők<strong>és</strong>zített minták (CO+ditionit) differencia spektrumából a 425 <strong>és</strong><br />
490 nm-en kapott abszorbancia értékek különbsége is olvasható, melyből a<br />
koncentrációt a 161 mM -1 cm -1 extinkciós koefficienssel számoltuk. A mér<strong>és</strong>t Hitachi U-<br />
3300 spektométerrel végeztük.<br />
4.4.2.4.3. Citokróm-c-reduktáz meghatározása<br />
A mikroszóma mintához oxidált citokróm-c-t adtunk <strong>és</strong> küvettába mértük. A NADPH<br />
hozzáadásával indítjuk el a reakciót, mely során a keletkező redukált citokróm c 550<br />
nm-en mérhető spektrofotométerrel. 10 sec alatt mért abszorbancia érték változásából,<br />
19,1 mM -1 cm -1 extinkciós koefficiensel számoltuk a koncentrációt. A mér<strong>és</strong>t Hitachi U-<br />
3300 spektométerrel végeztük. Az enzimaktivitást az 1 perc alatt keletkezett metabolit<br />
mennyiségét μmol-ban kifejezve, 1 mg fehérjére vonatkoztatva határoztuk meg. A<br />
meghatározást Masters <strong>és</strong> mtsai (136) munkája alapján végeztük.<br />
4.4.2.4.4. P4501A-enzim aktivitásának meghatározása<br />
A mér<strong>és</strong>t Burke (27) módszere alapján végeztük el. Az inkubáló elegyből metilalkohollal,<br />
ill. triklórecetsavval a fehérjét kicsaptuk, majd 2500 g-n, 30 percig 4ºC-on<br />
centrifugáltuk. A továbbiakban a felülúszóval dolgoztunk. A szubsztrátként használt<br />
etoxiresorufin 15 perces inkubálás során resorufinná deetilálódik. A metabolit<br />
mennyisége fluoriméterrel detektálható. A gerjesztő hullámhossz 535 nm, az emissziós<br />
hullámhossz 585 nm volt. Az enzimaktivitást az 1 perc alatt keletkezett metabolit<br />
mennyiségét pmol-ban kifejezve, 1 mg fehérjére vonatkoztatva határoztuk meg. A<br />
meghatározást Hitachi F-4000 fluoreszcens spektrofotométerrel végeztük.<br />
4.4.2.4.5. P4502E1-enzim aktivitásának meghatározása<br />
Az enzim aktivitásának meghatározását Reinke <strong>és</strong> Moyer (181) módszere alapján<br />
végeztük, Beckman DU-30 spektrofotométerrel. Az inkubáló elegyből metil-alkohollal,<br />
ill. triklórecetsavval a fehérjét kicsaptuk, majd 2500 g-n, 30 percig 4ºC-on<br />
centrifugáltuk. Ezt követően a felülúszóval dolgoztunk tovább. A szubsztrátként<br />
használt p-nitrofenol 15 perces inkubálás során p-nitro-katekollá hidroxilálódik. A<br />
metabolit mennyisége spektrofotométerrel mérhető 505 nm-en. Az enzimaktivitást az 1<br />
perc alatt keletkezett metabolit mennyiségét pmol-ban kifejezve, 1 mg fehérjére<br />
vonatkoztatva határoztuk meg.<br />
50
Change language