Neurophysiologie de Marseille (CRN2M) UMR6231 Equipe 2

Décrire de façon précise les protocoles suivants :
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :
- Prélèvement de substances sur animaux anesthésiés :
Protocoles appliqués à des rongeurs adultes.
*Protocole 1 pour la biologie moléculaire :
On euthanasie les animaux par dislocation cervicale après une overdose de pentobarbital. On sectionne la
tête aux ciseaux. On prélève le cerveau, le cervelet et les bulbes olfactifs. Tous les tissus sont ensuite
congelés.
*Protocole 2 pour l’immunohistochimie :
On anesthésie le rongeur par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (70 mg/kg).
On ouvre la cage thoracique puis on dégage le cœur. On insère une aiguille reliée au tuyau d’une pompe
péristaltique dans le ventricule gauche. On coupe l’oreillette droite, le sang est alors remplacé par la
solution perfusée (PFA 4% ou PBS). Ensuite on prélève le cerveau.
*Protocole 3 pour la mise en culture de cellules neurales de rats ou de souris (normales ou KO)
Protocoles appliqués à des rongeurs périnataux.
Cultures de cellules nerveuses de rats ou de souris (normales ou KO)
A partir de fœtus (pour culture de neurones de cortex ou d’hippocampe). Les mères gestantes sont
profondément anesthésiées par inhalation d’halothane (Lab. Bellamon). Après incision de l’abdomen
(suivi de décapitation), le placenta est prélevé et transféré dans un tampon glacé. Les embryons (au stade
embryonnaires E17-18) sont alors prélevés et décapités avant prélèvements du cerveau.
A partir de nouveaux-nés.(pour cultures d’astrocytes corticaux, ou de neurones de cervelet)
Les prélèvements des cerveaux se font ici 3 - 7 jours après la naissance sur les animaux anesthésiés et
décapités comme ci-dessus.
- Interventions chirurgicales :
Protocole pour Infusion sous-cutanée par minipompe osmotique
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange de kétamine (100
mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Avant d’effectuer une incision de la peau au niveau dorsal de l’animal
(légèrement caudal du niveau des épaules), la peau est rasée et les poils sont éliminés avec une gaze
humide. La peau est aseptisée à la Bétadine. Le matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique
Alzet , USA) est inséré par l’incision et la peau de l’animal est suturé avec du fil stérile et résorbable en
vicryl 3-0. L’animal est ensuite placé seul dans une cage et est contrôlé attentivement jusqu’à ce qu’il
retrouve sa vigilance et notamment puisse se tenir debout. L’animal retourne ensuite en zone de
stabulation (un animal par cage) pour une durée variant entre 1 et 42 jours avant d’être sacrifié par
injection d’une dose létale de pentobarbital sodique (30 mg/kg) en intra-péritonéal.
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée de BUPRECARE à la dose de 0.02 à 0.5 mg/kg pour
le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.
Protocole pour Infusion intra-cérébro-ventriculaire (4ème ventricule) par minipompe osmotique
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange de kétamine (100
mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). L’animal est placé sur un appareil de stéréotaxie, maintenu par des
barres d’oreilles et par une pièce de gueule. La partie supérieure du crâne est rasée et les poils sont
éliminés avec une gaze humide. La peau est aseptisée à la Bétadine. Une incision longitudinale est effectuée
avec un scalpel et la peau est écartée. L’os est séché et un trou est percé sur le crâne pour permettre le
passage de la canule d’infusion. Une fois en place, celle-ci est maintenue par l’utilisation de ciment
dentaire (GC Fuji I, Japan). Le matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique Alzet , USA) est
connecté à al canule d’infusion et ensuite inséré sous la peau de l’animal pour être positionné au niveau
dorsal, légèrement caudal du niveau des épaules. La température de l’animal est vérifiée au cours de
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