Neurophysiologie de Marseille (CRN2M) UMR6231 Equipe 2

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Intitulé : Dégénérescence et Plasticité Neurale Responsable : Dr. Santiago RIVERA A – Domaine d’activité et justification L’équipe s’intéresse à l’étude des mécanismes de dégénérescence et de plasticité dans le système nerveux central dans des conditions pathologiques, notamment dans des modèles transgéniques de la maladie d’Alzheimer. Les recherches portent sur le rôle des métalloprotéases matricielles (MMPs) et leurs inhibiteurs endogènes (TIMPs), ainsi que du système endocannabinoïde dans ces mécanismes. Les chercheurs utilisent entre autres des approches de gain et de perte de fonction avec notamment l’utilisation d’animaux transgéniques. Un deuxième axe de recherche est focalisé sur le rôle du cytosquelette dans les phénomènes de plasticité et de réparation post-lésionnelle dans le système nerveux. B – Espèces animales utilisées et justification L’équipe utilise des rats et des souris. La souris est l’espèce de choix actuellement dans le monde lors qu’il s’agit d’étudier la maladie d’Alzheimer par des méthodes de la transgénèse. Pour cela l’équipe utilise la souche de souris 5xFAD, acquise auprès de Jackson Laboratoires, qui développe la maladie d’Alzheimer. L’équipe a également généré une souche dite ABK qui résulte du croisement de la souche 5xFAD et d’une souche KO pour le gène de la protéase MT5-MMP. Il est envisagé de croiser également à partir de 2012 la souche 5xFAD avec des souches KO pour deux protéases importantes dans les phénomènes d’inflammation et de neurodégénérescence (MMP-12 et MT1-MMP KO) tel qu’il est prévu dans les projets ANR qui ont été financés récemment dans le laboratoire. Enfin, l’utilisation des souris et des rats et également justifiée par le fait que les conditions d’expérimentation sur ces espèces ont été optimisées depuis des années au niveau de l’équipe et de l’animalerie. C – Protocole expérimental sur l’animal � Prélèvement de tissus sur animaux anesthésiés : � Protocoles appliqués à des rongeurs adultes. *Protocole 1 pour la biologie moléculaire : 78
Les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après une surdose de pentobarbital 6%. Le cerveau, le cervelet et les bulbes olfactifs sont prélevés. Tous les tissus sont ensuite congelés. *Protocole 2 pour l’immunohistochimie : les animaux sont anesthésiés par injection intra péritonéale de pentobarbital sodique à la dose de 70 mg/kg. Après thoracotomie et dégagement du cœur, une solution de PFA 4% ou PBS est infusée pour fixer les tissus. Le cerveau est ensuite prélevé. *Protocole 3 pour la mise en culture de cellules neurales de rats ou de souris (normales ou KO) � Protocoles appliqués à des rongeurs périnataux Cultures de cellules nerveuses de rats ou de souris (normales ou KO) *A partir de fœtus (pour culture de neurones de cortex ou d’hippocampe). Les mères gestantes sont profondément anesthésiées par inhalation d’halothane (Lab. Bellamon). Après incision de l’abdomen (suivi de décapitation), le placenta est prélevé et transféré dans un tampon glacé. Les embryons (au stade embryonnaires E17-18) sont alors prélevés et décapités avant prélèvements du cerveau. *A partir de nouveaux-nés.(pour cultures d’astrocytes corticaux, ou de neurones de cervelet) Les prélèvements des cerveaux se font à 3 - 7 jours après la naissance sur les animaux anesthésiées et décapités comme ci-dessus. � Interventions chirurgicales : � Protocole pour Infusion sous-cutanée par minipompe osmotique Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Avant d’effectuer une incision de la peau au niveau dorsal de l’animal (légèrement caudal du niveau des épaules), la peau est rasée et les poils sont éliminés avec une gaze humide. La peau est aseptisée avec de la Bétadine. Le matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique Alzet , USA) est inséré par l’incision et la peau de l’animal est suturée avec du fil stérile et résorbable en vicryl 3-0. L’animal est ensuite placé seul dans une cage et est surveillé jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance. L’animal retourne ensuite en zone de stabulation (un animal par cage) pour une durée variant entre 1 et 42 jours avant d’être sacrifié par injection d’une dose létale de pentobarbital sodique (120 mg/kg) en intra-péritonéal. 79
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