Neurophysiologie de Marseille (CRN2M) UMR6231 Equipe 2
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SOMMAIRE<br />
I<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong> l’établissement p2<br />
Organigramme p4<br />
Description <strong>de</strong>s locaux p5<br />
Domaines d’activité, espèces animales utilisées et justifications,<br />
les protocoles sur les animaux et les fiches N°2 p30<br />
Le personnel p131<br />
Procédures <strong>de</strong> fonctionnement <strong>de</strong> l’animalerie p134<br />
1
IDENTIFICATION DE L’ETABLISSEMENT<br />
1- Dénomination et adresse<br />
Institut Jean Roche<br />
Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine Secteur Nord<br />
51 Boulevard Pierre Dramard<br />
13015 <strong>Marseille</strong><br />
2- Téléphone :<br />
04 91 69 87 05<br />
04 91 69 87 08<br />
06 77 03 34 91<br />
3- Responsables :<br />
Pr. Alain ENJALBERT<br />
Directeur du Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie- <strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong><br />
<strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
Tel 04 91 69 89 18<br />
alain.enjalbert@univmed.fr<br />
Responsables du plateau technique<br />
Mourad MEKAOUCHE<br />
Ingénieur <strong>de</strong> Recherche CNRS, DMV<br />
Tel : 04 91 69 87 08 / 06 77 03 34 91<br />
mourad.mekaouche@univmed.fr<br />
2<br />
Jean-Paul HERMAN<br />
Directeur <strong>de</strong> Recherche CNRS<br />
Tel : 04 91 69 87 15<br />
jean-paul.herman@univmed.fr<br />
Les personnels animaliers ayant suivi une formation <strong>de</strong> Niveau 2<br />
Axel FERNANDEZ<br />
Jean-Luc FINA<br />
Christian GOMEZ<br />
Céline MAZENQ<br />
4- Société ou organisme dont dépend l’établissement<br />
Université Aix <strong>Marseille</strong> II<br />
Adresse : Jardin du Pharo<br />
58, Bd Charles LIVON 13007 <strong>Marseille</strong> 7<br />
5- Ministère dont relève l’activité <strong>de</strong> l’établissement :<br />
Ministère <strong>de</strong> l’enseignement supérieur et <strong>de</strong> la recherche<br />
6- N° SIRET <strong>de</strong> l’établissement :<br />
191 318 435 000 10
7- Domaines d’activité<br />
Recherche fondamentale<br />
Recherche clinique<br />
Enseignement et Formation<br />
8- Locaux<br />
a- Animalerie centrale : Plan <strong>de</strong> masse <strong>de</strong>s 4 ème et 5 ème étages du bâtiment B, une<br />
animalerie <strong>de</strong> niveau <strong>de</strong> protection 2 (A2) localisée au bâtiment F.<br />
b- Animaleries périphériques : pièces d’expérimentation ou stabulation dans les<br />
laboratoires : Plan <strong>de</strong> masse <strong>de</strong>s laboratoires.<br />
9- Protocoles expérimentaux et espèces animales utilisées<br />
Les protocoles expérimentaux, les espèces animales utilisées, les protocoles pratiqués<br />
sur les animaux ainsi toutes les justifications mis en œuvre à l’Institut Jean Roche sont<br />
décris pour chaque équipe utilisatrice <strong>de</strong> l’animalerie.<br />
3
ORGANIGRAMME<br />
Etablissement<br />
Pr. Alain ENJALBERT<br />
Directeur<br />
Dr. Mourad MEKAOUCHE Dr. Jean-Paul HERMAN<br />
Vétérinaire responsable sanitaire Coordinateur Scientifique<br />
Personnels ayant suivi une formation approuvée <strong>de</strong> Niveau II<br />
Axel FERNADEZ<br />
Jean-Luc FINA<br />
Christian GOMEZ<br />
Céline MAZENQ<br />
COMITE DES UTILISATEURS<br />
Le fonctionnement <strong>de</strong> l’établissement est supervisé par le comité <strong>de</strong>s utilisateurs composé par<br />
le directeur, le vétérinaire, le responsable scientifique ainsi que les chefs d’équipes <strong>de</strong><br />
recherche utilisateurs <strong>de</strong> l’animalerie.<br />
Ce comité déci<strong>de</strong> <strong>de</strong>s orientations <strong>de</strong> l’établissement dans les domaine zootechniques, éthique<br />
(sensibilisation à consulter le comité d’éthique régional, réflexion sur la mise en place d’un<br />
comité d’éthique d’établissement), la gestion <strong>de</strong>s ressources humaines et financière.<br />
4
DESCRIPTIF DES LOCAUX<br />
I – ANIMALERIE CENTRALE<br />
L’animalerie centrale <strong>de</strong> l’Institut Jean Roche occupe la totalité du 5ème étage du bâtiment B<br />
<strong>de</strong> la Faculté <strong>de</strong> Mé<strong>de</strong>cine secteur Nord <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> et l’aile nord ainsi que l’aile sud du<br />
4ème étage <strong>de</strong> ce même bâtiment. Nous avons aménagé dans l’aile sud une gran<strong>de</strong> pièce pour<br />
répondre à <strong>de</strong>s besoins supplémentaires en hébergement <strong>de</strong> rat et <strong>de</strong> souris.<br />
Les plans <strong>de</strong> masse <strong>de</strong>s étages 4 et 5 sont joints.<br />
Les locaux sont divisés en trois zones auxquelles s’ajoutent les locaux du personnel et les<br />
sanitaires:<br />
A – Une zone conventionnelle (dite animalerie A1) <strong>de</strong> 570 m 2<br />
comprenant<br />
A-1 locaux du 5 ème étage du bâtiment B<br />
� 2 pièces <strong>de</strong> stabulation rat (26 m 2 x 2)<br />
� 4 pièces <strong>de</strong> stabulation souris (26 m 2 et 16 m 2 )<br />
� 1 laboratoire d’expérimentation équipé <strong>de</strong> paillasses (15 m 2 )<br />
� 1 pièce dédiée à l’euthanasie et autopsie <strong>de</strong>s animaux équipée d’une paillasse et<br />
contenant une boîte d’euthanasie à CO2 (8 m 2 )<br />
� 1 laverie équipée <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux lave-cages et d’un bac <strong>de</strong> lavage (26 m 2 )<br />
� 1 stock propre attenant à la laverie (13 m 2 )<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> stockage <strong>de</strong>s aliments équipée <strong>de</strong> palettes (13 m 2 )<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> stockage <strong>de</strong> la litière équipée <strong>de</strong> palettes (39 m 2 )<br />
5
NIVEAU 5, BATIMENT B<br />
6
A-2 locaux du 4 ème étage du bâtiment B<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> stabulation cobaye (18,2 m 2 ) Elle dispose d’un sol peint et lavable<br />
avec un siphon <strong>de</strong> sol pour l’évacuation <strong>de</strong>s eaux <strong>de</strong> lavage. Une faïence<br />
murale blanche est posée sur les murs jusqu’à une hauteur <strong>de</strong> 1,10 m. Au-<br />
<strong>de</strong>ssus <strong>de</strong>s faïences, les murs sont peints ainsi que le plafond. Murs et plafond<br />
sont lessivables. Cette pièce est équipée d’un évier, d’une lumière à cycle<br />
diurne/nocturne 12h/12h. La pièce est climatisée par le système général <strong>de</strong><br />
climatisation <strong>de</strong> l’animalerie.<br />
� 1 laverie gros matériels équipée <strong>de</strong> 2 bacs <strong>de</strong> lavage (20 m 2 ) Elle est équipée<br />
d’un sol lavable avec un siphon <strong>de</strong> sol pour l’évacuation <strong>de</strong>s eaux <strong>de</strong> lavage et<br />
<strong>de</strong> faïences murales blanches sur une hauteur <strong>de</strong> 1,30 m. Les murs (à partir <strong>de</strong><br />
1,30 m du sol) et le plafond sont peints. L’ensemble <strong>de</strong> la pièce est lavable.<br />
Cette pièce est équipée d’une arrivée d’eau froi<strong>de</strong> sur laquelle est branché un<br />
tuyau pour le lavage du gros matériel.<br />
� avec un local <strong>de</strong> stockage <strong>de</strong> la litière et <strong>de</strong>s aliments (6,5 m 2 )<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> prélèvement sanguin automatisé (9.5 m 2 ) équipé <strong>de</strong> 4 automates <strong>de</strong><br />
prélèvement sanguins <strong>de</strong> marque ABS.<br />
� 2 salles <strong>de</strong> chirurgie équipées <strong>de</strong> paillasses : Chirurgie 1 (17.5 m 2 ) et Chirurgie<br />
2 (17 m 2 )<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> réveil post-opératoire (13 m 2 )<br />
� 1 espace chronobiologie composé d’un lieu <strong>de</strong> stabulation organisé en box (8,6<br />
m 2 ) Elle est aménagée sur 2 côtés avec un total <strong>de</strong> 6 box <strong>de</strong> 2,20 m <strong>de</strong> haut.<br />
Deux box ont une surface <strong>de</strong> 0,69 m 2 , <strong>de</strong>ux autres <strong>de</strong> 0,49 m 2 et les <strong>de</strong>rniers <strong>de</strong><br />
0,56 m 2 . L’intérieur <strong>de</strong> chaque box est aménagé <strong>de</strong> 4 étagères amovibles<br />
métalliques. L’éclairage <strong>de</strong> chaque box est relié à un programmateur à<br />
l’extérieur. Chaque porte est équipée d’un tuyau <strong>de</strong> 10cm <strong>de</strong> diamètre coudé<br />
qui permet <strong>de</strong> laisser circuler l’air sans faire entrer <strong>de</strong> lumière.<br />
Les box permettent <strong>de</strong> changer le cycle lumière/obscurité au cours <strong>de</strong> la<br />
stabulation.<br />
7
Attenant à ces box d’hébergement un laboratoire équipé <strong>de</strong> paillasses (6,2 m 2 )<br />
est utilisée pour prélever <strong>de</strong>s structures cérébrales après sacrifice par<br />
décapitation dans l’obscurité (sous lumière rouge).<br />
� 1 bloc comportement constitué d’un couloir (8.2 m 2 ) et <strong>de</strong> 4 pièces :<br />
comportement 1 (6.1 m 2 ), comportement 2 (5.4 m 2 ), comportement 3 (4. m 2 2)<br />
et comportement 4 (4 m 2 )<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> quarantaine (6,5 m 2 )<br />
� 1 pièce B407 nouvellement aménagée d’une superficie <strong>de</strong> 60.5 m 2 et située à<br />
l’aile sud du 4 ème étage. Cette pièce n’étant pas reliée au système <strong>de</strong><br />
climatisation et <strong>de</strong> ventilation <strong>de</strong> l’animalerie, elle est équipée <strong>de</strong> 2 climatiseurs<br />
réversibles et d’une extraction.<br />
Une son<strong>de</strong> thermique y est installée et reliée au système <strong>de</strong> télésurveillance <strong>de</strong><br />
l’animalerie.<br />
8
NIVEAU 4, BATIMENT B<br />
9
B – Une zone propre ou animalerie A1+ au 5ème étage du bâtiment B<br />
<strong>de</strong> 180 m 2<br />
Cette zone diffère <strong>de</strong> la conventionnelle par la présence d’une barrière physique sous<br />
forme d’un gradient <strong>de</strong> surpression, elle comprend :<br />
� 1 sas d’entrée <strong>de</strong>s opérateurs avec un lavabo et une étagère<br />
� 1 passe-plat pour le petit matériel et les consommables<br />
� 2 pièces <strong>de</strong> stabulation : pour les souris transgéniques, (20 m 2 x 2)<br />
� 1 laboratoire d’expérimentation équipé <strong>de</strong> paillasses, <strong>de</strong> tables, d’un évier avec<br />
eau chau<strong>de</strong> et froi<strong>de</strong>, d’un congélateur/réfrigérateur, <strong>de</strong> meubles sous paillasse<br />
et d’un stéréomicroscope (21 m 2 )<br />
� 1 sas d’entrée <strong>de</strong> la zone souris nu<strong>de</strong>s avec une armoire (3,2 m 2 )<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> stabulation souris nu<strong>de</strong>s (10 m 2 )<br />
� 1 pièce d’expérimentation souris nu<strong>de</strong>s équipée d’une paillasse avec un évier,<br />
d’un meuble sous paillasse (6,3 m 2 )<br />
� 1 laverie équipée d’un bac <strong>de</strong> lavage alimenté en eau froi<strong>de</strong> et chau<strong>de</strong>, un<br />
autoclave à double entrée, d’armoires et <strong>de</strong> tables, d’un passe-plat<br />
� 1 pièce <strong>de</strong> stockage du matériel stérile (9 m 2 )<br />
� 1 sas <strong>de</strong> sortie <strong>de</strong>s opérateurs avec une douche et un lavabo (11m 2 )<br />
10
NIVEAU 5, BATIMENT B<br />
11
C – Une zone A2 ou Animalerie A2, bâtiment F<br />
Cette zone est réservée à l’hébergement <strong>de</strong> rat et souris inoculés par <strong>de</strong>s agents viraux<br />
<strong>de</strong> niveau <strong>de</strong> protection 2. En effet ces agents sont souvent utilisés comme traceur ou<br />
pour induire l'expression d'un gène exogène dans le système nerveux central.<br />
Cette zone est soumise à un gradient <strong>de</strong> dépression et s’étend sur 43.45m 2 constituée<br />
d’un sas (3.64m 2 ) et d’une pièce d’hébergement <strong>de</strong> 16.43m 2 contenant trois armoires<br />
ventilées elles mêmes en dépression. Cette pièce sert à la fois d’hébergement et<br />
d’expérimentation. Elle est équipée d’une hotte <strong>de</strong> change et d’un poste <strong>de</strong> sécurité<br />
microbiologique (PSM) dans lequel sont pratiquées toutes les inoculations et les<br />
manipulations <strong>de</strong>s animaux inoculés. Une pièce attenante au module A2 d’une<br />
superficie <strong>de</strong> 25.2 m 2 sert <strong>de</strong> stockage, d’autoclavage.<br />
12
Animalerie A2<br />
Bâtiment EF, niv2<br />
13
Pièce <strong>de</strong> stocakage et d’autoclavage(25.2 m 2)<br />
14<br />
Double sas(4.7 m2) Pi<br />
è<br />
c<br />
e<br />
d’<br />
h<br />
é<br />
b<br />
er<br />
g<br />
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m<br />
e<br />
nt<br />
(1<br />
6.<br />
4<br />
3<br />
m<br />
2)
D - Locaux du personnel<br />
1 – Aile Nord, 4ème étage<br />
� le bureau <strong>de</strong>s animaliers (14,5 m 2 )<br />
� 1 vestiaire homme avec une douche (9 m 2 )<br />
� 1 vestiaire femme avec douche (8 m 2 )<br />
� <strong>de</strong>s sanitaires (6,4 m 2 )<br />
2 – Aile Sud 4ème étage<br />
� le bureau <strong>de</strong> l’ingénieur (20 m 2 )<br />
� <strong>de</strong>s sanitaires (6,4 m 2 )<br />
L’ensemble <strong>de</strong>s locaux est ventilé et climatisé, équipé avec les dispositifs <strong>de</strong> sécurité imposés<br />
par la réglementation.<br />
15
II – PIECES D’EXPERIMENTATION DANS LES<br />
LABORATOIRES<br />
Pour chaque laboratoire, un plan <strong>de</strong> masse est présenté.<br />
1 - Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie- <strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong><br />
(<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
Pièce A327bis – Bâtiment A, 3ème étage : il s’agit d’une pièce utilisée pour les prélèvements<br />
<strong>de</strong> cerveaux embryonnaires ou d’hypophyses en vue <strong>de</strong> leur mise en culture. La pièce est<br />
climatisée et dispose <strong>de</strong> sol et murs lavables et d’un faux plafond. Elle est équipée d’une<br />
paillasse avec évier et d’une hotte à flux laminaire horizontal pour la dissection <strong>de</strong>s tissus<br />
embryonnaires.<br />
16
Pièce B214a – Bâtiment A, 2ème étage : cette pièce est réservée aux sacrifices par<br />
décapitation ou surdose <strong>de</strong> pentobarbital avant perfusion.<br />
Elle est équipée : d'un évier, <strong>de</strong> paillasses carrelées, <strong>de</strong> placards, d'une table métallique avec<br />
siphon sur laquelle sont généralement effectués les sacrifices et d'une table aspirante<br />
métallique sur laquelle sont faites les perfusions. Le sol est en tomettes lavables, les parois<br />
sont lavables et il y a un faux plafond lavable.<br />
Pièce F037 b – Bâtiment F, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce est utilisée pour <strong>de</strong>s prélèvements<br />
d’organes après anesthésie générale et perfusion..<br />
Elle est équipée d’une hotte aspirante avec paillasse en verre, d’une paillasse en verre avec un<br />
évier et d’une table pour dissection. Le sol est carrelé, les murs sont peints et lavables.<br />
Pièce F048 – Bâtiment F, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce est utilisée pour l’euthanasie <strong>de</strong>s<br />
animaux par décapitation et prélèvement d’organes pour <strong>de</strong>s étu<strong>de</strong>s électrophysiologiques.<br />
17
Elle est pourvue d’une paillasse en verre et un évier, murs et sol lavables et lessivables, elle<br />
est climatisée.<br />
Pièce F054 – Bâtiment F, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce est utilisée pour l’euthanasie <strong>de</strong>s<br />
souris par dislocation cervicale et prélèvement <strong>de</strong> l’intestin pour les étu<strong>de</strong>s mécanographiques<br />
(enregistrement <strong>de</strong> l’activité mécanique du tube digestif). Elle est pourvue d’une paillasse en<br />
verre et un évier, murs et sol lavables et lessivables, elle est climatisée.<br />
Pièce F059 – Bâtiment F, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce est utilisée pour une stabulation<br />
temporaire <strong>de</strong> 2 jours à une semaine.<br />
Elle est composée d’une paillasse en verre et d’un évier et d’une étagère. Le sol est carrelé<br />
ainsi que les <strong>de</strong>ux tiers inférieurs <strong>de</strong>s murs. Le tiers supérieur <strong>de</strong>s murs est peint et lavable. Il<br />
y a la présence d’un siphon au sol. La pièce est équipée d’une lumière à cycle jour/nuit <strong>de</strong><br />
12h/12h.<br />
18
Pièce F156/157 – Bâtiment F, 1 er étage : cette pièce sera utilisée pour le sacrifice <strong>de</strong>s animaux<br />
et prélèvement <strong>de</strong> tissus pour la culture cellulaire.<br />
Elle est équipée <strong>de</strong> paillasses carrelées, <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux éviers. Le sol est carrelé, les murs sont peints<br />
et lessivables. Présence d’un poste d’enregistrement d’électrophysiologie in vitro<br />
Pièce E 210 – Bâtiment E, 2ème étage : cette pièce est utilisée pour le maintien et<br />
l’observation à court terme (quelques heures) puis le sacrifice <strong>de</strong> souris après injection <strong>de</strong><br />
différentes substances.<br />
Cette pièce est équipée d’un évier, d’une paillasse carrelée, d’un plan <strong>de</strong> travail lavable, d’un<br />
sol carrelé et lavable, d’un faux plafond, <strong>de</strong> portoirs pour cages, <strong>de</strong> stores et d’un congélateur.<br />
Elle est aérée et climatisée.<br />
19
2 – Neurobiologie <strong>de</strong>s interactions cellulaires et neuropathologie UMR 6184<br />
avec trois équipes.<br />
Pièce A036 – Bâtiment A : cette pièce est utilisée pour l’anesthésie générale, perfusion et<br />
prélèvement <strong>de</strong> tissus pour procé<strong>de</strong>r à <strong>de</strong>s cultures cellulaires. Elle est pourvue <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux<br />
paillasses en verre et un évier, murs et sol lavables et lessivables, elle est climatisée. Elle<br />
contient une hotte et un poste <strong>de</strong> sécurité microbiologique.<br />
20
3 – Neurobiologie <strong>de</strong>s canaux ioniques UMR 641<br />
Pièce C009 – Bâtiment C, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce sert à l’anesthésie générale suivie<br />
d’euthanasie en vue <strong>de</strong> prélèvement d’organes. Il s’agit d’une pièce incluse dans le<br />
laboratoire. Le sol est recouvert <strong>de</strong> linoléum lavable, un évier est immédiatement attenant à la<br />
pièce.<br />
Pièce C011 – Bâtiment C, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce sert à l’anesthésie générale <strong>de</strong>s<br />
animaux suivie d’euthanasie par décapitation en vue <strong>de</strong> prélèvement d’organes pour <strong>de</strong>s<br />
étu<strong>de</strong>s biochimiques, <strong>de</strong>s mises en culture ou <strong>de</strong>s enregistrements électrophysiologiques d’une<br />
part, pour <strong>de</strong>s perfusions en vue d’étu<strong>de</strong>s histologiques d’autre part.<br />
Elle est équipée sur toute sa longueur opposée à la porte d’une paillasse constituée d’un plan<br />
<strong>de</strong> travail en mélaminé lavable reposant sur trois meubles sous paillasse, et comportant un<br />
21
évier <strong>de</strong>ux bacs alimenté en eau froi<strong>de</strong>. L’évier est surplombé d’un poste <strong>de</strong> distribution d’eau<br />
Millipore. Le mur attenant à la paillasse (longueur + retour gauche côté évier) est recouvert<br />
d’une plaque <strong>de</strong> protection en plastique lisse lavable <strong>de</strong> 1cm d’épaisseur et 62 cm <strong>de</strong> hauteur,<br />
jointoyé à la paillasse par du joint silicone. Le sol est recouvert <strong>de</strong> dalles plastiques.<br />
Elle est équipée d’un détecteur <strong>de</strong> fumée, d’un ban<strong>de</strong>au <strong>de</strong> prises au-<strong>de</strong>ssus <strong>de</strong> la paillasse.<br />
Contre le mur <strong>de</strong> gauche se trouve l’enceinte à solvants Captair pour les perfusions, équipée<br />
<strong>de</strong> filtres amovibles et d’un détecteur électronique <strong>de</strong> saturation ; lors <strong>de</strong>s prélèvements le bac<br />
à perfusion est placé dans l’enceinte et connecté à l’arrivée d’eau <strong>de</strong> l’évier pour réaliser un<br />
système <strong>de</strong> circulation d’eau en continu dans la partie du bac <strong>de</strong>stinée à recueillir les liqui<strong>de</strong>s<br />
<strong>de</strong> perfusion s’écoulant <strong>de</strong> l’animal (solution <strong>de</strong> Krebs-Heinsleit et solution <strong>de</strong><br />
paraformaldéhy<strong>de</strong>).<br />
Pièce 011<br />
Pièce 009<br />
Bâtiment C, niv0<br />
22
Pièce C118 – Bâtiment F, 1 er étage : cette pièce est utilisée pour l’euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
par décapitation après anesthésie générale à l’isoflurane. L’euthanasie est suivie <strong>de</strong><br />
prélèvement d’organe pour <strong>de</strong>s étu<strong>de</strong>s éléctrophysiologiques.<br />
La pièce est climatisée, pourvue <strong>de</strong> paillasse et d’un évier. Les murs et sols sont lavables.<br />
23
Pièce 118<br />
Bâtiment C, Niv 1<br />
24
4 – Physiologie et physiopathologie en conditions d’oxygénation extrêmes<br />
(P2COE) UMR MD2 avec <strong>de</strong>ux équipes.<br />
Pièce F013 – Bâtiment F, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce est utilisée pour <strong>de</strong>s étu<strong>de</strong>s <strong>de</strong><br />
sensibilité viscérale et somatique désoxy et/ou suractivité chez le rat.<br />
Elle est équipée d’un split système qui permet le conditionnement en température et<br />
l’extraction <strong>de</strong> l’air ambiant. Elle comprend <strong>de</strong>ux paillasses et un évier. Le sol (grès) et les<br />
murs sont lavables.<br />
Pièce F007 – Bâtiment F, rez-<strong>de</strong>-chaussée : cette pièce est <strong>de</strong>stinée à la stabulation <strong>de</strong>s<br />
animaux dans une chambre <strong>de</strong> conditionnement pouvant accueillir 10 à 12 rats. A l’intérieur<br />
<strong>de</strong> la chambre, l’atmosphère est contrôlée (analyse simultanée et permanente <strong>de</strong> la<br />
composition en oxygène et gaz carbonique, mesure <strong>de</strong> température et d’hygrométrie relative ;<br />
système <strong>de</strong> rétrocontrôle actif permettant d’ajuster la concentration fractionnaire d’oxygène<br />
(FIO2) à + 1% près et d’ouvrir la chambre à l’air ambiant par déclenchement d’une alarme<br />
basse (FIO2 < 9 %) ; absorption du CO2 produit par cartouches <strong>de</strong> chaux sodée ; absorption <strong>de</strong><br />
l’excès <strong>de</strong> vapeur d’eau par cartouches <strong>de</strong> silicagel.)<br />
Cette pièce est aussi équipée d’un tapis roulant à environnement hypoxique normobare.<br />
Elle comprend une paillasse carrelée et un évier (évacuation <strong>de</strong>s eaux usées <strong>de</strong> la chambre <strong>de</strong><br />
conditionnement). Le sol (grès) et les murs sont lavables. Elle est climatisée.<br />
25
Pièce A912 – Bâtiment A, sous-sol : cette pièce est utilisée pour les interventions<br />
chirurgicales sous anesthésie générale ou le sacrifice d'animaux soit par décapitation à la<br />
guillotine après anesthésie à l'halothane soit par injection <strong>de</strong> pentobarbital intracardiaque<br />
toujours après anesthésie à l'halothane.<br />
La pièce est climatisée et dispose d'un sol et <strong>de</strong> murs lavables. Elle est équipée <strong>de</strong> paillasses<br />
avec évier, <strong>de</strong> placards, d'une hotte aspirante.<br />
Pièce A909 – Bâtiment A, sous-sol : il s'agit d'une pièce utilisée pour l'expérimentation<br />
animale avec une enceinte hyperbare (Caisson 3), un tableau <strong>de</strong> comman<strong>de</strong> et <strong>de</strong>s bouteilles<br />
<strong>de</strong> gaz sous pression.<br />
La pièce est climatisée et dispose d'un sol et <strong>de</strong> murs lavables. Elle est équipée <strong>de</strong> paillasses,<br />
<strong>de</strong> placards. Cette pièce comprend <strong>de</strong>s appareils d'enregistrements <strong>de</strong> données et <strong>de</strong>s<br />
ordinateurs qui pilotent et contrôlent l'expérience et le recueil <strong>de</strong>s données.<br />
26
Pièce A905 – Bâtiment A, sous-sol : il s'agit d'une pièce utilisée pour l'expérimentation<br />
animale avec une enceinte hyperbare (Caisson 2) et <strong>de</strong>s bouteilles <strong>de</strong> gaz sous pression.<br />
La pièce dispose d'un sol et <strong>de</strong> murs lavables. Elle est équipée d'une paillasse avec éviers, <strong>de</strong><br />
placards, d'un tableau <strong>de</strong> comman<strong>de</strong> <strong>de</strong>s gaz, d'appareils d'enregistrements <strong>de</strong> données et<br />
d'ordinateurs qui pilotent et contrôlent l'expérience et le recueil <strong>de</strong>s données.<br />
Pièce A904 – Bâtiment A, sous-sol: Animalerie pour animaux chroniques : cette pièce est<br />
utilisée pour gar<strong>de</strong>r les animaux bio-instrumentés.<br />
La pièce est équipée d’enceintes en surpression type IFFA CREDO, d'une paillasse avec<br />
évier, d'un système <strong>de</strong> climatisation.<br />
Les murs sont peints avec une peinture lavable. Les parties du sol non carrelées sont peintes<br />
avec une peinture <strong>de</strong> sol lavable.<br />
Pièce A902 – Bâtiment A, sous-sol : il s'agit d'une pièce utilisée pour l'expérimentation<br />
animale avec une enceinte hyperbare (Caisson 1) et <strong>de</strong>s bouteilles <strong>de</strong> gaz sous pression.<br />
La pièce dispose d'un sol et <strong>de</strong> murs lavables; elle est équipée d'une paillasse, <strong>de</strong> placards.<br />
Cette salle comprend <strong>de</strong>s appareils d'enregistrements <strong>de</strong> données et <strong>de</strong>s ordinateurs qui<br />
pilotent et contrôlent l'expérience et le recueil <strong>de</strong>s données. Elle dispose en plus d'un box<br />
d'enregistrement <strong>de</strong> données électrophysiologiques en expérimentation aiguë ou chronique.<br />
27
Pièce 912 Pièce 909<br />
Pièce C008 – Bâtiment C, rez-<strong>de</strong>-chaussée : il s'agit d'une pièce utilisée pour<br />
l'expérimentation animale avec une enceinte hyperbare (Caisson 4).<br />
Les murs et le sol (revêtement plastique) sont lavables. La pièce est équipée d'une paillasse,<br />
<strong>de</strong> placards, d'un tableau <strong>de</strong> comman<strong>de</strong> <strong>de</strong>s gaz, d'appareils d'enregistrements <strong>de</strong> données et<br />
d'ordinateurs qui pilotent et contrôlent l'expérience et le recueil <strong>de</strong>s données.<br />
28<br />
Pièce 905<br />
Pièce 904<br />
Pièce 902<br />
Bâtiment AB, Niv -1
DOMAINES D’ACTIVITE, ESPECES ANIMALES<br />
UTILISEES ET JUSTIFICATIONS, LES<br />
PROTOCOLES SUR LES ANIMAUX ET LES<br />
FICHES N° 2<br />
Le centre <strong>de</strong> transgénèse est une animalerie commune mise à la disposition <strong>de</strong>s chercheurs,<br />
ingénieurs et techniciens et étudiants pratiquant l’expérimentation sur l’animal vivant dans le<br />
cadre <strong>de</strong> leur recherche sur le site <strong>de</strong> la faculté <strong>de</strong> mé<strong>de</strong>cine nord. Les laboratoires utilisateurs<br />
<strong>de</strong> l’animalerie sont :<br />
1 - Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie- <strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>)<br />
<strong>UMR6231</strong> avec huit équipes <strong>de</strong> recherche.<br />
2 – Neurobiologie <strong>de</strong>s interactions cellulaires et neuropathologie UMR 6184 avec trois<br />
équipes.<br />
3 – Neurobiologie <strong>de</strong>s canaux ioniques UMR 641 avec trois équipes.<br />
4 – Physiologie et physiopathologie en conditions d’oxygénation extrêmes (P2COE)<br />
UMR MD2 avec <strong>de</strong>ux équipes.<br />
5 – Neuron Experts une entreprise privée<br />
Dans ce qui suit, nous allons décliner par laboratoire et par équipe successivement : le<br />
domaine d’activité et sa justification, les espèces animales utilisées et justification, les<br />
protocoles sur les animaux et enfin le personnel expérimentateur.<br />
30
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 1<br />
Intitulé : Signalling in Neuroendocrine Tumors (SIGNET)<br />
Responsable : Dr. Anne BARLIER<br />
31
Intitulé : Signalling in Neuroendocrine Tumors (SIGNET)<br />
Responsable : Dr. Anne BARLIER<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Léquipe s’attache à mieux comprendre la tumorigenèse <strong>de</strong>s tumeurs neuroendocrines et en<br />
particulier <strong>de</strong>s tumeurs hypophysaires. Les chercheurs s’intéressent à la signalisation<br />
intracellulaire pour mieux comprendre quels sont les réseaux complexes <strong>de</strong> signalisation qui<br />
permettent le contrôle, <strong>de</strong> manière extrêmement fine et adaptative au contexte<br />
environnemental, <strong>de</strong> la sécrétion hormonale et comment une dérégulation <strong>de</strong> cette<br />
signalisation intervient dans la tumorigènese et dans les résistances aux thérapeutiques<br />
actuelles par les analogues <strong>de</strong> la somatostatine et <strong>de</strong> la dopamine.<br />
Dans l’objectif d’établir <strong>de</strong> nouvelles stratégies thérapeutiques, l’équipe a développé un<br />
modèle <strong>de</strong> xénogreffes <strong>de</strong> tumeurs neuroendocrines sur <strong>de</strong>s souris immuno-déficientes afin<br />
d’évaluer l’efficacité <strong>de</strong> nouvelles molécules pharmacologiques sur la croissance tumorale et<br />
l’hypersécrétion hormonales d’origine tumorale.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
� Des souris nu<strong>de</strong>s sont utilisées pour pratiquer <strong>de</strong>s xénogreffes <strong>de</strong>s cellules murines<br />
hypophysaires du fait <strong>de</strong> leur immuno déficience.<br />
� Souris transgéniques<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane (poste d’anesthésie gazeuse) et reçoivent en sous<br />
cutané 200 microlitres d’une solution contenant ou non 2 millions <strong>de</strong> cellules tumorales<br />
hypophysaires murines pour induire l’apparition d’une tumeur. Deux jours après, les animaux<br />
sont à nouveau anesthésiés (anesthésie gazeuse). On fait une petite incision <strong>de</strong> la peau, au<br />
niveau du flanc où les cellules ont été injectées. On introduit sous la peau, une micropompe<br />
osmotique contenant la substance à étudier, à proximité <strong>de</strong>s cellules. La micropompe perfuse<br />
la substance jusqu’au, jour du sacrifice (14 e jour). Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane,<br />
32
tous les 2-3 jours, pendant 3 minutes, le temps nécessaire pour examiner et mesurer la tumeur<br />
induite, à l’ai<strong>de</strong> d’un poste d’imagerie <strong>de</strong> fluorescence du petit animal. A la fin <strong>de</strong><br />
l’expérience les animaux sont euthanasiés (anesthésie puis décapitation) pour le prélèvement<br />
du sang et <strong>de</strong> la tumeur.<br />
Pendant ces 14 jours post greffe, les animaux sont observés quotidiennement. Cette<br />
inoculation <strong>de</strong> cellules tumorales n’engendre aucune souffrance apparente. Bien évi<strong>de</strong>mment<br />
la mise en place <strong>de</strong> pompe osmotique est un acte chirurgical pratiqué par le membre le plus<br />
compétent <strong>de</strong> l’équipe en matière d’expérimentation animale et autorisé à faire <strong>de</strong> la<br />
chirurgie : Dr. Ramehefarizo RASOLONJANAHARY.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Ramehefarizo RASOLONJANAHARY N° d’autorisation : 13-95 (renouvellement en<br />
cours)<br />
Corinne GERARD N° d’autorisation : 13-103 (renouvellement en cours)<br />
Sylvie THIRION N° d’autorisation : 13-180 (renouvellement en cours)<br />
Cathy ROCHE (inscrite en formation <strong>de</strong> niveau1)<br />
Christophe LISBONIS (inscrit en formation <strong>de</strong> niveau2)<br />
33
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s<br />
animaux en vue<br />
d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les<br />
décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane (poste d’anésthesie gazeuse), tous les trois jours, pendant 2-3<br />
minutes, le temps nécessaire pour examiner et mesurer la tumeur induite, à l’ai<strong>de</strong> d’un poste d’imagerie<br />
<strong>de</strong> fluorescence du petit animal.<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
Les souris sont anesthésiées à l’isoflurane et reçoivent en sous cutané 200 microlitres d’une solution<br />
contenant ou non 2 millions <strong>de</strong> cellules tumorales hypophysaires murines pour induire l’apparition d’une<br />
tumeur. Deux jours après, les animaux sont à nouveau anesthésiés. On fait une petite incision <strong>de</strong> la peau<br />
au niveau du flanc où les cellules ont été injectées. On introduit sous la peau, une micropompe osmotique<br />
contenant la substance à étudier et ceci à proximité <strong>de</strong>s cellules. La micropompe perfuse la substance<br />
jusqu’au jour du sacrifice (14 e jour). Les animaux sont euthanasiés et on prélève la tumeur après incision<br />
<strong>de</strong> la peau<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
35
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 2<br />
Intitulé : Interactions neuroimmunes et pathologies du système<br />
nerveux<br />
Responsable : Dr. José BOUCRAUT<br />
36
Intitulé : Interactions neuroimmunes et pathologies du système nerveux<br />
Responsable : Dr. José BOUCRAUT<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Toutes les pathologies du système nerveux sont caractérisées par <strong>de</strong>s processus <strong>de</strong> neuro-<br />
inflammation associant réaction astrogliale et microgliale et infiltration <strong>de</strong> cellules immunes.<br />
Les mécanismes <strong>de</strong> recrutement <strong>de</strong> cellules immunes et les caractéristiques <strong>de</strong>s cellules<br />
immunes recrutées sont encore très mal connus.<br />
L’objectif premier est <strong>de</strong> caractériser cette neuro-inflammation, et notamment les cellules<br />
immunes recrutées dans <strong>de</strong>s modèles soit d’agression auto-immune du système nerveux, soit<br />
<strong>de</strong> neurogénérescence ou la neuro-inflammation « suit » la perte neuronale.<br />
Il était classiquement considéré que cette inflammation jouait <strong>de</strong>s rôles délétères. En fait, on<br />
confère à certaines populations immunes recrutées, <strong>de</strong>s rôles neuroprotecteurs. Ce serait le cas<br />
notamment d’effecteurs <strong>de</strong> l’immunité innée, comme les NK, les NKT et les monocytes.<br />
Le <strong>de</strong>uxième objectif est <strong>de</strong> prouver ce concept en manipulant ou déplétant ces populations in<br />
vivo et en utilisant <strong>de</strong>s modèles <strong>de</strong> culture et <strong>de</strong> co-culture <strong>de</strong> cellules immunes et <strong>de</strong> cellules<br />
neurales in vitro.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
� espèce : souris<br />
� souris <strong>de</strong> souche C57BL/6, B6/SJL ou 129sv contrôles ou transgéniques ou KO pour<br />
certains gènes d’intérêt<br />
� Souris transgéniques SOD1, modèle <strong>de</strong> sclérose latérale amyotrophique.<br />
� Souris NKp46 YFP : suivi <strong>de</strong>s populations Natural Killer.<br />
� Souris EDG8 : souris déficientes dans un récepteur qui contrôle la circulation <strong>de</strong>s<br />
cellules NK.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Induction d'une maladie expérimentale, encéphalite auto-immune expérimentale<br />
37
(EAE) par injection <strong>de</strong> pepti<strong>de</strong> encéphalitogène en 2 injections sous-cutanées dans les<br />
flancs. La pathologie se caractérise par une paralysie d’évolution postéro antérieure<br />
jusqu’à, dans les formes les plus graves, une paralysie complète <strong>de</strong>s membres postérieurs<br />
vers J16-18. Cette phase dite aiguë est suivie d’une phase chronique avec une atteinte<br />
moins grave <strong>de</strong> type faiblesse du train postérieur.<br />
� Ablation chimique <strong>de</strong>s neurones olfactifs par injection d’un herbici<strong>de</strong>, le dichlobenil<br />
� Etu<strong>de</strong> du comportement.<br />
Suivi du poids et du score <strong>de</strong> paralysie par une simple analyse clinique, visuelle et<br />
manuelle, sans appareillage<br />
� Injection <strong>de</strong> drogues et <strong>de</strong> cellules i.p ou i.v<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> tissus après euthanasie.<br />
� L’anesthésie au pentobarbital injecté par voie i.p. suivie ou non d’une<br />
Perfusion intracardiaque au PBS froid ou au PBS PFA4% pour respectivement analyse<br />
<strong>de</strong>s tissus nerveux pour dissociation et analyse en cytométrie en flux, microdissection pour<br />
analyse en qPCR et analyse en immunohistologie<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> sang. Par la technique <strong>de</strong> prélèvement rétro-orbital avec un capillaire<br />
hépariné après une anesthésie légère et brève à l’halothane<br />
� Culture <strong>de</strong> cellules : soit à partir <strong>de</strong> souriceaux nouveaux-nés, soit à partir d’embryon,<br />
soit à partir <strong>de</strong> souris adultes en fonction <strong>de</strong>s types cellulaires.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Gilda RAGUENEZ N° d’autorisation : 04882(<strong>de</strong>man<strong>de</strong> <strong>de</strong> transfert et <strong>de</strong> renouvellement en<br />
cours)<br />
Florence PELLETIER, titulaire d’un niveau 2<br />
Natalia POPA, titulaire d’un niveau 2 et inscrite en formation <strong>de</strong> niveau 1<br />
El Cherif IBRAHIM, N° d’autorisation : 13-252 (renouvellement en cours)<br />
38
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p a<br />
Cadre réservé à<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o u<br />
l’Administration i i a r t u t b m m t p r t v i r p u i t p o e n t i t<br />
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Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
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décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
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Tourner la feuille SVP �<br />
39
Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
40
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 3<br />
Intitulé : Rôles <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> transcription et les gènes horloges<br />
dans la pathophysiologie <strong>de</strong> l'hypophyse<br />
Responsable : Dr. Jean-Paul HERMAN et Dr. Thierry BRUE<br />
41
Intitulé : Rôles <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> transcription et les gènes horloges dans la<br />
pathophysiologie <strong>de</strong> l'hypophyse<br />
Responsable : Dr. Jean-Paul HERMAN et Dr. Thierry BRUE<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
La thématique générale <strong>de</strong> l’équipe est définie par l'intitulé <strong>de</strong> l'équipe. Plus précisément, elle<br />
abor<strong>de</strong> trois questions. 1) Quels sont les mécanismes moléculaires <strong>de</strong> déficit hypophysaire<br />
d'origine génétique chez l'homme et, plus particulièrement, l'implication <strong>de</strong> mutations <strong>de</strong><br />
facteurs <strong>de</strong> transcription hypophysaires. L'approche <strong>de</strong> cette question n'implique pas<br />
l'utilisation <strong>de</strong> modèles animaux. 2) Quels sont les rôles physiologiques, non-<br />
développementaux, <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux facteurs hypophysaires, POU1F1/PIT-1 et PITX2. Cette question<br />
est étudiée en partie à travers l'utilisation <strong>de</strong> modèles animaux transgéniques que l’équipe a<br />
développés. 3) Quels sont les mécanismes moléculaires, transcriptionnels, <strong>de</strong> la rythmicité <strong>de</strong><br />
l'expression <strong>de</strong> certains gènes, notamment <strong>de</strong> la prolactine. Certains aspects <strong>de</strong> cette question<br />
<strong>de</strong>man<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> mesurer <strong>de</strong>s paramètres biochimiques dans l'hypophyse, donc l'utilisation<br />
d'animaux.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
L’espèce utilisée est la souris.<br />
Il s'agit essentiellement <strong>de</strong> modèles transgéniques, établis en partie au laboratoire, permettant<br />
<strong>de</strong> tester le rôle <strong>de</strong> certains facteurs <strong>de</strong> transcription (POU1F1/PIT1, PITX2) dans la<br />
différentiation et la physiologie <strong>de</strong> l'hypophyse, problématique qui ne peut pas être abordée<br />
autrement que par ces modèles.<br />
L'évaluation <strong>de</strong> paramètres moléculaires/physiologiques in vivo <strong>de</strong>man<strong>de</strong> également le<br />
prélèvement d'organes chez l'animal.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� -Anesthésie à l’ai<strong>de</strong> du mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg suivie <strong>de</strong><br />
perfusion intracardiaque d'un fixateur. Prélèvement <strong>de</strong> différents organes en vue<br />
d'examens histologiques.<br />
42
� -Euthanasie à l’ai<strong>de</strong> du dioxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> carbone (CO2) suivie <strong>de</strong> prélèvement <strong>de</strong> différents<br />
organes en vue <strong>de</strong> dosage biochimiques.<br />
� Anesthésie à l’ai<strong>de</strong> du mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg et<br />
implantation chirurgicale <strong>de</strong> cathéters jugulaires ou carotidiens chroniques.<br />
Prélèvements sanguins répétés sur l'animal éveillé et libre <strong>de</strong> ses mouvements.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Jean-Paul HERMAN, N° d’autorisation : 13-50<br />
Denis BECQUET, N° d’autorisation : 13-002<br />
Anne-Marie FRANCOIS BELLAN, N° d’autorisation : 13-197<br />
Marie-Hélène QUENTIEN, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Séverine GUILHEM, titulaire d’un niveau 2<br />
Nicolas JULIEN, titulaire d’un niveau 2<br />
Mathias MORENO, titulaire d’un niveau 2<br />
43
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
Cadre réservé à<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o<br />
l’Administration i i a r t u t b m m t p r t v i r p u i t p o e n t i<br />
m e t e r r a s s r i b r i n c r i l r t l u o r s<br />
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Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
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Tourner la feuille SVP �<br />
44<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
Anesthésie à l’ai<strong>de</strong> du mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg et<br />
implantation chirurgicale <strong>de</strong> cathéters jugulaires ou carotidiens chroniques.<br />
Prélèvements sanguins répétés sur l'animal éveillé et libre <strong>de</strong> ses mouvements.<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
45
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 4<br />
Intitulé : Canaux ioniques et Transduction sensorielle<br />
Responsable : Dr. Patrick DELMAS<br />
46
Intitulé : Canaux ioniques et Transduction sensorielle<br />
Responsable : Dr. Patrick DELMAS<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
L’équipe « Canaux ioniques et Transduction sensorielle » cherche à i<strong>de</strong>ntifier les processus<br />
cellulaires et moléculaires nécessaires au codage neuronal <strong>de</strong>s informations sensitives et<br />
douloureuses. Nous travaillons autour <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux axes principaux.<br />
Le premier axe se concentre sur le canal sodium Nav1.9, atypique autant par ses propriétés<br />
électrophysiologiques que par sa localisation. Son expression est restreinte aux neurones<br />
nociceptifs <strong>de</strong>s ganglions dorso-rachidiens et aux neurones entériques (situés dans le tube<br />
digestif). L’activité <strong>de</strong> ce canal est régulée par les facteurs <strong>de</strong> l’inflammation et l’ensemble <strong>de</strong><br />
ses propriétés laisse à penser qu’il agit en optimisant la détection <strong>de</strong> la douleur. Le but <strong>de</strong> nos<br />
travaux est d’associer <strong>de</strong>s approches moléculaires, cellulaires et comportementales afin <strong>de</strong><br />
démontrer le rôle central du canal Nav1.9 dans les mécanismes d’hyperexcitabilité neuronale<br />
à la base <strong>de</strong> la physiopathologie <strong>de</strong>s douleurs chroniques.<br />
Le <strong>de</strong>uxième axe <strong>de</strong> recherche <strong>de</strong> l’équipe se focalise sur les acteurs moléculaires et<br />
cellulaires <strong>de</strong> la mécanosensation chez les mammifères. Deux étu<strong>de</strong>s sont menées en<br />
parallèle. L’une cherche à i<strong>de</strong>ntifier, par l’utilisation <strong>de</strong> souris transgéniques, et comprendre le<br />
fonctionnement <strong>de</strong>s acteurs moléculaires <strong>de</strong> la mécanosensation dans les ganglions dorso-<br />
rachidiens. La <strong>de</strong>uxième étu<strong>de</strong> s’intéresse au rôle <strong>de</strong>s cellules <strong>de</strong> Merkel dans les propriétés<br />
sensitives <strong>de</strong> la peau humaine.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Souris : Du fait <strong>de</strong> la disponibilité <strong>de</strong> nombreux modèles génétiquement modifiés<br />
(invalidation <strong>de</strong> gènes d’intérêt ou expression <strong>de</strong> nouveaux gènes), la souris est l’espèce la<br />
plus utilisée dans l’équipe.<br />
Rat : Cette espèce constituait un modèle <strong>de</strong> choix avant l’avènement <strong>de</strong>s souris transgéniques.<br />
Il est encore un peu utilisé car bien connu.<br />
Cobaye : Cet animal constitue le modèle historique pour l’étu<strong>de</strong> du système nerveux<br />
entérique. Les connaissances engrangées et une accessibilité aisée <strong>de</strong>s neurones entériques<br />
chez le cobaye font que cette espèce est encore très largement utilisée dans ce domaine.<br />
47
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Prélèvement d’organes après euthanasie : pour toutes les espèces utilisées, les<br />
animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (anesthésie gazeuse) avant euthanasie par<br />
exsanguination ou décapitation. Les organes d’intérêt sont ensuite prélevés.<br />
� Chirurgie et administration <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés : ouverture <strong>de</strong><br />
la boîte crânienne sur <strong>de</strong>s rats et souris sous anesthésie gazeuse (isoflurane) pour<br />
injection dans les méninges <strong>de</strong> marqueurs neuronaux rétrogra<strong>de</strong>s.<br />
� Administration <strong>de</strong> substances sur animaux vigiles (voir déclaration protocoles<br />
douloureux) : plusieurs substances sont administrées <strong>de</strong> manière chronique<br />
(oxaliplatine) ou phasique (caragénine) chez <strong>de</strong>s rats et <strong>de</strong>s souris. Ces animaux<br />
constituent <strong>de</strong>s modèles <strong>de</strong> douleurs inflammatoires ou chimio-induites. Cette douleur<br />
est ensuite régulièrement testée dans <strong>de</strong>s tests comportementaux (nociception<br />
mécanique, thermique) dans <strong>de</strong>s conditions contrôles et lors d’applications <strong>de</strong><br />
molécules pouvant modifier cette réaction douloureuse.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Marcel CREST, N° d’autorisation : 13-244 (renouvellement en cours)<br />
Bruno MAZET, N° d’autorisation : 13-262<br />
François MAINGRET, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Françoise PADILLA, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Nancy OSORIO, N° d’autorisation : 13-254<br />
Lise RODAT-DESPOIX N° d’autorisation : 13-365<br />
48
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
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Tourner la feuille SVP �<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
Injection <strong>de</strong> marqueurs au niveau <strong>de</strong>s méninges (sous anesthésie gazeuse par Isoflurane,<br />
rat/souris):<br />
La peau <strong>de</strong> l’animal est incisée au niveau <strong>de</strong> la boite crânienne. Une trépanation <strong>de</strong> la<br />
boite crânienne à l’ai<strong>de</strong> d’une fraise <strong>de</strong> <strong>de</strong>ntiste (1mm x 1 mm) est pratiquée pour avoir<br />
accès aux méninges et à la couche externe <strong>de</strong> la dure mère. Le traceur fluorescent<br />
rétrogra<strong>de</strong> (Neurotrace DiI tissu labeling paste, Invitrogen) est déposé au niveau <strong>de</strong> la<br />
dure mère. L’os <strong>de</strong> la boite crânienne est remis en place et la peau suturée. L’animal est<br />
enfin replacé dans sa cage sous lampe chauffante jusqu’au réveil.<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
50
Déclaration <strong>de</strong> protocoles douloureux<br />
PROTOCOLE 1<br />
DECLARATION DE PROTOCOLES DOULOUREUX OU SUSCEPTIBLES<br />
D’ENGENDRER LA DOULEUR SUR ANIMAUX VIVANTS<br />
Article R214-91 Co<strong>de</strong> rural<br />
Nom et Prénom : Rodat-Despoix Lise<br />
Gra<strong>de</strong> :<br />
Fonction : Chercheur non statutaire<br />
IDENTIFICATION DU DEMANDEUR :<br />
Autorisation d’expérimenter sur animaux vivants : n°: 13.365<br />
Autorisation <strong>de</strong> protocole douloureux : n°16-13122010<br />
IDENTIFICATION DE L’ETABLISSEMENT D’EXPERIMENTATION ANIMALE<br />
Agrément <strong>de</strong>s locaux d'expérimentation : N° C 13-055-8 Date <strong>de</strong> notification : 30/01/07<br />
INFORMATION CONCERNANT LE PROTOCOLE EXPERIMENTAL<br />
Intitulé : Rôle <strong>de</strong> la polycystine 1 et du canal TRPA1 dans les douleurs<br />
neuropathiques chimio-induites<br />
Date prévue pour le début <strong>de</strong> la mise en œuvre du protocole : 01/01/2011<br />
Date prévue pour la fin <strong>de</strong> l'expérimentation : 01/01/2012<br />
Objectifs et retombées attendues : L’objectif <strong>de</strong> cette étu<strong>de</strong> est d’étudier l’allodynie mécanique et<br />
thermique induite par un traitement à un agent anticancéreux<br />
: l’oxaliplatine.<br />
L’originalité <strong>de</strong> notre protocole est d’investiguer le rôle <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>ux protéines (PC1 et TRPA1) dans ces mécanismes<br />
d’allodynie, afin <strong>de</strong> pouvoir à terme en faire <strong>de</strong>s cibles<br />
thérapeutiques dans le traitement <strong>de</strong>s neuropathies<br />
douloureuses chimio-induites.<br />
Techniques expérimentales utilisées :<br />
- Injections : Injection intrapéritonéale unique d’oxaliplatine (3 mg/kg)<br />
diluée dans une solution glucosée à 5% ou d’un volume<br />
équivalent <strong>de</strong> solution saline. Les souris sont ensuite<br />
phénotypées pendant 3 semaines, tous les jours la<br />
première semaine puis tous les <strong>de</strong>ux jours les <strong>de</strong>ux<br />
suivantes. Durant toute la durée du test, l’animal est sous<br />
surveillance. A la fin du test l’animal est sacrifié.<br />
51
- Test <strong>de</strong> Von Frey : Test qui permet <strong>de</strong> mesurer le seuil <strong>de</strong> tolérance à la<br />
douleur. L’animal est placé dans une cage en plexiglas<br />
posée sur une surface grillagée surélevée. On applique sur<br />
la surface plantaire <strong>de</strong> la patte arrière injectée <strong>de</strong>s filaments<br />
ayant une force <strong>de</strong> pression croissante, jusqu’à la pression<br />
qui entraine le réflexe <strong>de</strong> retrait <strong>de</strong> la patte. Cette pression<br />
représente le seuil <strong>de</strong> tolérance <strong>de</strong> l’animal. Le filament<br />
ayant provoqué le retrait <strong>de</strong> la patte est testé 3 fois à 10-15<br />
minutes d’intervalle pour confirmer le test. Durant toute la<br />
durée du test, l’animal est sous surveillance et à aucun<br />
moment son comportement n’est modifié (toilettage, activité<br />
locomotrice, activité d’exploration).<br />
- Test <strong>de</strong> cold plate / hot plate : Test qui mesure la latence <strong>de</strong> réaction <strong>de</strong> l’animal à une<br />
stimulation thermique d’intensité constante. La souris est<br />
placée sur une surface métallique dont la température est<br />
fixée (<strong>de</strong> 15°C à -4°C pour les températures froi<strong>de</strong>s, à 54°C<br />
pour les températures chau<strong>de</strong>s). Nous mesurons le temps<br />
nécessaire pour que l’animal cherche à échapper à cette<br />
stimulation thermique en sautant <strong>de</strong> la plaque. Les animaux<br />
ne présentant aucun comportement <strong>de</strong> fuite sont retirés <strong>de</strong><br />
la plaque au bout <strong>de</strong> 60 secon<strong>de</strong>s.<br />
Existe-t-il <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s alternatives pour réaliser ce travail : Si OUI justifiez leur non<br />
utilisation :<br />
NON<br />
Espèces animales qui seront utilisées :<br />
Souris (C57BL6, TRPA1 KO, PC1 KO conditionnel)<br />
Justifiez le choix <strong>de</strong> l'espèce animale et le nombre d'animaux utilisés :<br />
Nous utilisons la souris, car nous possédons <strong>de</strong>s lignées <strong>de</strong> souris KO conditionnel pour la<br />
polycystine 1 (PC1) ainsi que <strong>de</strong>s souris knock-out pour le canal TRPA1. Selon la<br />
reproductibilité <strong>de</strong>s résultats pour chaque condition, nous estimons qu’il faudra 15 à 20 souris<br />
mâles par condition (saline ou oxaliplatine) et par lignée <strong>de</strong> souris, soit un total <strong>de</strong> 90 à 120<br />
souris.<br />
Procédures <strong>de</strong> gestion <strong>de</strong> la douleur et moyens mis en œuvre pour gérer la souffrance : (joindre les<br />
procédures validées à cette <strong>de</strong>man<strong>de</strong>) :<br />
- Nous ne pouvons pas gérer la souffrance, car elle fait l’objet <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong>. Toutefois, nous<br />
minimisons la durée <strong>de</strong> temps dont l’animal fera face à la douleur et continuons notre étu<strong>de</strong><br />
par <strong>de</strong>s expérimentations in vitro.<br />
- L’intensité <strong>de</strong> la douleur est mesurée par le test <strong>de</strong> Von Frey et <strong>de</strong> Cold/Hot plate.<br />
- Si les animaux présentent <strong>de</strong>s signes cliniques manifestes <strong>de</strong> souffrance (tels que la perte <strong>de</strong><br />
poids, une érection pileuse ou un engourdissement/paralysie <strong>de</strong>s membres postérieurs), la dose<br />
52
d’oxaliplatine injectée sera réduite jusqu’à obtenir un modèle animal <strong>de</strong> souffrance induite<br />
acceptable.<br />
Le signataire (nom, date et signature)<br />
Nom du responsable du protocole : Lise Rodat-Despoix<br />
Date : 06/10/2011<br />
Liste <strong>de</strong>s documents joints à cette <strong>de</strong>man<strong>de</strong> : Articles <strong>de</strong> référence<br />
Le cas échéant, réponse et avis motivé du comité régional d’éthique en expérimentation<br />
animale :<br />
Récépissé <strong>de</strong> déclaration du directeur départemental <strong>de</strong>s services vétérinaires adressé le :<br />
53
PROTOCOLE 2<br />
DECLARATION DE PROTOCOLES DOULOUREUX OU SUSCEPTIBLES<br />
D’ENGENDRER LA DOULEUR SUR ANIMAUX VIVANTS<br />
Article R214-91 Co<strong>de</strong> rural<br />
Nom et Prénom : Françoise PADILLA<br />
Gra<strong>de</strong> :<br />
Fonction : Ingénieur d’étu<strong>de</strong>s<br />
IDENTIFICATION DU DEMANDEUR :<br />
Autorisation d’expérimenter sur animaux vivants : En cours<br />
IDENTIFICATION DE L’ETABLISSEMENT D’EXPERIMENTATION ANIMALE<br />
Agrément <strong>de</strong>s locaux d'expérimentation : N° C 13-055-8 Date <strong>de</strong> notification : 30/01/07<br />
INFORMATION CONCERNANT LE PROTOCOLE EXPERIMENTAL<br />
Intitulé : Etu<strong>de</strong> du rôle du canal sodique NaV1.9 dans les douleurs aiguës et chroniques<br />
Date prévue pour le début <strong>de</strong> la mise en œuvre du protocole : 01/10/2011<br />
Date prévue pour la fin <strong>de</strong> l'expérimentation : 01/10/2012<br />
Objectifs et retombées attendues :<br />
L’objectif <strong>de</strong> cette étu<strong>de</strong> est <strong>de</strong> comprendre les mécanismes d'action du canal<br />
sodique NaV1.9 est dans la sensation douloureuse à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> modèle <strong>de</strong><br />
douleur aiguë (test à la formaline et modèle <strong>de</strong> la carragénine) et <strong>de</strong> douleur<br />
chronique (monoarthrite rhumatoï<strong>de</strong>). Dans cette étu<strong>de</strong> nous comparons les<br />
seuils d’allodynie mécanique avec le test <strong>de</strong> Von Frey sur <strong>de</strong>s souris sauvages<br />
versus <strong>de</strong>s souris knock-out pour le canal NaV1.9.<br />
Techniques expérimentales utilisées :<br />
- Test <strong>de</strong> Von Frey : Test qui permet <strong>de</strong> mesurer le seuil <strong>de</strong> tolérance à la douleur. L’animal<br />
est placé dans une cage en plexiglass posée sur une surface grillagée<br />
surélevée. On applique sur la surface plantaire <strong>de</strong> la patte arrière<br />
injectée <strong>de</strong>s filaments ayant une force <strong>de</strong> pression croissante, jusqu’à<br />
la pression qui entraine le réflexe <strong>de</strong> retrait <strong>de</strong> la patte. Cette pression<br />
représente le seuil <strong>de</strong> tolérance <strong>de</strong> l’animal. Le filament ayant<br />
provoqué le retrait <strong>de</strong> la patte est testé 3 fois à 3-5 secon<strong>de</strong>s<br />
d’intervalle pour confirmer le test. Durant toute la durée du test,<br />
l’animal est sous surveillance et à aucun moment son comportement<br />
n’est modifié (toilettage, activité locomotrice, activité d’exploration).<br />
54
- Modèle carragénine :<br />
Injection <strong>de</strong> 20µl <strong>de</strong> 3% <strong>de</strong> carragénine dans du sérum physiologique<br />
stérile. La carragénine est polysacchari<strong>de</strong> issu d’algues rouges, utilisé<br />
comme épaississant dans l’industrie agro-alimentaire. En injection<br />
intra-plantaire à une concentration <strong>de</strong> 3%, la carragénine provoque<br />
une douleur aiguë (sans léchage spontané <strong>de</strong> la patte injectée) avec<br />
un pic douloureux 8-10h après l’injection et qui se résorbe au bout <strong>de</strong><br />
48-72h. Le seuil douloureux est mesuré à 8, 16 ou 24h à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
filaments <strong>de</strong> Von Frey. Les animaux sont ensuite sacrifiés. Les<br />
ganglions rachidiens L3, L4 et L5 ipsilatéraux sont prélevés dans <strong>de</strong><br />
but <strong>de</strong> mettre en culture les neurones sensitifs qui innervent la patte<br />
injectée (pour mesurer <strong>de</strong> l’activité du canal par <strong>de</strong>s enregistrements<br />
électrophysiologiques) ou <strong>de</strong> faire <strong>de</strong>s coupes <strong>de</strong> tissus (marquage<br />
immunologique). A aucun moment le comportement <strong>de</strong> l’animal est<br />
affecté (toilettage, activité locomotrice, activité d’exploration).<br />
- Modèle <strong>de</strong> monoarthrite rhumatoï<strong>de</strong> :<br />
Injection péri-articulaire sous anesthésie <strong>de</strong> 30µl (2x15µl) d’adjuvant<br />
complet <strong>de</strong> freud à la cheville <strong>de</strong> la patte arrière. L’adjuvant <strong>de</strong> freud<br />
provoque une réaction inflammatoire qui va entrainer une douleur<br />
chronique, puisque la douleur va persister dans le temps. Le pic<br />
douloureux se situe 3 jours après l’injection. Le seuil douloureux est<br />
mesuré à 10 jours par le test <strong>de</strong> Von Frey. Les animaux sont ensuite<br />
sacrifiés. Les ganglions rachidiens L3, L4 et L5 ipsilatéraux sont<br />
prélevés dans <strong>de</strong> but <strong>de</strong> mettre en culture les neurones sensitifs qui<br />
innervent la patte (pour mesurer <strong>de</strong> l’activité du canal par <strong>de</strong>s<br />
enregistrements électrophysiologiques) ou <strong>de</strong> faire <strong>de</strong>s coupes <strong>de</strong><br />
tissus (marquage immunologique). A aucun moment le comportement<br />
<strong>de</strong> l’animal est affecté (toilettage, activité locomotrice, activité<br />
d’exploration).<br />
Existe-t-il <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s alternatives pour réaliser ce travail : Si OUI justifiez leur non<br />
utilisation :<br />
NON<br />
Espèces animales qui seront utilisées :<br />
souris (C57BL6, NaV1.9 KO)<br />
Justifiez le choix <strong>de</strong> l'espèce animale et le nombre d'animaux utilisés :<br />
Nous utilisons la souris, car nous possédons une souris knock-out pour le canal NaV1.9.<br />
Pour les modèles carragénine et monoarthrite rhumatoï<strong>de</strong> : pour les cultures <strong>de</strong> neurones, 3<br />
ganglions sont prélevés par animal et 15 ganglions sont nécessaires pour la mise en culture,<br />
donc 5 animaux par culture. Un N=6-10 est nécessaire dans chaque condition (sauvage et<br />
transgénique, carragénine et monoarthrite rhumatoï<strong>de</strong>). Pour l’immunohistochimie nous auront<br />
besoin d’environ 10 souris par condition. Par conséquent, nous aurons besoin d’environ 70-<br />
110 souris sauvages et 70-110 souris transgéniques.<br />
55
Procédures <strong>de</strong> gestion <strong>de</strong> la douleur et moyens mis en œuvre pour gérer la souffrance : (joindre les<br />
procédures validées à cette <strong>de</strong>man<strong>de</strong>) :<br />
- Nous ne pouvons pas gérer la souffrance, car elle fait l’objet <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong>. Toutefois, nous<br />
minimisons la durée <strong>de</strong> temps dont l’animal fera face à la douleur et continuons notre étu<strong>de</strong><br />
par <strong>de</strong>s expérimentations in vitro.<br />
- L’intensité <strong>de</strong> la douleur est mesurée par le test <strong>de</strong> Von Frey<br />
- L’animal est euthanasié en cours <strong>de</strong> protocole s’il y a présence <strong>de</strong> blessures autres que les sites<br />
d’injection et s’il y a présence d’infection aux sites injectés<br />
Le signataire (nom, date et signature)<br />
Nom du responsable du protocole : françoise PADILLA et Patrick Delmas<br />
Date : 10/10/2011<br />
Liste <strong>de</strong>s documents joints à cette <strong>de</strong>man<strong>de</strong> : Articles <strong>de</strong> référence<br />
Le cas échéant, réponse et avis motivé du comité régional d’éthique en expérimentation<br />
animale :<br />
Récépissé <strong>de</strong> déclaration du directeur départemental <strong>de</strong>s services vétérinaires adressé le :<br />
56
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 5<br />
Intitulé : Interactions neurone-glie<br />
Responsable : Catherine FAIVRE-SARRAILH<br />
57
Intitulé : Interactions neurone-glie<br />
Responsable : Catherine FAIVRE-SARRAILH<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Le nœud <strong>de</strong> Ranvier est la région active <strong>de</strong>s axones myélinisés où sont régénérés les potentiels<br />
d’action qui se propagent le long <strong>de</strong> l’axone. L’architecture <strong>de</strong>s nœuds <strong>de</strong> Ranvier dépend <strong>de</strong><br />
la formation <strong>de</strong> contacts entre l’axone et la cellule gliale myélinisante. L’équipe analyse le<br />
mo<strong>de</strong> d’adressage à la membrane plasmique <strong>de</strong>s canaux ioniques potassium et <strong>de</strong>s molécules<br />
d’adhérence au nœud <strong>de</strong> Ranvier et les mécanismes <strong>de</strong> ségrégation <strong>de</strong>s domaines axonaux<br />
Des pathologies démyélinisantes comme la sclérose en plaques entraînent au niveau <strong>de</strong><br />
plaques focales une désorganisation <strong>de</strong> la région nodale et <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s canaux<br />
ioniques ce qui entraîne <strong>de</strong>s pertes <strong>de</strong> la conduction nerveuse. L’analyse <strong>de</strong> l’interaction entre<br />
les molécules d’adhérence et les canaux ioniques et la caractérisation moléculaire <strong>de</strong>s<br />
jonctions axo-gliales sont cruciales pour une meilleure compréhension <strong>de</strong> ces pathologies. De<br />
plus, nous souhaitons i<strong>de</strong>ntifier et caractériser <strong>de</strong> nouveaux épitopes antigéniques associés aux<br />
pathologies démyélinisantes inflammatoires.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Rats, souris<br />
La recherche <strong>de</strong> l’équipe vise à comprendre les mécanismes impliqués dans les pathologies<br />
démyélinisantes humaines telles que la sclérose en plaques, la maladie <strong>de</strong> Charcot-Marie-<br />
Tooth, ou le syndrome <strong>de</strong> Guillain-Barré. La plupart <strong>de</strong>s expériences sont réalisées sur <strong>de</strong>s<br />
prélèvements <strong>de</strong> tissus nerveux et sur <strong>de</strong>s cultures <strong>de</strong> cellules neuronales. A cette fin,<br />
l’utilisation <strong>de</strong> différents modèles génétiques murins et <strong>de</strong>s modèles expérimentaux chez le rat<br />
est indispensable.<br />
� Souris: A ce jour, tous les modèles génétiques mimant la maladie <strong>de</strong> Charcot-Marie-<br />
Tooth ont été générés chez les souris.<br />
58
� Rat: La plupart <strong>de</strong>s modèles <strong>de</strong> culture <strong>de</strong> neurones ont été réalisés chez le rat. De<br />
plus, les modèles expérimentaux mimant le syndrome <strong>de</strong> Guillain-Barré ne peuvent<br />
être induits que chez le rat Lewis<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
� Anesthésie <strong>de</strong>s rats avec du pentobarbital sodique 6% à la dose <strong>de</strong> 150mg/kg par<br />
voie ip.<br />
� Anesthésie <strong>de</strong> la souris par un mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg<br />
� Prélèvement d’embryons <strong>de</strong> rat et <strong>de</strong> souris pour la culture cellulaire : culture <strong>de</strong><br />
ganglions dorso-rachidiens, <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cortex, d’hippocampe, <strong>de</strong> cervelet.<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> tissus sur animaux euthanasiés : euthanasie <strong>de</strong>s rats par décapitation.<br />
� Euthanasie <strong>de</strong>s souris par dislocation cervicale.<br />
� Euthanasie <strong>de</strong>s rats par inhalation <strong>de</strong> CO2 en saturant la boîte d’euthanasie <strong>de</strong> façon<br />
progressive suivie <strong>de</strong> prélèvements <strong>de</strong> tissus.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Catherine FAIVRE-SARRAILH, N° d’autorisation : 13-79<br />
Jérôme DEVAUX, N° d’autorisation : 13-297<br />
Wenjing LIU, (inscrite en formation <strong>de</strong> Niveau1)<br />
Bruno HIVERT, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> <strong>de</strong> transfert <strong>de</strong> dossier en cours)<br />
59
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Anesthésie <strong>de</strong>s rats avec du pentobarbital sodique (intrapéritonéal 70 mg/kg).<br />
Prélèvement d’embryons <strong>de</strong> rat et <strong>de</strong> souris pour la culture cellulaire : culture <strong>de</strong><br />
ganglions dorso-rachidiens, <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cortex, d’hippocampe, <strong>de</strong> cervelet.<br />
Euthanasie après prélèvement <strong>de</strong>s embryons par décapitation.<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s souris par dislocation cervicale.<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s rats par inhalation <strong>de</strong> CO2 à concentration progressive.<br />
Prélèvement <strong>de</strong>s nerfs sciatiques pour la biochimie ou l’immunocytochimie. Prélèvement<br />
<strong>de</strong> cerveaux.<br />
- Interventions chirurgicales :NON<br />
- Autres protocoles :NON<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
61
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 6<br />
Intitulé : Gliotransmission et synaptopathies<br />
Responsable : Jean-Pierre MOTHET<br />
62
Intitulé : Gliotransmission et synaptopathies<br />
Responsable : Jean-Pierre MOTHET<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Les travaux <strong>de</strong> recherche entrepris au sein <strong>de</strong> l’équipe ‘gliotransmission et synaptopathie’ <strong>de</strong><br />
l’unité CNRS UMR 6231 <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> visent à étudier la dynamique <strong>de</strong>s relations glie-<br />
neurones et à en évaluer le rôle fonctionnel dans le système nerveux sain et pathologique. Ce<br />
dialogue entre neurones et glie met en jeu la synthèse et la libération par les astrocytes <strong>de</strong><br />
substances neuroinformatives appelées gliotransmetteurs. Le projet scientifique <strong>de</strong> l‘équipe<br />
vise à préciser les modalités moléculaires et cellulaires <strong>de</strong> la gliotransmission et <strong>de</strong> la<br />
contribution notamment <strong>de</strong> la D-sérine dans la signalisation neuronale. Ce projet intègre le<br />
développement et l’utilisation <strong>de</strong> nouveaux modèles animaux ainsi que <strong>de</strong> nouvelles<br />
technologies dans une approche verticale <strong>de</strong> cette problématique, en relation avec certaines<br />
affections neurologiques et psychiatriques.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Nos étu<strong>de</strong>s restent limitées à l’utilisation du modèle rongeur. Nous utilisons les espèces<br />
suivantes : souris, rats et cobayes dans différentes explorations fonctionnelles et <strong>de</strong> biochimie.<br />
Ces modèles sont très largement utilisés en neurobiologie et répon<strong>de</strong>nt à différents besoins<br />
lors <strong>de</strong> nos expériences. Les rats sont <strong>de</strong>s modèles plus robustes que la souris pour les étu<strong>de</strong>s<br />
comportementales et physiologiques et étant <strong>de</strong> plus gran<strong>de</strong> taille offre un avantage certain<br />
pour les étu<strong>de</strong>s en biochimie et biologie cellulaire. Les rats sont donc préférentiellement<br />
utilisés à la souris dans les expériences <strong>de</strong> biochimie et d’électrophysiologie lorsqu’on nous<br />
ne sommes pas dépendants d’une approche génétique bien que nous envisageons désormais<br />
d’utiliser <strong>de</strong>s rats transgéniques qui seront prochainement introduits dans l’animalerie. Pour<br />
l’essentiel, l’utilisation <strong>de</strong> la souris est justifié par le fait que la plupart <strong>de</strong>s modèles animaux<br />
transgéniques dans notre champ d’expertise ‘interaction glie-neurone’ sont <strong>de</strong>s modèles<br />
murins d’invalidation <strong>de</strong> gènes (knock-out : invalidation conditionnelle ou constitutive <strong>de</strong><br />
gènes) ou <strong>de</strong> knock-in. Certains <strong>de</strong> ces modèles murins sont déjà introduits dans l’animalerie.<br />
Enfin, le cobaye est un excellent modèle pour les étu<strong>de</strong>s pharmacologique sur le système<br />
auditif et le système nerveux entérique, <strong>de</strong>ux autres axes <strong>de</strong> recherche <strong>de</strong> notre équipe.<br />
63
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Sur rongeurs jeunes et adultes (1-4 mois)<br />
� Anesthésie à l’ai<strong>de</strong> du mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg suivie <strong>de</strong><br />
perfusion intracardiaque d'un fixateur puis prélèvement <strong>de</strong> différents organes en vue<br />
d'examens anatomiques et histologiques.<br />
� Euthanasie au dioxy<strong>de</strong> <strong>de</strong> carbone ou en surdose d’anesthésique et prélèvement et<br />
dissection <strong>de</strong> différents organes en vue <strong>de</strong> dosage biochimiques.<br />
� Anesthésie à l’ai<strong>de</strong> du mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg suivie du<br />
prélèvement du cerveau et coupe au vibratome pour <strong>de</strong>s enregistrements<br />
électrophysiologiques.<br />
� Sur rongeurs nouveaux-nés (PN :0-2)<br />
� Euthanasie par décapitation <strong>de</strong>s nouveaux-nés et prélèvements du cerveau en vue <strong>de</strong> la<br />
mise en culture primaires <strong>de</strong>s cellules gliales et neuronales.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Jean-Pierre MOTHET, Transfert d’autorisation <strong>de</strong> la DDPP33 à DDPP13<br />
Mourad MEKAOUCHE, N° d’autorisation : 13-122<br />
Laurence HAD-AISSOUNI,<br />
Jérôme RUEL<br />
Glenn DALLERAC<br />
Marwa HANINI<br />
64
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Anesthésie à l’ai<strong>de</strong> du mélange Imalgéne 100mg/kg et Rompun, 10mg/kg suivie <strong>de</strong><br />
perfusion intracardiaque d'un fixateur puis prélèvement <strong>de</strong> différents organes en vue<br />
d'examens anatomiques et histologiques.<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
66
Centre <strong>de</strong> Recherche <strong>de</strong> Neurobiologie-<br />
<strong>Neurophysiologie</strong> <strong>de</strong> <strong>Marseille</strong> (<strong>CRN2M</strong>) <strong>UMR6231</strong><br />
<strong>Equipe</strong> 7<br />
Intitulé : Intégration <strong>de</strong>s informations viscérales<br />
Responsable : Dr. Fabien TELL<br />
67
Intitulé : Intégration <strong>de</strong>s informations viscérales<br />
Responsable : Dr. Fabien TELL<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Les travaux <strong>de</strong> l'équipe sont centrés sur le traitement <strong>de</strong> l'information viscérale. Au niveau<br />
cellulaire, l'équipe s'intéresse au fonctionnement <strong>de</strong>s synapses entre le nerf vague et un relais<br />
sensoriel central, le noyan du faisceau solitaire. A un niveau plus intégré, l’équipe étudie la<br />
fonction ventilatoire et cardio-vasculaire.<br />
Pour les étu<strong>de</strong>s cellulaires, les modèles d'étu<strong>de</strong>s sont <strong>de</strong>s préparations <strong>de</strong> tranches <strong>de</strong> tissu<br />
nerveux maintenues en survie in vitro et pour les étu<strong>de</strong>s intégrées, l'équipe utilise <strong>de</strong>s mo<strong>de</strong>lés<br />
animaux (rongeurs) anesthésiés ou vigiles. Les techniques sont principalement<br />
l’électrophysiologie, la neuroanatomie et la biochimie.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Les espèces animales sont le rat Wistar ou Sprague-Dawley et les souris <strong>de</strong> laboratoires<br />
incluant <strong>de</strong>s modèles transgéniques.<br />
L’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s systèmes intégrés nécessite absolument <strong>de</strong>s modèles animaux les plus utilisés que<br />
sont les rongeurs. Les expériences in vitro sur les tranches <strong>de</strong> tissus nerveux sont réalisées<br />
aussi <strong>de</strong>s prélèvements <strong>de</strong> tissus nerveux et sur <strong>de</strong>s cultures <strong>de</strong> cellules neuronales. A cette fin,<br />
l’utilisation <strong>de</strong> différents modèles génétiques murins et <strong>de</strong>s modèles expérimentaux chez le rat<br />
est indispensable.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Étu<strong>de</strong>s cellulaires :<br />
Les animaux sont anesthésies à l'isoflurane, décapités et le cerveau est prélevé. Des tranches<br />
<strong>de</strong> cerveau sont ensuite réalisées et maintenues en survie dans un liqui<strong>de</strong> artificiel oxygéné.<br />
� Etu<strong>de</strong>s biochimiques et neuroanatomiques :<br />
68
Biochimie : Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane, décapités et le cerveau est prélevé.<br />
Des tranches <strong>de</strong> cerveau sont ensuite réalisées et homogénéisées pour <strong>de</strong>s dosages<br />
biochimiques.<br />
Neuroanatomie : Les animaux sont anesthésiés par un mélange ketamine (100mg/kg) et<br />
xylazine (10mg/kg), puis perfusés avec un fixateur formolé. Le cerveau est ensuite prélevé et<br />
<strong>de</strong>s coupes sont réalisées avant d'effectuer <strong>de</strong>s marquages immunohistochimique.<br />
� Etu<strong>de</strong>s in vivo :<br />
Animaux anesthésiés : Les animaux sont anesthésies en continu par un mélange ketamine<br />
(100mg/kg) et xylazine (10mg/kg) ou par inhalation d'isoflurane. L'approche chirurgicale<br />
consiste à mettre en place <strong>de</strong>s voies veineuse et artérielle, <strong>de</strong>s poses d’électro<strong>de</strong>s sur <strong>de</strong>s nerfs<br />
ou <strong>de</strong>s muscles. Enfin une cardiotomie est réalisée suivie selon le cas d'une décérébration. Des<br />
électro<strong>de</strong>s d'enregistrement sont ensuite insérées dans les régions d'intérêt. A la fin <strong>de</strong><br />
l’expérience l’animal est euthanasié par une surdose d'anesthésique.<br />
Animaux vigiles : Les animaux sont mis dans une cage en plexiglass dont l'air est en<br />
permanence renouvelé et sont soumis à différents mélanges gazeux <strong>de</strong> manière à faire varier<br />
le taux d'oxygène. La ventilation est mesurée par pléthysmographie.<br />
Dans certains cas, les animaux sont conditionnés par inhalation à court terme (12-24h) d'air<br />
contenant <strong>de</strong> l'ozone (0.5-2 ppm). A la fin d'une série expérimentale les animaux sont<br />
euthanasiés par un surdose d'anesthésique.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Olivier BOSLER, N° d’autorisation : 13-53 (renouvellement en cours)<br />
Nadine CLERC, N° d’autorisation : 13-263 (renouvellement en cours)<br />
Jean-Pierre KESSLER, N° d’autorisation : 13-168<br />
Virginie PENALBA, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Caroline STRUBE, N° d’autorisation : 13-211<br />
Fabien TELL, N° d’autorisation : 13-261 (renouvellement en cours)<br />
Florian GACKIERE, N° d’autorisation : 13-460<br />
69
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Prélèvement occasionnel <strong>de</strong> sang par le sinus rétro-orbital ou par la veine <strong>de</strong> la queue.<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles :<br />
Les animaux sont anesthésiés en continu par un mélange ketamine (100mg/kg) et<br />
xylazine (10mg/kg) ou par inhalation d'isoflurane. L'approche chirurgicale consiste à<br />
mettre en place <strong>de</strong>s voies veineuse et artérielle, <strong>de</strong>s poses d’électro<strong>de</strong>s sur <strong>de</strong>s nerfs ou<br />
<strong>de</strong>s muscles. Enfin une cardiotomie est réalisée suivie selon le cas d'une décérébration.<br />
Des électro<strong>de</strong>s d'enregistrement sont ensuite insérées dans les régions d'intérêt. A la fin<br />
<strong>de</strong> l’expérience l’animal est euthanasié par une surdose d'anesthésique.<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
71
Neurobiologie <strong>de</strong>s Interactions Cellulaires et<br />
Neuropathologie (NICN) UMR 6184<br />
<strong>Equipe</strong> 1<br />
Intitulé : Barrière hématoencéphalique et Neuroinflammation /<br />
Vect-Horus<br />
Responsable : Dr. Michel KHRESTCHATISKY<br />
72
Intitulé : Barrière hématoencéphalique et Neuroinflammation / Vect-Horus<br />
Responsable : Dr. Michel KHRESTCHATISKY<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
L’équipe Barrière hématoencéphalique (BHE) et Neuroinflammation développe <strong>de</strong>s projets <strong>de</strong><br />
recherche fondamentale sur les propriétés <strong>de</strong> la barrière hématoencéphalique, notamment en<br />
situation pathologique et inflammatoire et sur les interactions entre cellules endothéliales <strong>de</strong><br />
cette barrière avec les cellules neurales du système nerveux central (cerveau et moelle<br />
épinière). L’équipe développe également <strong>de</strong>s projets <strong>de</strong> recherche plus appliquée dans le cadre<br />
d’un partenariat étroit avec la structure <strong>de</strong> biotechnologie Vect-Horus issue du laboratoire<br />
dont les objectifs sont le développement <strong>de</strong> molécules vecteurs qui permettent l’adressage<br />
d’agents thérapeutiques à travers la BHE. L’équipe BHE et Neuroinflammation coordonne 2<br />
projets ANR (TWEAKing the BBB et PREVENTAD), et est partenaire <strong>de</strong> 3 projets ANR<br />
(TIMPAD, ADHOC et VECtoBrain, ce <strong>de</strong>rnier projet étant coordonné par Vect-Horus). Les<br />
projets <strong>de</strong> l’équipe BHE & Neuroinflammation et ceux <strong>de</strong> Vect-Horus sont donc très<br />
collaboratifs et intriqués.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
� Rats Wistar <strong>de</strong> 5 semaines pour la mise en place hebdomadaire <strong>de</strong> modèles <strong>de</strong> BHE in<br />
vitro.<br />
� Souris Swiss <strong>de</strong> 30-35g pour évaluer les effets <strong>de</strong> molécules vectorisées sur le plan<br />
comportemental, notamment avec <strong>de</strong>s tests nociception (hot plate, tail flick).<br />
� Souris transgéniques 5XFAD, KO MMP-12, et croisements prévus <strong>de</strong> ces lignées, en<br />
collaboration avec les autres équipes <strong>de</strong> l’UMR, pour une étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s propriétés <strong>de</strong>s<br />
cellules endothéliales et <strong>de</strong> la BHE <strong>de</strong>s souris génétiquement programmées pour<br />
exprimer <strong>de</strong>s gènes impliqués dans la maladie d’Alzheimer et dans l’inflammation <strong>de</strong><br />
la BHE.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Administration <strong>de</strong> substances sur animaux vigiles<br />
73
Administration <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés : les souris sont anesthésiées<br />
avec l’ISOFLURANE 3 à 4 % en induction et 2 % en entretien au masque.<br />
Administration intraveineuse dans la queue <strong>de</strong> produit repris dans du NaCl 0,9% ;<br />
volume environ 3 mL/kg<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> sang sur animaux vigiles : les prélèvements <strong>de</strong> sang se font au niveau<br />
<strong>de</strong> la veine saphène après contention <strong>de</strong> l’animal.<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés : Anesthésie <strong>de</strong>s animaux à<br />
l’Isoflurane puis prélèvement sanguins au niveau du sinus retro-orbital et prélèvement<br />
d’urine.<br />
� Prélèvement d’organes sur animaux après euthanasie, notamment cerveau sur les rats<br />
et souris.<br />
Euthanasie : endormissement au CO2 suivi d’une dislocation cervicale<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Michel KHRESTCHATISKY N° d’autorisation : 13-316<br />
Max DE REGGI N° d’autorisation : 13-306<br />
Sophie DESPLAT JEGO N° d’autorisation : 13-294<br />
Anne BERNARD N° d’autorisation : 13-312<br />
Yves MOLINO (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Maxime Masse (inscrit en formation <strong>de</strong> niveau 1)<br />
Françoise JABES (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Guillaume Jacquot (inscrit en formation <strong>de</strong> niveau 1)<br />
74
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Anesthésie <strong>de</strong>s animaux à l’Isoflurane<br />
Prélèvement sanguins : au niveau du sinus retro-orbital,<br />
Prélèvement d’urine,<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles :<br />
Prélèvement d’organes sur animaux post euthanasie, notamment cerveau sur rats et<br />
souris, y compris souris transgéniques<br />
Euthanasie : endormissement au CO2 suivi d’une dislocation cervicale<br />
Administration intraveineuse dans la queue <strong>de</strong> produit repris dans du NaCl 0,9% ;<br />
volume environ 3 mL/kg<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
76
Neurobiologie <strong>de</strong>s Interactions Cellulaires et<br />
Neuropathologie (NICN) UMR 6184<br />
<strong>Equipe</strong> 2<br />
Intitulé : Dégénérescence et Plasticité Neurale<br />
Responsable : Dr. Santiago RIVERA<br />
77
Intitulé : Dégénérescence et Plasticité Neurale<br />
Responsable : Dr. Santiago RIVERA<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
L’équipe s’intéresse à l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> dégénérescence et <strong>de</strong> plasticité dans le<br />
système nerveux central dans <strong>de</strong>s conditions pathologiques, notamment dans <strong>de</strong>s modèles<br />
transgéniques <strong>de</strong> la maladie d’Alzheimer. Les recherches portent sur le rôle <strong>de</strong>s<br />
métalloprotéases matricielles (MMPs) et leurs inhibiteurs endogènes (TIMPs), ainsi que du<br />
système endocannabinoï<strong>de</strong> dans ces mécanismes. Les chercheurs utilisent entre autres <strong>de</strong>s<br />
approches <strong>de</strong> gain et <strong>de</strong> perte <strong>de</strong> fonction avec notamment l’utilisation d’animaux<br />
transgéniques. Un <strong>de</strong>uxième axe <strong>de</strong> recherche est focalisé sur le rôle du cytosquelette dans les<br />
phénomènes <strong>de</strong> plasticité et <strong>de</strong> réparation post-lésionnelle dans le système nerveux.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
L’équipe utilise <strong>de</strong>s rats et <strong>de</strong>s souris. La souris est l’espèce <strong>de</strong> choix actuellement dans le<br />
mon<strong>de</strong> lors qu’il s’agit d’étudier la maladie d’Alzheimer par <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s <strong>de</strong> la transgénèse.<br />
Pour cela l’équipe utilise la souche <strong>de</strong> souris 5xFAD, acquise auprès <strong>de</strong> Jackson Laboratoires,<br />
qui développe la maladie d’Alzheimer. L’équipe a également généré une souche dite ABK qui<br />
résulte du croisement <strong>de</strong> la souche 5xFAD et d’une souche KO pour le gène <strong>de</strong> la protéase<br />
MT5-MMP. Il est envisagé <strong>de</strong> croiser également à partir <strong>de</strong> 2012 la souche 5xFAD avec <strong>de</strong>s<br />
souches KO pour <strong>de</strong>ux protéases importantes dans les phénomènes d’inflammation et <strong>de</strong><br />
neurodégénérescence (MMP-12 et MT1-MMP KO) tel qu’il est prévu dans les projets ANR<br />
qui ont été financés récemment dans le laboratoire. Enfin, l’utilisation <strong>de</strong>s souris et <strong>de</strong>s rats et<br />
également justifiée par le fait que les conditions d’expérimentation sur ces espèces ont été<br />
optimisées <strong>de</strong>puis <strong>de</strong>s années au niveau <strong>de</strong> l’équipe et <strong>de</strong> l’animalerie.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> tissus sur animaux anesthésiés :<br />
� Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s rongeurs adultes.<br />
*Protocole 1 pour la biologie moléculaire :<br />
78
Les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale après une surdose <strong>de</strong> pentobarbital<br />
6%. Le cerveau, le cervelet et les bulbes olfactifs sont prélevés. Tous les tissus sont ensuite<br />
congelés.<br />
*Protocole 2 pour l’immunohistochimie : les animaux sont anesthésiés par injection intra<br />
péritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique à la dose <strong>de</strong> 70 mg/kg. Après thoracotomie et<br />
dégagement du cœur, une solution <strong>de</strong> PFA 4% ou PBS est infusée pour fixer les tissus. Le<br />
cerveau est ensuite prélevé.<br />
*Protocole 3 pour la mise en culture <strong>de</strong> cellules neurales <strong>de</strong> rats ou <strong>de</strong> souris (normales ou<br />
KO)<br />
� Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s rongeurs périnataux<br />
Cultures <strong>de</strong> cellules nerveuses <strong>de</strong> rats ou <strong>de</strong> souris (normales ou KO)<br />
*A partir <strong>de</strong> fœtus (pour culture <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cortex ou d’hippocampe). Les mères<br />
gestantes sont profondément anesthésiées par inhalation d’halothane (Lab. Bellamon). Après<br />
incision <strong>de</strong> l’abdomen (suivi <strong>de</strong> décapitation), le placenta est prélevé et transféré dans un<br />
tampon glacé. Les embryons (au sta<strong>de</strong> embryonnaires E17-18) sont alors prélevés et décapités<br />
avant prélèvements du cerveau.<br />
*A partir <strong>de</strong> nouveaux-nés.(pour cultures d’astrocytes corticaux, ou <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cervelet)<br />
Les prélèvements <strong>de</strong>s cerveaux se font à 3 - 7 jours après la naissance sur les animaux<br />
anesthésiées et décapités comme ci-<strong>de</strong>ssus.<br />
� Interventions chirurgicales :<br />
� Protocole pour Infusion sous-cutanée par minipompe osmotique<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong><br />
kétamine (100 mg/kg) et <strong>de</strong> xylazine (10 mg/kg). Avant d’effectuer une incision <strong>de</strong> la peau au<br />
niveau dorsal <strong>de</strong> l’animal (légèrement caudal du niveau <strong>de</strong>s épaules), la peau est rasée et les<br />
poils sont éliminés avec une gaze humi<strong>de</strong>. La peau est aseptisée avec <strong>de</strong> la Bétadine. Le<br />
matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique Alzet , USA) est inséré par l’incision et<br />
la peau <strong>de</strong> l’animal est suturée avec du fil stérile et résorbable en vicryl 3-0. L’animal est<br />
ensuite placé seul dans une cage et est surveillé jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance.<br />
L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong> stabulation (un animal par cage) pour une durée variant<br />
entre 1 et 42 jours avant d’être sacrifié par injection d’une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique<br />
(120 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
79
� Protocole pour Infusion intra-cérébro-ventriculaire (4ème ventricule) par<br />
minipompe osmotique<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong><br />
kétamine (100 mg/kg) et <strong>de</strong> xylazine (10 mg/kg) dans la pièce <strong>de</strong> stabulation. L’animal est<br />
placé sur un appareil <strong>de</strong> stéréotaxie, maintenue par <strong>de</strong>s barres d’oreilles et par une pièce <strong>de</strong><br />
geueule. La partie supérieure du crâne est rasée et les poils sont éliminés avec une gaze<br />
humi<strong>de</strong>. La peau est aseptisée avec <strong>de</strong> la Bétadine. Après une infiltration <strong>de</strong> xylocaïne en sous<br />
cutané, une incision longitudinale est effectuée et la peau est écartée. L’os est séché et un trou<br />
est percé sur le crâne pour permettre l’implantation d’une canule d’infusion selon <strong>de</strong>s<br />
coordonnées stéréotaxiques précises, celle-ci est maintenue par l’utilisation <strong>de</strong> ciment <strong>de</strong>ntaire<br />
(GC Fuji I, Japan). Le matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique Alzet , USA) est<br />
connecté à la canule d’infusion et ensuite insérée sous la peau <strong>de</strong> l’animal pour être<br />
positionnée au niveau dorsal, légèrement caudal du niveau <strong>de</strong>s épaules. La température <strong>de</strong><br />
l’animal est vérifiée au cours <strong>de</strong> l’opération afin d’éviter une hypothermie. La peau <strong>de</strong><br />
l’animal est suturée avec du fil stérile et résorbable en vicryl 3-0. L’animal est ensuite placé<br />
seul dans une cage et est surveillé jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance et notamment puisse<br />
se tenir <strong>de</strong>bout. L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong> stabulation (un animal par cage) pour<br />
une durée variant entre 1 et 42 jours avant d’être sacrifié par injection d’une dose létale <strong>de</strong><br />
pentobarbital sodique (120 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à<br />
0.5 mg/kg pour le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12<br />
heures.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Kévin BARANGER (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Anne BERNARD N° d’autorisation : 13-312<br />
Eliane CHARRAT titulaire d’un niveau 2<br />
Lotfi FERHAT, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Yannick MARCHALANT, N° d’autorisation : 13-501<br />
PY Nathalie, (inscrite en formation <strong>de</strong> niveau 1)<br />
RIVERA Santiago, N° d’autorisation : 13-308<br />
80
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s rongeurs adultes.<br />
*Protocole 1 pour la biologie moléculaire :<br />
On euthanasie les animaux par dislocation cervicale après une overdose <strong>de</strong> pentobarbital. On sectionne la<br />
tête aux ciseaux. On prélève le cerveau, le cervelet et les bulbes olfactifs. Tous les tissus sont ensuite<br />
congelés.<br />
*Protocole 2 pour l’immunohistochimie :<br />
On anesthésie le rongeur par injection intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (70 mg/kg).<br />
On ouvre la cage thoracique puis on dégage le cœur. On insère une aiguille reliée au tuyau d’une pompe<br />
péristaltique dans le ventricule gauche. On coupe l’oreillette droite, le sang est alors remplacé par la<br />
solution perfusée (PFA 4% ou PBS). Ensuite on prélève le cerveau.<br />
*Protocole 3 pour la mise en culture <strong>de</strong> cellules neurales <strong>de</strong> rats ou <strong>de</strong> souris (normales ou KO)<br />
Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s rongeurs périnataux.<br />
Cultures <strong>de</strong> cellules nerveuses <strong>de</strong> rats ou <strong>de</strong> souris (normales ou KO)<br />
A partir <strong>de</strong> fœtus (pour culture <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cortex ou d’hippocampe). Les mères gestantes sont<br />
profondément anesthésiées par inhalation d’halothane (Lab. Bellamon). Après incision <strong>de</strong> l’abdomen<br />
(suivi <strong>de</strong> décapitation), le placenta est prélevé et transféré dans un tampon glacé. Les embryons (au sta<strong>de</strong><br />
embryonnaires E17-18) sont alors prélevés et décapités avant prélèvements du cerveau.<br />
A partir <strong>de</strong> nouveaux-nés.(pour cultures d’astrocytes corticaux, ou <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cervelet)<br />
Les prélèvements <strong>de</strong>s cerveaux se font ici 3 - 7 jours après la naissance sur les animaux anesthésiés et<br />
décapités comme ci-<strong>de</strong>ssus.<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
Protocole pour Infusion sous-cutanée par minipompe osmotique<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong> kétamine (100<br />
mg/kg) et <strong>de</strong> xylazine (10 mg/kg). Avant d’effectuer une incision <strong>de</strong> la peau au niveau dorsal <strong>de</strong> l’animal<br />
(légèrement caudal du niveau <strong>de</strong>s épaules), la peau est rasée et les poils sont éliminés avec une gaze<br />
humi<strong>de</strong>. La peau est aseptisée à la Bétadine. Le matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique<br />
Alzet , USA) est inséré par l’incision et la peau <strong>de</strong> l’animal est suturé avec du fil stérile et résorbable en<br />
vicryl 3-0. L’animal est ensuite placé seul dans une cage et est contrôlé attentivement jusqu’à ce qu’il<br />
retrouve sa vigilance et notamment puisse se tenir <strong>de</strong>bout. L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong><br />
stabulation (un animal par cage) pour une durée variant entre 1 et 42 jours avant d’être sacrifié par<br />
injection d’une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (30 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour<br />
le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
Protocole pour Infusion intra-cérébro-ventriculaire (4ème ventricule) par minipompe osmotique<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong> kétamine (100<br />
mg/kg) et <strong>de</strong> xylazine (10 mg/kg). L’animal est placé sur un appareil <strong>de</strong> stéréotaxie, maintenu par <strong>de</strong>s<br />
barres d’oreilles et par une pièce <strong>de</strong> gueule. La partie supérieure du crâne est rasée et les poils sont<br />
éliminés avec une gaze humi<strong>de</strong>. La peau est aseptisée à la Bétadine. Une incision longitudinale est effectuée<br />
avec un scalpel et la peau est écartée. L’os est séché et un trou est percé sur le crâne pour permettre le<br />
passage <strong>de</strong> la canule d’infusion. Une fois en place, celle-ci est maintenue par l’utilisation <strong>de</strong> ciment<br />
<strong>de</strong>ntaire (GC Fuji I, Japan). Le matériel d’infusion chronique (Minipompe osmotique Alzet , USA) est<br />
connecté à al canule d’infusion et ensuite inséré sous la peau <strong>de</strong> l’animal pour être positionné au niveau<br />
dorsal, légèrement caudal du niveau <strong>de</strong>s épaules. La température <strong>de</strong> l’animal est vérifiée au cours <strong>de</strong><br />
82
l’opération afin d’éviter une hypothermie. La peau <strong>de</strong> l’animal est suturée avec du fil stérile et résorbable<br />
vicryl 3-0. L’animal est ensuite placé seul dans une cage et est contrôlé attentivement jusqu’à ce qu’il<br />
retrouve sa vigilance et notamment puisse se tenir <strong>de</strong>bout. L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong><br />
stabulation (un animal par cage) pour une durée variant entre 1 et 42 jours avant d’être sacrifié par<br />
injection d’une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (150 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour<br />
le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
83
Neurobiologie <strong>de</strong>s Interactions Cellulaires et<br />
Neuropathologie (NICN) UMR 6184<br />
<strong>Equipe</strong> 3<br />
Intitulé : Plasticité olfactive et réparation du système nerveux<br />
Responsable : Pr. François FERON<br />
84
Intitulé : Plasticité olfactive et réparation du système nerveux<br />
Responsable : Pr. François FERON<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
La muqueuse olfactive nasale est un tissu nerveux remarquable : accessible chez tous les<br />
individus et siège d’une neurogenèse permanente, il abrite <strong>de</strong>s cellules souches adultes et <strong>de</strong>s<br />
cellules engainantes qui participent à l’axogenèse. L’équipe étudie le potentiel thérapeutique<br />
<strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux types cellulaires, après transplantation dans <strong>de</strong>s modèles animaux <strong>de</strong> traumatisme<br />
médullaire, <strong>de</strong> sclérose en plaques et <strong>de</strong> la maladie d’Alzheimer. Afin d’accroître la<br />
récupération fonctionnelle <strong>de</strong>s animaux lésés ou mala<strong>de</strong>s, nous administrons en complément<br />
<strong>de</strong> la vitamine D, une molécule qui accroît l’axogenèse et la myélinisation.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Rats et souris.<br />
� L’équipe utilise <strong>de</strong>s rats (Wistar ou Sprague Dawley) pour les expériences <strong>de</strong><br />
régénération après trauma médullaire car les souris représentent un mauvais modèle<br />
animal pour ce genre d’étu<strong>de</strong>s.<br />
� En parallèle, nous utilisons <strong>de</strong>s souris – transgéniques ou non – pour nos travaux sur la<br />
maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaques. Nous élevons actuellement <strong>de</strong>s souris<br />
transgéniques (5xFAD) pour le suivi <strong>de</strong>s symptômes <strong>de</strong> la maladie d’Alzheimer et <strong>de</strong>s<br />
souris C57Bl6 pour l’induction <strong>de</strong> l’Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale<br />
(EAE).<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Protocole appliqué à <strong>de</strong>s foetus<br />
Culture <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cortex ou d’hippocampe. Les mères gestantes sont profondément<br />
anesthésiées par inhalation d’halothane volatile. Après incision <strong>de</strong> l’abdomen (suivi <strong>de</strong><br />
décapitation), le placenta est prélevé et transféré dans un tampon glacé. Les embryons (au<br />
sta<strong>de</strong> embryonnaires E17-18) sont alors prélevés, décapités et les cerveaux prélevés.<br />
Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s souriceaux <strong>de</strong> 3 à 6 jours.<br />
85
*Protocole 1 pour les cellules souches <strong>de</strong> la zone sous ventriculaire :<br />
On décapite les souriceaux avec <strong>de</strong>s ciseaux.<br />
On prélève le cerveau uniquement pour en faire <strong>de</strong>s coupes coronales au vibratome, puis on<br />
micro-dissèque la SVZ sur ces coupes.<br />
*Protocole 2 pour les cultures d’astrocytes corticaux, <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cervelet ou <strong>de</strong> cultures<br />
organoytpiques d’hippocampe :<br />
Les prélèvements <strong>de</strong>s cerveaux se font ici 3-10 jours après la naissance sur les animaux<br />
anesthésiées et décapités comme ci-<strong>de</strong>ssus.<br />
Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s rongeurs adultes.<br />
*Protocole 1 pour la biologie moléculaire :<br />
On euthanasie les animaux par dislocation cervicale.<br />
On coupe la tête aux ciseaux.<br />
On prélève le cerveau, le cervelet et les bulbes olfactifs.<br />
On ouvre l’abdomen et on prélève le foie, la rate, les reins, le thymus.<br />
Puis on dégage la colonne vertébrale et on récupère la moelle épinière.<br />
Tous les tissus sont ensuite fixés et congelés.<br />
*Protocole 2 pour l’immunohistochimie :<br />
On anesthésie la souris par injection intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique à la dose <strong>de</strong> 70<br />
mg/kg.<br />
On ouvre la cage thoracique puis on dégage le cœur.<br />
On insère une aiguille reliée au tuyau d’une pompe péristaltique dans le ventricule gauche.<br />
On coupe l’oreillette droite, le sang est alors remplacé par la solution perfusée (PFA 4% ou<br />
PBS). Ensuite on prélève le foie, la rate, les reins, le thymus, la moelle épinière et le cerveau.<br />
Les organes sont congelés directement.<br />
*Protocole 3 pour la culture <strong>de</strong> cellules du système immunitaire :<br />
On euthanasie les animaux par dislocation cervicale.<br />
On ouvre l’abdomen et on prélève la rate que l’on dilacère pour récupérer les cellules<br />
sanguines.<br />
*Protocole 4 pour la culture <strong>de</strong> cellules du système olfactif :<br />
Rats et souris sont euthanasiés par une overdose <strong>de</strong> pentobarbital sodique et la tête est isolée<br />
du reste du corps. La muqueuse olfactive est exposée après élimination <strong>de</strong> la peau, <strong>de</strong>s<br />
muscles <strong>de</strong> la face, <strong>de</strong>s incisives et <strong>de</strong> la mâchoire inférieure.<br />
86
� Interventions chirurgicales :<br />
Modèle rongeur <strong>de</strong> lésion du nerf péronier avec greffe <strong>de</strong> tuteur <strong>de</strong> repousse nerveuse<br />
L'anesthésie générale <strong>de</strong>s animaux (rats mâles Lewis ou Sprague Dawley) est obtenue par<br />
injection intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (Nembutal®, 70 mg/kg). Une injection i.p.<br />
d'atropine (0.05mg/kg) permet <strong>de</strong> réduire les sécrétions dans les voies aériennes<br />
potentiellement obstructives. L'animal étant placé en décubitus dorsal, <strong>de</strong>s incisions cutanées<br />
et musculaires au niveau <strong>de</strong> la patte postérieure gauche permettent d'accé<strong>de</strong>r au nerf sciatique.<br />
La branche péronière (peroneus ou fibularis) du tronc sciatique est dégagée <strong>de</strong>s tissus<br />
avoisinants jusqu'à son point d'émergence du tronc commun sciatique puis sectionnée dans sa<br />
partie médiane en <strong>de</strong>ux points séparés <strong>de</strong> 1,5 cm. Le faisceau nerveux est ensuite disséqué à<br />
l'intérieur du tronc commun sciatique afin <strong>de</strong> disposer d'une longueur suffisante pour réaliser<br />
aisément la réparation nerveuse. Le nerf péronier dégagé innerve le muscle Tibialis anterior.<br />
Un segment <strong>de</strong> nerf péronier <strong>de</strong> 1 cm est sectionné et est remplacé par un tube <strong>de</strong> 1 cm. Les<br />
extrémités distale et proximale du nerf sont insérées sur 1 mm dans chaque extrémité du tube.<br />
Les épinèvres <strong>de</strong>s extrémités nerveuses sont suturées aux extrémités du tube préalablement<br />
imbibé <strong>de</strong> sérum physiologique. Cette procédure permet <strong>de</strong> ramollir les parois du tube, ce qui<br />
facilite sa manipulation et sa mise en place. Le groupe contrôle est composé <strong>de</strong> rongeurs dont<br />
le segment nerveux est inversé et immédiatement remis en place en suturant en 5 points les<br />
épinèvres <strong>de</strong> chaque extrémité du segment nerveux prélevé avec celles <strong>de</strong>s troncs distal et<br />
central (fil Ethilon® 10/0).<br />
Pour tous les groupes expérimentaux, les plans musculaires <strong>de</strong> la patte sont suturés avec du fil<br />
vicryl 4/0 et les plaies sont abondamment enduites <strong>de</strong> Cortiméga®, une pomma<strong>de</strong> anti-<br />
inflammatoire et antibiotique. Les animaux sont alors placés en ambiance chau<strong>de</strong> (37°C)<br />
jusqu'à leur réveil, puis placés dans <strong>de</strong>s cages individuelles où ils reçoivent <strong>de</strong> l'eau et <strong>de</strong> la<br />
nourriture ad libitum. L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE<br />
à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se<br />
font toutes les 6 à 12 heures.<br />
Dix semaines plus tard, les animaux sont <strong>de</strong> nouveau anesthésiés au pentobarbital sodique<br />
(Nembutal, 48 mg/kg). La trachée, la veine et l'artère poplitée controlatérales au nerf étudié<br />
sont canulées. L'animal est réhydraté par une injection intraveineuse <strong>de</strong> sérum physiologique<br />
(1 ml/heure). Une pompe à respiration artificielle (Harvard Respiratory Pump), <strong>de</strong> volume et<br />
87
<strong>de</strong> fréquence variables, pouvant fonctionner sur un mo<strong>de</strong> automatique permet <strong>de</strong> ventiler<br />
l'animal qui est curarisé (Bromure <strong>de</strong> Pancuronium, 10 mg/kg, i.v). La patte gauche est incisée<br />
et le muscle Tibialis anterior est dégagé <strong>de</strong> son tissu conjonctif. La patte <strong>de</strong> l'animal est<br />
soli<strong>de</strong>ment fixée à un support horizontal afin d'éviter tout mouvement au cours <strong>de</strong> la<br />
stimulation électrique du muscle. Afin <strong>de</strong> mesurer la force <strong>de</strong> la contraction, l'extrémité<br />
distale du tendon est attachée à une jauge <strong>de</strong> contrainte isométrique (Microdynamomètre, Ugo<br />
Basile).<br />
Le muscle recouvrant le tronc commun sciatique est ensuite disséqué et le nerf péronier et son<br />
greffon sont désolidarisés <strong>de</strong>s tissus conjonctifs avoisinants. Après section dans la partie<br />
proximale du nerf, le nerf et le greffon sont placés dans un bain <strong>de</strong> paraffine maintenu à la<br />
température <strong>de</strong> 37°C. La partie laissée libre du nerf périphérique est placée sur une électro<strong>de</strong><br />
bipolaire en tungstène afin <strong>de</strong> procé<strong>de</strong>r à sa stimulation. Après avoir rétracté les gaines<br />
conjonctives (épinèvre et périnèvre), <strong>de</strong> fins faisceaux <strong>de</strong> fibres nerveuses sont obtenus par<br />
dilacération à l'ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> pinces fines (technique <strong>de</strong> la fibre unique : « teasing »). Un « peigne<br />
d'électro<strong>de</strong>s » en tungstène, solidaire d'un micromanipulateur, permet d'enregistrer en<br />
condition monopolaire l'activité électrique extracellulaire <strong>de</strong>s fibres nerveuses. La pression<br />
artérielle, enregistrée à l'ai<strong>de</strong> d'un capteur (Gould, type N.A), est visualisée sur une autre voie<br />
<strong>de</strong> l'enregistreur. La température centrale <strong>de</strong> l'animal est maintenue entre 37,5° et 39°C à<br />
l'ai<strong>de</strong> d'une couverture chauffante asservie à une son<strong>de</strong> thermique rectale. A la fin <strong>de</strong><br />
l’expérience, l’animal est sacrifié avec une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital.<br />
Protocole pour axotomie et bulbectomie<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong><br />
kétamine (150 mg/kg) et <strong>de</strong> valium (3 mg/kg) dans la pièce <strong>de</strong> stabulation. L’animal<br />
anesthésié (perte <strong>de</strong> réflexes) est ensuite amené dans la pièce <strong>de</strong> chirurgie et est placé sur un<br />
appareil <strong>de</strong> stéréotaxie, maintenue par <strong>de</strong>s barres d’oreilles et par la pièce <strong>de</strong> gueule. La partie<br />
supérieure du crâne est rasée et les poils sont éliminés avec une gaze humi<strong>de</strong>. La peau est<br />
aseptisée à la betadine. Après une infiltration sous cutanée <strong>de</strong> xylocaïne une incision<br />
longitudinale est effectuée avec un scalpel et la peau ainsi que le fascia sont écartés. Quand le<br />
bulbe olfactif apparaît par transparence, on marque l’emplacement avec un feutre. Pour une<br />
axotomie, avec une perceuse portée à vitesse maximum, on perce la partie osseuse juste<br />
<strong>de</strong>vant le bulbe olfactif puis on enfonce une aiguille jusqu’au palais et par un mouvement<br />
horizontal on sectionne les afférences nerveuses innervant la face antérieur du bulbe olfactif.<br />
88
Pour une bulbectomie, on élimine à la perceuse le petit carré osseux recouvrant le bulbe<br />
olfactif qui est ensuite éliminé avec une spatule adaptée. La température <strong>de</strong> l’animal est<br />
vérifiée au cours <strong>de</strong> l’opération afin d’éviter une hypothermie. Après la dénervation, la peau<br />
<strong>de</strong> l’animal est suturée avec du fil stérile et résorbable vicryl 3/0. L’animal est ensuite placé<br />
seul dans une cage et est contrôlé attentivement jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance et<br />
notamment puisse se tenir <strong>de</strong>bout. L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong> stabulation (un<br />
animal par cage) pour une durée variant entre 1 et 36 jours avant d’être sacrifié par injection<br />
d’une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (120 mg/kg) en intra-péritonéal. L’analgésie est<br />
assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour le<br />
rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
Modèles rongeurs <strong>de</strong> traumatisme <strong>de</strong> la moelle épinière (transsection, compression) avec<br />
greffe <strong>de</strong> cellules olfactives<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong><br />
kétamine (100 mg/kg) et <strong>de</strong> xylazine (10 mg/kg) dans la pièce <strong>de</strong> stabulation. L’animal<br />
anesthésié (perte <strong>de</strong> réflexes) est ensuite amené dans la pièce <strong>de</strong> chirurgie. La partie médiane<br />
du dos <strong>de</strong> l’animal est rasée et les poils sont éliminés avec une gaze humi<strong>de</strong>. La peau est<br />
aseptisée avec <strong>de</strong> la bétadine. Une incision longitudinale est effectuée avec un scalpel et la<br />
peau est écartée. Une secon<strong>de</strong> incision est effectuée dans la masse musculaire entre les<br />
niveaux thoraciques T6 et T10. A l’ai<strong>de</strong> d’un écarteur, les muscles sont séparés afin d’exposer<br />
la colonne vertébrale. Une laminectomie est pratiquée au niveau T9. Une anesthésie locale est<br />
pratiquée en déposant 100 à 200 microlitres <strong>de</strong> xylocaïne sur la moelle exposée. Pour le<br />
modèle <strong>de</strong> compression, une son<strong>de</strong> pourvue d’un ballonnet à son extrémité, est introduite<br />
entre la moelle et la colonne vertébrale <strong>de</strong> sorte que le ballonnet soit situé sous le niveau T8.<br />
Le ballonnet est gonflé à une pression <strong>de</strong> 5 atmosphères pendant 1 minute à l’ai<strong>de</strong> d’une<br />
seringue contenant <strong>de</strong> l’eau et équipé d’un mesureur <strong>de</strong> pression. Au bout d’une minute, le<br />
ballonnet est dégonflé et retiré. Pour le modèle <strong>de</strong> transection, la moelle est incisée sur toute<br />
la largeur à l’ai<strong>de</strong> d’un scalpel au niveau T9.<br />
Après la compression ou la transection, un morceau <strong>de</strong> Gelfoam est inséré au <strong>de</strong>ssus <strong>de</strong> la<br />
moelle exposée puis les muscles et la peau sont suturés avec du fil stérile et résorbable en<br />
vicryl 3/0. La température <strong>de</strong> l’animal est vérifiée au cours <strong>de</strong> l’opération afin d’éviter une<br />
hypothermie. L’animal est ensuite placé seul dans une cage et est contrôlé attentivement<br />
jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance. L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong> stabulation (un<br />
89
animal par cage) pour une durée variant entre 4 et 16 semaines avant d’être sacrifié par<br />
injection d’une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (30 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à<br />
0.5 mg/kg pour le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12<br />
heures.<br />
Durant les quinze jours qui suivent l’opération, l’animal bénéficie <strong>de</strong> soins post-opératoires<br />
intensifs. L’animal est pesé tous les jours et, <strong>de</strong>ux fois par jour, son urine est éjectée par une<br />
pression douce sur la vessie. Si l’urine montre <strong>de</strong>s signes d’infection, une dose <strong>de</strong> terramycine<br />
(0,1 ml) est administrée en intrapéritonéal pendant 5 jours. Si l’animal montre <strong>de</strong>s signes <strong>de</strong><br />
souffrance, un traitement au BUPRECARE est administré en intrapéritonéal.<br />
� Autres protocoles : Protocoles d’analyse du comportement<br />
Mesure <strong>de</strong> la récupération fonctionnelle après section du nerf péronier<br />
Mesure <strong>de</strong> l’empreinte du pas : les mesures <strong>de</strong> la longueur du pas (PL : print lenght) et <strong>de</strong><br />
l’écartement <strong>de</strong>s orteils entre le premier et le cinquième orteil (TS : toe spread) sont réalisées<br />
après imprégnation avec <strong>de</strong> l’encre indélébile <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux pattes arrières du rat. Nous avons<br />
utilisé la formule <strong>de</strong> l’in<strong>de</strong>x fonctionnel péronier <strong>de</strong> Bain-Mackinnon-Hunter en prenant les<br />
moyennes <strong>de</strong>s valeurs du côté sain (N : normal) et du côté lésé (E : experimental) sur trois pas<br />
consécutifs sans arrêt. La formule s’écrit <strong>de</strong> la manière suivante :<br />
PFI (peroneal function in<strong>de</strong>x)= 174.9x[(EPL-NPL)/NPL] + 80,3x[(ETS-NTS)/NTS] - 13.4<br />
Le score d’un animal sain s’établit à -13.4<br />
Analyse cinématique <strong>de</strong> la marche : étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s amplitu<strong>de</strong>s articulaires avec le logiciel SIMI<br />
motion®<br />
Cette étu<strong>de</strong> nécessite au préalable le marquage au feutre indélébile <strong>de</strong> quatre points<br />
articulaires en regard <strong>de</strong> la hanche (trochantaris major), du genou (condylus lateralis), <strong>de</strong> la<br />
cheville (malleolus lateralis) et <strong>de</strong> la tête du cinquième métatarsien <strong>de</strong> la patte arrière gauche.<br />
L’enregistrement vidéo permet l’analyse du déplacement en 2D <strong>de</strong>s 4 points sur 3 pas<br />
consécutifs sans arrêt. Le logiciel SIMI motion® traite les données sur chacune <strong>de</strong>s 50<br />
acquisitions par secon<strong>de</strong> et détermine les courbes <strong>de</strong>s angles du genou et <strong>de</strong> la cheville au<br />
cours du déplacement. Nous avons étudié les amplitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong>s angles <strong>de</strong> dorsiflexion <strong>de</strong> la<br />
cheville et <strong>de</strong> flexion du genou pendant la phase <strong>de</strong> balancé, les valeurs <strong>de</strong> l’angle <strong>de</strong><br />
90
dorsiflexion <strong>de</strong> la cheville au milieu (mid swing) et en fin <strong>de</strong> la phase <strong>de</strong> balancé (terminal<br />
swing).<br />
Mesure <strong>de</strong> la récupération fonctionnelle après section ou compression <strong>de</strong> la moelle<br />
épinière<br />
Mesure <strong>de</strong> la locomotion et <strong>de</strong> la démarche : on utilise le test BBB. Les animaux sont placés<br />
dans un openfield et observés pendant 4 minutes. Les principales mesures concernent le<br />
mouvement <strong>de</strong> chacune <strong>de</strong>s articulations <strong>de</strong>s pattes inférieures, la capacité <strong>de</strong> l’animal à<br />
supporter son poids et la démarche <strong>de</strong> l’animal lorsque celui-ci parvient à se tenir sur ses<br />
pattes postérieures. Chaque animal se voit attribuer un nombre <strong>de</strong> points variant entre 0 et 21.<br />
Chaque animal est testé une fois par semaine sur <strong>de</strong>s pério<strong>de</strong>s allant <strong>de</strong> 12 à 36 semaines.<br />
Mesure <strong>de</strong> la nage : l’animal est placé dans un couloir <strong>de</strong> nage en verre, suffisamment étroit<br />
pour qu’il ne puisse revenir à sa plateforme d’origine. L’animal est filmé et le mouvement <strong>de</strong><br />
la patte est ensuite analysé avec le logiciel SIMI motion® décrit plus haut.<br />
Comportement sur une échelle inclinée : l’animal est placé sur une échelle horizontale. Cette<br />
<strong>de</strong>rnière est ensuite progressivement élevée à l’une <strong>de</strong> ses extrémités jusqu’à atteindre l’angle<br />
<strong>de</strong> 55°. Lorsque l’échelle est inclinée <strong>de</strong> la sorte, l’animal ne peut tenir agrippé à l’échelle<br />
avec la seule force <strong>de</strong> ses pattes antérieures. Il a besoin <strong>de</strong> l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> ses pattes postérieures<br />
pour pouvoir se maintenir sur les barreaux.<br />
Mesure <strong>de</strong> la paralysie induite par l’injection d’un pepti<strong>de</strong> myélinique (modèle EAE <strong>de</strong><br />
sclérose en plaques)<br />
Un cocktail contenant <strong>de</strong> l’adjuvant <strong>de</strong> Freund, la mycobactérie tuberculosis, le pepti<strong>de</strong> MOG<br />
(Myelin Oligo<strong>de</strong>ndrocyte Glycoprotein) est injecté en sous cutané, au niveau <strong>de</strong> la nuque. Les<br />
premiers signes cliniques sont observés 2 à 3 semaines après l’injection. L’échelle<br />
d’évaluation comprend six sta<strong>de</strong>s. Les animaux sont observés quotidiennement dans un<br />
openfield pendant 40 jours.<br />
0 Pas <strong>de</strong> symptômes<br />
1 Queue flacci<strong>de</strong><br />
2 Faiblesse du train arrière (mais plie les 2 pattes)<br />
Démarche surbaissée<br />
2,5 Faiblesse du train arrière (mais plie les 2 pattes)<br />
Démarche surbaissée<br />
Perte d’équilibre ou tremblement (« tangue »)<br />
91
3 Paralysie partielle du train arrière (plie 1 patte, l’autre « traîne »)<br />
4 Paralysie totale du train arrière<br />
5 Paralysie totale du train arrière<br />
Troubles sphinctériens<br />
Hémorragies oculaires, nasales, etc.<br />
Parésie ou paralysie partielle ou totale <strong>de</strong>s pattes avant<br />
5,5 Sta<strong>de</strong> moribond sans mort immédiate<br />
6 Sta<strong>de</strong> moribond sans mort immédiate<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
François FERON, N° d’autorisation : 13-249<br />
Véréna LANDEL, (inscrite en formation <strong>de</strong> niveau 1)<br />
Isabelle VIRARD, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> <strong>de</strong> changement d’établissement en cours)<br />
92
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o<br />
i i a r t u t b m m t p r t v i r p u i t p o e n t i<br />
m e t e r r a s s r i b r i n c r i l r t l u o r s<br />
a n t e i y t t e n i e n s i i n l e i o r p e s<br />
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Tourner la feuille SVP �<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Protocole appliqué à <strong>de</strong>s foetus<br />
Culture <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cortex ou d’hippocampe. Les mères gestantes sont profondément anesthésiées par<br />
inhalation d’halothane. Après incision <strong>de</strong> l’abdomen (suivi <strong>de</strong> décapitation), le placenta est prélevé et<br />
transféré dans un tampon glacé. Les embryons (au sta<strong>de</strong> embryonnaires E17-18) sont alors prélevés,<br />
décapités et les cerveaux prélevés.<br />
Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s souriceaux <strong>de</strong> 3 à 6 jours.<br />
Protocole 1 pour les cellules souches <strong>de</strong> la zone sous ventriculaire :<br />
On décapite les souriceaux avec <strong>de</strong>s ciseaux.<br />
On prélève le cerveau uniquement pour en faire <strong>de</strong>s coupes coronales au vibratome, puis on microdissèque<br />
la SVZ sur ces coupes.<br />
Protocole 2 pour les cultures d’astrocytes corticaux, <strong>de</strong> neurones <strong>de</strong> cervelet ou <strong>de</strong> cultures<br />
organoytpiques d’hippocampe :<br />
Les prélèvements <strong>de</strong>s cerveaux se font ici 3-10 jours après la naissance sur les animaux anesthésiées et<br />
décapités comme ci-<strong>de</strong>ssus.<br />
Protocoles appliqués à <strong>de</strong>s rongeurs adultes.<br />
Protocole 1 pour la biologie moléculaire :<br />
On euthanasie les animaux par dislocation cervicale.<br />
On coupe la tête aux ciseaux.<br />
On prélève le cerveau, le cervelet et les bulbes olfactifs.<br />
On ouvre l’abdomen et on prélève le foie, la rate, les reins, le thymus.<br />
Puis on dégage la colonne vertébrale et on récupère la moelle épinière.<br />
Tous les tissus sont ensuite fixés et congelés.<br />
Protocole 2 pour l’immunohistochimie :<br />
On anesthésie la souris par injection intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (70 mg/kg).<br />
On ouvre la cage thoracique puis on dégage le cœur.<br />
On insère une aiguille reliée au tuyau d’une pompe péristaltique dans le ventricule gauche.<br />
On coupe l’oreillette droite, le sang est alors remplacé par la solution perfusée (PFA 4% ou PBS).<br />
Ensuite on prélève le foie, la rate, les reins, le thymus, la moelle épinière et le cerveau.<br />
Les organes sont congelés directement.<br />
Protocole 3 pour la culture <strong>de</strong> cellules du système immunitaire :<br />
On euthanasie les animaux par dislocation cervicale.<br />
On ouvre l’abdomen et on prélève la rate que l’on dilacère pour récupérer les cellules sanguines.<br />
Protocole 4 pour la culture <strong>de</strong> cellules du système olfactif :<br />
Rats et souris sont euthanasiés par une overdose <strong>de</strong> pentobarbital sodique et la tête est isolée du reste du<br />
corps. La muqueuse olfactive est exposée après élimination <strong>de</strong> la peau, <strong>de</strong>s muscles <strong>de</strong> la face, <strong>de</strong>s incisives<br />
et <strong>de</strong> la mâchoire inférieure.<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
Modèle rongeur <strong>de</strong> lésion du nerf péronier avec greffe <strong>de</strong> tuteur <strong>de</strong> repousse nerveuse<br />
L'anesthésie générale <strong>de</strong>s animaux (rats mâles Lewis ou Sprague Dawley) est obtenue par injection<br />
intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (Nembutal®, 70 mg/kg). Une injection ip. d'atropine<br />
(0.05mg/kg) permet <strong>de</strong> réduire les sécrétions dans les voies aériennes potentiellement obstructives.<br />
L'animal étant placé en décubitus dorsal, <strong>de</strong>s incisions cutanées et musculaires au niveau <strong>de</strong> la patte<br />
postérieure gauche permettent d'accé<strong>de</strong>r au nerf sciatique. La branche péronière (peroneus ou fibularis)<br />
du tronc sciatique est dégagée <strong>de</strong>s tissus avoisinants jusqu'à son point d'émergence du tronc commun<br />
sciatique puis sectionnée dans sa partie médiane en <strong>de</strong>ux points séparés <strong>de</strong> 1,5 cm. Le faisceau nerveux est<br />
94
ensuite disséqué à l'intérieur du tronc commun sciatique afin <strong>de</strong> disposer d'une longueur suffisante pour<br />
réaliser aisément la réparation nerveuse. Le nerf péronier dégagé innerve le muscle Tibialis anterior.<br />
Un segment <strong>de</strong> nerf péronier <strong>de</strong> 1 cm est sectionné et est remplacé par un tube <strong>de</strong> 1 cm. Les extrémités<br />
distale et proximale du nerf sont insérées sur 1 mm dans chaque extrémité du tube. Les épinèvres <strong>de</strong>s<br />
extrémités nerveuses sont suturées aux extrémités du tube préalablement imbibé <strong>de</strong> sérum physiologique.<br />
Cette procédure permet <strong>de</strong> ramollir les parois du tube, ce qui facilite sa manipulation et sa mise en place.<br />
Le groupe contrôle est composé <strong>de</strong> rongeurs dont le segment nerveux est inversé et immédiatement remis<br />
en place en suturant en 5 points les épinèvres <strong>de</strong> chaque extrémité du segment nerveux prélevé avec celles<br />
<strong>de</strong>s troncs distal et central (fil Ethilon® 10/0, 200 microns).<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour<br />
le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
Pour tous les groupes expérimentaux, les plans musculaires <strong>de</strong> la patte sont suturés avec du fil vicryl 4/0 et<br />
les plaies sont abondamment enduites <strong>de</strong> Cortiméga®, une pomma<strong>de</strong> anti-inflammatoire et antibiotique.<br />
Les animaux sont alors placés en ambiance chau<strong>de</strong> (37°C) jusqu'à leur réveil, puis placés dans <strong>de</strong>s cages<br />
individuelles où ils reçoivent <strong>de</strong> l'eau et <strong>de</strong> la nourriture ad libitum.<br />
Dix semaines plus tard, les animaux sont <strong>de</strong> nouveau anesthésiés au pentobarbital sodique (Nembutal, 70<br />
mg/kg). La trachée, la veine et l'artère poplitée controlatérales au nerf étudié sont canulées. L'animal est<br />
réhydraté par une injection intraveineuse <strong>de</strong> sérum physiologique (1 ml/heure). Une pompe à respiration<br />
artificielle (Harvard� Respiratory Pump), <strong>de</strong> volume et <strong>de</strong> fréquence variables, pouvant fonctionner sur<br />
un mo<strong>de</strong> automatique permet <strong>de</strong> ventiler l'animal qui est curarisé (Bromure <strong>de</strong> Pancuronium�, 10 mg/kg,<br />
i.v). La patte gauche est incisée et le muscle Tibialis anterior est dégagé <strong>de</strong> son tissu conjonctif. La patte <strong>de</strong><br />
l'animal est soli<strong>de</strong>ment fixée à un support horizontal afin d'éviter tout mouvement au cours <strong>de</strong> la<br />
stimulation électrique du muscle. Afin <strong>de</strong> mesurer la force <strong>de</strong> la contraction, l'extrémité distale du tendon<br />
est attachée à une jauge <strong>de</strong> contrainte isométrique (Microdynamomètre, Ugo Basile).<br />
Le muscle recouvrant le tronc commun sciatique est ensuite disséqué et le nerf péronier et son greffon sont<br />
désolidarisés <strong>de</strong>s tissus conjonctifs avoisinants. Après section dans la partie proximale du nerf, le nerf et le<br />
greffon sont placés dans un bain <strong>de</strong> paraffine maintenu à la température <strong>de</strong> 37°C. La partie laissée libre<br />
du nerf périphérique est placée sur une électro<strong>de</strong> bipolaire en tungstène afin <strong>de</strong> procé<strong>de</strong>r à sa stimulation.<br />
Après avoir rétracté les gaines conjonctives (épinèvre et périnèvre), <strong>de</strong> fins faisceaux <strong>de</strong> fibres nerveuses<br />
sont obtenus par dilacération à l'ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> pinces fines (technique <strong>de</strong> la fibre unique : « teasing »). Un «<br />
peigne d'électro<strong>de</strong>s » en tungstène, solidaire d'un micromanipulateur, permet d'enregistrer en condition<br />
monopolaire l'activité électrique extracellulaire <strong>de</strong>s fibres nerveuses. La pression artérielle, enregistrée à<br />
l'ai<strong>de</strong> d'un capteur (Gould, type N.A), est visualisée sur une autre voie <strong>de</strong> l'enregistreur. La température<br />
centrale <strong>de</strong> l'animal est maintenue entre 37,5° et 39°C à l'ai<strong>de</strong> d'une couverture chauffante asservie à une<br />
son<strong>de</strong> thermique rectale. A la fin <strong>de</strong> l’expérience, l’animal est sacrifié avec une dose létale <strong>de</strong><br />
pentobarbital.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour<br />
le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
Protocole pour axotomie et bulbectomie<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong> kétamine (150<br />
mg/kg) et <strong>de</strong> valium (3 mg/kg). L’animal est placé sur un appareil <strong>de</strong> stéréotaxie, maintenue par <strong>de</strong>s<br />
barres d’oreilles et par les <strong>de</strong>nts. La partie supérieure du crâne est rasée et les poils sont éliminés avec une<br />
gaze humi<strong>de</strong>. La peau est aseptisée à la betadine. Une incision longitudinale est effectuée avec un scalpel et<br />
la peau ainsi que le fascia sont écartés. La dure mère est éliminée par grattage avec une spatule et, quand<br />
le bulbe olfactif apparaît par transparence, on marque l’emplacement avec un feutre. Pour une axotomie,<br />
avec une perceuse portée à vitesse maximum, on perce la partie osseuse juste <strong>de</strong>vant le bulbe olfactif puis<br />
on enfonce une aiguille jusqu’au palais et par un mouvement horizontal on sectionne les afférences<br />
nerveuses innervant la face antérieur du bulbe olfactif. Pour une bulbectomie, on élimine à la perceuse le<br />
petit carré osseux recouvrant le bulbe olfactif qui est ensuite éliminé avec une spatule adaptée. La<br />
température <strong>de</strong> l’animal est vérifiée au cours <strong>de</strong> l’opération afin d’éviter une hypothermie. Après la<br />
dénervation, la peau <strong>de</strong> l’animal est suturée avec du fil stérile et résorbable en vicyl 3-0. L’animal est<br />
ensuite placé seul dans une cage et est contrôlé attentivement jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance et<br />
notamment puisse se tenir <strong>de</strong>bout. L’animal retourne ensuite en zone <strong>de</strong> stabulation (un animal par cage)<br />
pour une durée variant entre 1 et 36 jours avant d’être sacrifié par injection d’une dose létale <strong>de</strong><br />
pentobarbital sodique (100 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour<br />
le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
95
Modèles rongeurs <strong>de</strong> traumatisme <strong>de</strong> la moelle épinière (transsection, compression) avec greffe <strong>de</strong> cellules<br />
olfactives<br />
Rats et souris adultes sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’un mélange <strong>de</strong> kétamine (100<br />
mg/kg) et <strong>de</strong> xylazine (10 mg/kg). La partie médiane du dos <strong>de</strong> l’animal est rasée et les poils sont éliminés<br />
avec une gaze humi<strong>de</strong>. La peau est aseptisée avec <strong>de</strong> la betadine. Une incision longitudinale est effectuée<br />
avec un scalpel et la peau est écartée. Une secon<strong>de</strong> incision est effectuée dans la masse musculaire entre les<br />
niveaux thoraciques T6 et T10. A l’ai<strong>de</strong> d’un écarteur, les muscles sont séparés afin d’exposer la colonne<br />
vertébrale. Une laminectomie est pratiquée au niveau T9. Une anesthésie locale est pratiquée en déposant<br />
100 à 200 microlitres <strong>de</strong> xylocaïne sur la moelle exposée. Pour le modèle <strong>de</strong> compression, une son<strong>de</strong><br />
pourvue d’un ballonnet à son extrémité, est introduite entre la moelle et la colonne vertébrale <strong>de</strong> sorte que<br />
la ballonnet soit situé sous le niveau T8. Le ballonnet est gonflé à une pression <strong>de</strong> 5 atmosphères pendant 1<br />
minute à l’ai<strong>de</strong> d’une seringue contenant <strong>de</strong> l’eau et équipé d’un mesureur <strong>de</strong> pression. Au bout d’une<br />
minute, le ballonnet est dégonflé et retiré. Pour le modèle <strong>de</strong> transection, la moelle est incisée sur toute la<br />
largeur à l’ai<strong>de</strong> d’un scalpel au niveau T9.<br />
Après la compression ou la transection, un morceau <strong>de</strong> Gelfoam est inséré au <strong>de</strong>ssus <strong>de</strong> la moelle exposée<br />
puis les muscles et la peau sont suturés avec du fil stérile et résorbable en vicryl 3-0. La température <strong>de</strong><br />
l’animal est vérifiée au cours <strong>de</strong> l’opération afin d’éviter une hypothermie. L’animal est ensuite placé seul<br />
dans une cage et est contrôlé attentivement jusqu’à ce qu’il retrouve sa vigilance. L’animal retourne<br />
ensuite en zone <strong>de</strong> stabulation (un animal par cage) pour une durée variant entre 4 et 16 semaines avant<br />
d’être sacrifié par injection d’une dose létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique (120 mg/kg) en intra-péritonéal.<br />
Durant les quinze jours qui suivent l’opération, l’animal bénéficie <strong>de</strong> soins post-opératoires intensifs.<br />
L’animal est pesé tous les jours et, <strong>de</strong>ux fois par jour, son urine est éjectée par une pression douce sur la<br />
vessie. Si l’urine montre <strong>de</strong>s signes d’infection, une dose <strong>de</strong> terramycine (0,1 ml) est administrée en<br />
intrapéritonéal pendant 5 jours. Si l’animal exhibe <strong>de</strong>s signes <strong>de</strong> souffrance, un traitement au<br />
BUPRECARE est administré.<br />
- Autres protocoles : Protocoles d’analyse du comportement<br />
Mesure <strong>de</strong> la récupération fonctionnelle après section du nerf péronier<br />
Mesure <strong>de</strong> l’empreinte du pas<br />
Les mesures <strong>de</strong> la longueur du pas (PL : print lenght) et <strong>de</strong> l’écartement <strong>de</strong>s orteils entre le premier et le<br />
cinquième orteil (TS : toe spread) sont réalisées après imprégnation avec <strong>de</strong> l’encre indélébile <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux<br />
pattes arrières du rat. Nous avons utilisé la formule <strong>de</strong> l’in<strong>de</strong>x fonctionnel péronier <strong>de</strong> Bain-Mackinnon-<br />
Hunter en prenant les moyennes <strong>de</strong>s valeurs du côté sain (N : normal) et du côté lésé (E : experimental)<br />
sur trois pas consécutifs sans arrêt. La formule s’écrit <strong>de</strong> la manière suivante :<br />
PFI(peroneal function in<strong>de</strong>x)= 174.9x[(EPL-NPL)/NPL] + 80,3x[(ETS-NTS)/NTS] - 13.4<br />
Le score d’un animal sain s’établit à -13.4<br />
Analyse cinématique <strong>de</strong> la marche : étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s amplitu<strong>de</strong>s articulaires avec le logiciel SIMI motion®<br />
Cette étu<strong>de</strong> nécessite au préalable le marquage au feutre indélébile <strong>de</strong> quatre points articulaires en regard<br />
<strong>de</strong> la hanche (trochantaris major), du genou (condylus lateralis), <strong>de</strong> la cheville (malleolus lateralis) et <strong>de</strong> la<br />
tête du cinquième métatarsien <strong>de</strong> la patte arrière gauche. L’enregistrement vidéo permet l’analyse du<br />
déplacement en 2D <strong>de</strong>s 4 points sur 3 pas consécutifs sans arrêt. Le logiciel SIMI motion® traite les<br />
données sur chacune <strong>de</strong>s 50 acquisitions par secon<strong>de</strong> et détermine les courbes <strong>de</strong>s angles du genou et <strong>de</strong> la<br />
cheville au cours du déplacement. Nous avons étudié les amplitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong>s angles <strong>de</strong> dorsiflexion <strong>de</strong> la<br />
cheville et <strong>de</strong> flexion du genou pendant la phase <strong>de</strong> balancé, les valeurs <strong>de</strong> l’angle <strong>de</strong> dorsiflexion <strong>de</strong> la<br />
cheville au milieu (mid swing) et en fin <strong>de</strong> la phase <strong>de</strong> balancé (terminal swing).<br />
Mesure <strong>de</strong> la récupération fonctionnelle après section ou compression <strong>de</strong> la moelle épinière<br />
Mesure <strong>de</strong> la locomotion et <strong>de</strong> la démarche<br />
On utilise le test BBB. Les animaux sont placés dans un openfield et observés pendant 4 minutes. Les<br />
principales mesures concernent le mouvement <strong>de</strong> chacune <strong>de</strong>s articulations <strong>de</strong>s pattes inférieures, la<br />
capacité <strong>de</strong> l’animal à supporter son poids et la démarche <strong>de</strong> l’animal lorsque celui-ci parvient à se tenir<br />
sur ses pattes postérieures. Chaque animal se voit attribuer un nombre <strong>de</strong> points variant entre 0 et 21.<br />
Chaque animal est testé une fois par semaine sur <strong>de</strong>s pério<strong>de</strong>s allant <strong>de</strong> 12 à 36 semaines.<br />
Mesure <strong>de</strong> la nage<br />
96
L’animal est placé dans un couloir <strong>de</strong> nage en verre, suffisamment étroit pour qu’il ne puisse revenir à sa<br />
plateforme d’origine. L’animal est filmé et le mouvement <strong>de</strong> la patte est ensuite analysé avec le logiciel<br />
SIMI motion® décrit plus haut.<br />
Comportement sur une échelle inclinée<br />
L’animal est placé sur une échelle horizontale. Cette <strong>de</strong>rnière est ensuite progressivement élevée à l’une <strong>de</strong><br />
ses extrémités jusqu’à atteindre l’angle <strong>de</strong> 55°. Lorsque l’échelle est inclinée <strong>de</strong> la sorte, l’animal ne peut<br />
tenir agrippé à l’échelle avec la seule force <strong>de</strong> ses pattes antérieures. Il a besoin <strong>de</strong> l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> ses pattes<br />
postérieures pour pouvoir se maintenir sur les barreaux.<br />
Mesure <strong>de</strong> la paralysie induite par l’injection d’un pepti<strong>de</strong> myélinique (modèle EAE <strong>de</strong> sclérose en<br />
plaques)<br />
Un cocktail contenant <strong>de</strong> l’adjuvant <strong>de</strong> Freund, la mycobactérie tuberculosis, le pepti<strong>de</strong> MOG (Myelin<br />
Oligo<strong>de</strong>ndrocyte Glycoprotein) est injecté en sous cutané, au niveau <strong>de</strong> la nuque. Les premiers signes<br />
cliniques sont observés 2 à 3 semaines après l’injection. L’échelle d’évaluation comprend six sta<strong>de</strong>s. Les<br />
animaux sont observés quotidiennement dans un openfield pendant 40 jours.<br />
0 Pas <strong>de</strong> symptômes<br />
1 Queue flacci<strong>de</strong><br />
2 Faiblesse du train arrière (mais plie les 2 pattes)<br />
Démarche surbaissée<br />
2,5 Faiblesse du train arrière (mais plie les 2 pattes)<br />
Démarche surbaissée<br />
Perte d’équilibre ou tremblement (« tangue »)<br />
3 Paralysie partielle du train arrière (plie 1 patte, l’autre « traîne »)<br />
4 Paralysie totale du train arrière<br />
5 Paralysie totale du train arrière<br />
Troubles sphinctériens<br />
Hémorragies oculaires, nasales, etc.<br />
Parésie ou paralysie partielle ou totale <strong>de</strong>s pattes avant<br />
5,5 Sta<strong>de</strong> moribond sans mort immédiate<br />
6 Sta<strong>de</strong> moribond sans mort immédiate<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs : rats et souris<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
97
Neurobiologie <strong>de</strong>s canaux ioniques UMR 641<br />
INSERM<br />
<strong>Equipe</strong> 1<br />
Intitulé : Plasticité <strong>de</strong> l’excitabilité et Epilepsie<br />
Responsable : Dr. Dominique DEBANNE<br />
98
Intitulé : Plasticité <strong>de</strong> l’excitabilité et Epilepsie<br />
Responsable : Dr. Dominique DEBANNE<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la plasticité <strong>de</strong> la transmission synaptique et <strong>de</strong> la plasticité intrinsèque <strong>de</strong>s neurones<br />
<strong>de</strong> l’hippocampe et du cortex in vitro (tranches en survie et cultures). Electrophysiologie en<br />
patch-clamp et imagerie confocale dynamique.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
� Rattus norvegicus : souche Wistar, ratons entre P5-P20.<br />
� Mus musculus : Souris transgéniques sur fond C57/Bl6 exprimant le gène <strong>de</strong> la<br />
recombinase Cre sous contrôle du promoteur <strong>de</strong> la parvalbumine et le gène pour la<br />
green fluorescent protein encadré par <strong>de</strong>s séquences loxP. Souriceaux entre P5 et P15<br />
exprimant la GFP dans une classe particulière d’interneurones inhibiteurs.<br />
Dans les <strong>de</strong>ux cas les animaux sont utilisés pour produire <strong>de</strong>s tranches <strong>de</strong> cortex ou<br />
d’hippocampe <strong>de</strong>stinées à l’enregistrement en électrophysiologie avec ou sans mise en culture<br />
préalable. Le modèle est non substituable par <strong>de</strong>s lignées cellulaires en culture ou par un<br />
système reconstitué.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
Anesthésie profon<strong>de</strong> par injection ip d’hydrate <strong>de</strong> chloral 8% en solution isotonique, 400<br />
mg/kg, suivie d’euthanasie par décapitation avant prélèvement du cerveau.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Dominique DEBANNE, N° d’autorisation : 13-145<br />
Edmond CARLIER, N° d’autorisation : 13-153<br />
Sylvain RAMA, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Olivier CAILLARD, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
Franck DUBRUC, (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> d’autorisation en cours)<br />
99
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles : euthanasie par décapitation après anesthésie.<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
101
Neurobiologie <strong>de</strong>s canaux ioniques UMR 641<br />
INSERM<br />
<strong>Equipe</strong> 2<br />
Intitulé : Homéostasie <strong>de</strong> l’Excitabilité et Neuromodulation<br />
Responsable : Dr. Jean-Marc GOAILLARD<br />
102
Intitulé : Homéostasie <strong>de</strong> l’Excitabilité et Neuromodulation<br />
Responsable : Dr. Jean-Marc GOAILLARD<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Electrophysiologie sur tranches, enregistrements <strong>de</strong> neurones dopaminergiques <strong>de</strong> la<br />
substance noire compacte <strong>de</strong> rats et <strong>de</strong> souris. Egalement enregistrements <strong>de</strong> cellules<br />
dissociées, et bientôt cultures primaires <strong>de</strong> substance noire compacte <strong>de</strong> souris.<br />
Les animaux sont utilisés pour produire <strong>de</strong>s tranches pour l’enregistrement en<br />
électrophysiologie avec ou sans mise en culture préalable. Le modèle est non substituable par<br />
<strong>de</strong>s lignées cellulaires en culture ou par un système reconstitué.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Rats, souris, incluant <strong>de</strong>s souris transgéniques TH-GFP (déjà présentes à l’animalerie).<br />
Les animaux sont utilisés pour produire <strong>de</strong>s tranches pour l’enregistrement en<br />
électrophysiologie avec ou sans mise en culture préalable. Le modèle est non substituable par<br />
<strong>de</strong>s lignées cellulaires en culture ou par un système reconstitué.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
Euthanasie par décapitation après anesthésie préalable à l’isoflurane.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Jean-Marc GOAILLARD, N° d’autorisation : 13-375<br />
A<strong>de</strong>le WOODHOUSE<br />
Martial DUFOUR, (inscrit en formation <strong>de</strong> niveau1)<br />
Marion BAUDOUX titulaire d’un niveau2<br />
103
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o<br />
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Tourner la feuille SVP �<br />
104<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles : euthanasie par décapitation après anesthésie.<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
105
Neurobiologie <strong>de</strong>s canaux ioniques UMR 641<br />
INSERM<br />
<strong>Equipe</strong> 3<br />
Intitulé : Mécanismes moléculaires <strong>de</strong> la libération <strong>de</strong><br />
neurotransmetteurs<br />
Responsable : Dr. Oussama EL FAR<br />
106
Intitulé : Mécanismes moléculaires <strong>de</strong> la libération <strong>de</strong> neurotransmetteurs<br />
Responsable : Dr. Oussama EL FAR<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s mécanismes moléculaires <strong>de</strong> la libération <strong>de</strong> neurotransmetteurs sur <strong>de</strong>s cultures<br />
neuronales d’hippocampe, <strong>de</strong> cortex ainsi que <strong>de</strong> ganglions cervicaux in vitro<br />
(Electrophysiologie en patch-clamp). Biochimie <strong>de</strong>s interactions protéiques sur <strong>de</strong>s extraits <strong>de</strong><br />
cerveau.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Rattus norvegicus : souche Wistar, ratons entre P5-P20 ainsi que rat adulte<br />
Mus musculus, adulte<br />
Les cerveaux <strong>de</strong> ces animaux sont extraits pour étudier biochimiquement les interactions<br />
protéiques. Aussi, les animaux sont utilisés pour produire <strong>de</strong>s cultures neuronales <strong>de</strong>stinées à<br />
l’enregistrement en électrophysiologie. Le modèle est non substituable par <strong>de</strong>s lignées<br />
cellulaires en culture ou par un système reconstitué.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
Anesthésie profon<strong>de</strong> par injection ip d’hydrate <strong>de</strong> chloral 8% en solution isotonique, 400<br />
mg/kg, suivie d’euthanasie par décapitation avant prélèvement.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Oussama EL FAR, N° d’autorisation : 13-177<br />
Cécile IBORRA, N° d’autorisation : 13-284 (<strong>de</strong>man<strong>de</strong> <strong>de</strong> renouvellement en cours)<br />
107
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles : euthanasie par décapitation après anesthésie.<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
109
Physiologie et physiopathologie en conditions<br />
d’oxygénation extrêmes (P2COE) UMR MD2<br />
Intitulé : Suractivité et fatigue<br />
Responsable : Pr. Yves JAMMES<br />
<strong>Equipe</strong> 1<br />
110
Intitulé : Suractivité et fatigue<br />
Responsable : Pr. Yves JAMMES<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Création <strong>de</strong> modèles animaux reproduisant les conditions et les conséquences physiologiques<br />
et biochimiques <strong>de</strong> la suractivité physique.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Les espèces animales utilisées sont le rat et la souris. Les rongeurs constituent les modèles<br />
animaux les plus utilisés dans les étu<strong>de</strong>s physiologiques en général et dans le domaine <strong>de</strong> la<br />
suractivité en particulier. De plus, l’équipe a réalisé tous ses travaux précé<strong>de</strong>nts sur ce<br />
modèle. Il est connu aussi que l’essentiel <strong>de</strong>s travaux publiés en relation avec la thématique<br />
ont été réalisés sur le rat et la souris.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Explorations chez le rat vigile : conditionnement à l’hypoxie normobare associé<br />
ou non à une programme d’entrainement sur tapis roulant.<br />
Contrôles <strong>de</strong> concentrations en O2 et CO2 dans l’enceinte – nourriture et boisson ad libidum<br />
Examens cliniques : mesures non invasive <strong>de</strong> saturation transcutanée en O2 (SpO2) et <strong>de</strong><br />
fréquence cardiaque par un capteur placé transitoirement sur la queue ou une patte postérieure<br />
(Système Mouse Ox, WWPI)<br />
Au terme d’un protocole <strong>de</strong> conditionnement, anesthésie générale par injection<br />
intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique à la dose <strong>de</strong> 60mg/kg, puis on procè<strong>de</strong> :<br />
� Aux prélèvements d’organes (muscles squelettiques, diaphragme, cœur, foie, cerveau,<br />
poumons) : dosages <strong>de</strong> marqueurs du stress oxydatif, <strong>de</strong> cytokines ou/et <strong>de</strong> protéines<br />
<strong>de</strong> stress<br />
� Aux enregistrements électrophysiologiques d’activités afférentes musculaires<br />
(ventilation mécanique – mesures continues <strong>de</strong> pression artérielle, SpO2 et fréquence<br />
cardiaque). Euthanasie en fin d’expérience par injection intraartérielle d’une dose<br />
létale <strong>de</strong> pentobarbital sodique<br />
111
� Explorations chez le rat anesthésié :<br />
� Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s conséquences <strong>de</strong> la fatigue musculaire induite par stimulation<br />
électrique sur la production (ELISA) et l’expression (Western blot) <strong>de</strong>s<br />
protéines <strong>de</strong> stress (HSPs)<br />
� Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s conséquences <strong>de</strong> variations <strong>de</strong> température intramusculaire<br />
(réchauffement ou refroidissement obtenus par effet Pelletier) sur<br />
l’activité spontanée <strong>de</strong>s métaborécepteurs (afférences du groupe IV) et<br />
leur réponse à une fatigue induite par stimulation électrique<br />
� Protocole général :<br />
Anesthésie générale induite par injection intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique à la<br />
dose <strong>de</strong> 60mg/kg et poursuivie par répétition <strong>de</strong>s doses en intraveineuse.<br />
Contrôle du niveau d’anesthésie par mesure et surveillance continue <strong>de</strong> pression<br />
artérielle carotidienne et <strong>de</strong> fréquence cardiaque.<br />
Contrôle <strong>de</strong> l’état d’oxygénation sous ventilation mécanique (10ml/kg) par<br />
surveillance continue <strong>de</strong> SpO2 (MouseOx WPI)<br />
Remarque : Les espèces souris ne fait pas l’objet <strong>de</strong> protocoles actuels<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Yves JAMMES, N° d’autorisation : 13-44<br />
Jean Guillaume STEINBERG, N° d’autorisation : 13-45<br />
Stéphane DELPIERRE, N° d’autorisation : 13-46<br />
112
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
r h h u u o a o a a u a e u o v o a q a u e x l é u o<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Au terme d’un protocole <strong>de</strong> conditionnement, anesthésie générale par injection<br />
intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique à la dose <strong>de</strong> 70mg/kg, puis on procè<strong>de</strong> aux<br />
prélèvements d’organes (muscles squelettiques, diaphragme, cœur, foie, cerveau,<br />
poumons) : dosages <strong>de</strong> marqueurs du stress oxydatif, <strong>de</strong> cytokines ou/et <strong>de</strong> protéines <strong>de</strong><br />
stress<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles : euthanasie par décapitation après anesthésie.<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
114
Physiologie et physiopathologie en conditions<br />
d’oxygénation extrêmes (P2COE) UMR MD2<br />
<strong>Equipe</strong> 2<br />
Intitulé : Dysoxie, Système Adénosinergique et Inflammation<br />
Responsable : Dr. Jean RUF<br />
115
Intitulé : Dysoxie, Système Adénosinergique et Inflammation<br />
Responsable : Dr. Jean RUF<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Recherche fondamentale<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Les espèces animales utilisées est la souris. La souris constitue le modèle animal le plus<br />
utilisé dans les étu<strong>de</strong>s physiologiques en général et dans la thématique <strong>de</strong> l’équipe en<br />
particulier. Il est connu aussi que l’essentiel <strong>de</strong>s travaux publiés en relation avec la thématique<br />
ont été réalisés sur le rat et la souris.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
� Production d’anticorps monoclonaux murins<br />
Administration <strong>de</strong> substances sur animaux vigiles (souris) : 2 injections, à 15 jours<br />
d’intervalle, d’immunogène protéique ou peptidique en tampon salin par voie i.p. en présence<br />
d’adjuvant (Adjuvant complet puis incomplet <strong>de</strong> Freund) puis, 15 jours plus tard, rappel par<br />
voie i.v. sans adjuvant.<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substance sur animaux anesthésiés (souris) : Avant immunisation (sta<strong>de</strong> pré-<br />
immun) et avant le rappel i.v. (sta<strong>de</strong> immun), les souris sont anesthésiées à l’isofluorane pour<br />
prélèvement sanguin sur tube hépariné à partir du sinus rétro-orbital afin <strong>de</strong> choisir celles<br />
ayant développé le plus d’anticorps spécifiques <strong>de</strong> l’immunogène.<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux en vue <strong>de</strong> prélèvement (souris) : 3 jours après le rappel i.v. <strong>de</strong>s souris<br />
immunes, euthanasie <strong>de</strong> ces souris par dislocation cervicale pour prélèvement <strong>de</strong> rate en vue<br />
<strong>de</strong> fusion cellulaire <strong>de</strong>s cellules spléniques avec un myélome murin.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Josée-Martine DURAND-GORDE, N° d’autorisation : 13-194<br />
Jean RUF, N° d’autorisation : 13-195<br />
116
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substances<br />
sur animaux anesthésiés<br />
(les décrire au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions chirurgicales<br />
(les décrire au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
p c c f a s r c h h a l g a b o p c é c a r a p x a p<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
Prélèvement <strong>de</strong> substance sur animaux anesthésiés (souris) : Avant immunisation (sta<strong>de</strong><br />
pré-immun) et avant le rappel i.v. (sta<strong>de</strong> immun), les souris sont anesthésiées à<br />
l’isofluorane pour prélèvement sanguin sur tube hépariné à partir du sinus rétro-orbital<br />
afin <strong>de</strong> choisir celles ayant développé le plus d’anticorps spécifiques <strong>de</strong> l’immunogène.<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
118
Physiologie et physiopathologie en conditions<br />
d’oxygénation extrêmes (P2COE) UMR MD2<br />
<strong>Equipe</strong> 3<br />
Intitulé : Physiopathologie et action thérapeutique <strong>de</strong>s gaz en hypo<br />
et hyperpression<br />
Responsable : Dr. Jean-Clau<strong>de</strong> ROSTAIN<br />
119
Intitulé : Physiopathologie et action thérapeutique <strong>de</strong>s gaz en hypo et<br />
hyperpression<br />
Responsable : Dr. Jean-Clau<strong>de</strong> ROSTAIN<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Les recherches s'intéressent aux interactions qui existent entre différents systèmes <strong>de</strong><br />
neurotransmission au sein <strong>de</strong> certaines structures nerveuses, le rôle <strong>de</strong>s récepteurs et les<br />
modifications que provoquent <strong>de</strong>s environnements particuliers notamment les effets <strong>de</strong>s gaz<br />
inertes (narcose aux gaz inertes), <strong>de</strong> la pression (hypo ou hyper pression) ou <strong>de</strong> l’hypoxie et<br />
<strong>de</strong> l'hyperoxie. Des recherches comportementales sont effectuées sur <strong>de</strong>s rats, souris, cobayes<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Rat, souris, cobaye.<br />
Le choix <strong>de</strong> ces espèces est dicté par la facilité à se les procurer et les maintenir ou reproduire<br />
en laboratoire. Sa standardisation, la taille <strong>de</strong>s animaux permet <strong>de</strong> l’utiliser pour <strong>de</strong>s<br />
techniques <strong>de</strong> stéréotaxie. Finalement la généralisation <strong>de</strong> son utilisation permet la<br />
comparaison <strong>de</strong>s résultats obtenus avec ceux d’autres équipes <strong>de</strong> recherche <strong>de</strong> part le mon<strong>de</strong>.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
Les étu<strong>de</strong>s effectuées en environnements extrêmes (hyperoxie, hautes pressions, narcose aux<br />
gaz inertes) sont réalisées sur <strong>de</strong>s animaux bioinstrumentés, éveillés, libres <strong>de</strong> mouvements<br />
(rats, souris, cobayes). Ils sont exposés à l'intérieur d'un caisson hyperbare à l'augmentation <strong>de</strong><br />
pression <strong>de</strong> mélange respiratoire contenant <strong>de</strong>s gaz inertes. Des substances antagonistes ou<br />
agonistes <strong>de</strong> certains récepteurs sont administrées par voie intraventriculaires ou focalement<br />
dans certaines structures centrales. Les neurotransmetteurs étudiés sont soit recueillis par<br />
microdialyse et ensuite dosés par HPLC, soit dosés par voltamétrie. Les animaux qui ont<br />
terminé le cycle expérimental sont euthanasiés.<br />
Interventions chirurgicales<br />
120
Justifications scientifiques : les étu<strong>de</strong>s sur les interactions <strong>de</strong> la neurotransmission aci<strong>de</strong><br />
aminergique et monoaminergique au niveau <strong>de</strong>s voies nigro-striés ou striato pallidales et les<br />
modifications entraînées par la narcose aux gaz inertes, la pression ou l'hyperoxie, nécessitent<br />
l'implantation sous contrôle stéréotaxique<br />
- <strong>de</strong> canules pour l'injection <strong>de</strong> substances pharmacologiques soit dans l'un ou l'autre <strong>de</strong>s<br />
compartiments <strong>de</strong> la substance noire, soit dans les ventricules latéraux;<br />
- d'électro<strong>de</strong>s en fibre <strong>de</strong> carbone permettant <strong>de</strong> mesurer la libération <strong>de</strong> certains<br />
neurotransmetteurs au niveau du striatum ou du noyau accumbens;<br />
- <strong>de</strong> son<strong>de</strong>s <strong>de</strong> microdialyse permettant <strong>de</strong> recueillir <strong>de</strong>s dialysats au niveau du striatum par<br />
exemple;<br />
- d'électro<strong>de</strong>s pour le recueil <strong>de</strong>s activités électrophysiologiques au niveau du striatum ou du<br />
globus pallidus.<br />
1 Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’interaction aci<strong>de</strong> aminés et monoamines au niveau <strong>de</strong> la voie nigro-<br />
striée. Effets <strong>de</strong>s gaz inertes et <strong>de</strong> la pression<br />
Les animaux sont <strong>de</strong>s rats males Sprague Dawley (Charles River) d’un poids avoisinant les<br />
300g. L’intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale. Les animaux sont<br />
soumis à une anesthésie gazeuse à l’halothane (Halothane ® , Belamont) afin <strong>de</strong> pouvoir les<br />
manipuler sans stess pour l’injections <strong>de</strong>s anesthésiques. L’anesthésie pour l’intervention<br />
chirurgicale est pratiquée par l'injection intrapéritonéale <strong>de</strong> pentobarbital sodique à 30 mg/kg<br />
(Sanofi Santé Animal) et entretenue par <strong>de</strong>s injections intramusculaires <strong>de</strong> kétamine à 100<br />
mg/kg (Imalgène ® 500, laboratoire Rhône- Mérieux).<br />
Les animaux anesthésiés sont installés dans un appareil <strong>de</strong> contention stéréotaxique<br />
(Référence: DAVID KOPF DKI 900). La tête <strong>de</strong> l'animal est immobilisée, et centrée, à l'ai<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>s barres d'oreilles, et d'une barre d'incisives réglée à – 3,9 mm, correspondant à <strong>de</strong>s rats<br />
mâles Sprague-Dawley d’un poids <strong>de</strong> 299 ± 20 g (Paxinos et Watson, 1986).<br />
La peau du crâne est incisée, les tissus sous jacents enlevés, et l'os crânien ainsi dégagé et<br />
nettoyé à l’eau oxygénée puis séché. Des électro<strong>de</strong>s <strong>de</strong> référence et auxiliaire constituées par<br />
<strong>de</strong>s vis inoxydables sont vissées dans l’os du crâne. Des trous sont réalisés dans l'os du crâne,<br />
à l'ai<strong>de</strong> d'une fraise <strong>de</strong> <strong>de</strong>ntiste pour permettre le passage d’électro<strong>de</strong>s en multifibre <strong>de</strong><br />
carbone et <strong>de</strong> gui<strong>de</strong> canule. Les électro<strong>de</strong>s multifibres <strong>de</strong> carbone (MFC) peuvent être<br />
endommagées lors <strong>de</strong> l'implantation, à travers la dure-mère. Par conséquent, avant la <strong>de</strong>scente<br />
121
<strong>de</strong>s électro<strong>de</strong>s en MFC, la dure-mère est incisée, et la surface du cerveau est nettoyée afin<br />
qu'il ne reste ni débris d’os, ni sang, ni œdème. De plus, il ne doit pas y avoir <strong>de</strong> saignement<br />
lors <strong>de</strong> l'implantation <strong>de</strong> l’électro<strong>de</strong> afin d’éviter que la surface active <strong>de</strong> l’électro<strong>de</strong><br />
s’imprègne <strong>de</strong> sang, cela pourrait entraîner une atténuation <strong>de</strong> la sélectivité <strong>de</strong>s signaux<br />
détectés (présence d’amines dans le sang).<br />
L'implantation bilatérale <strong>de</strong>s électro<strong>de</strong>s MFC et <strong>de</strong>s gui<strong>de</strong>s <strong>de</strong> canule est réalisée d’après les<br />
coordonnées <strong>de</strong> l’atlas stéréotaxique (Paxinos et Watson, 1986), déterminées par rapport au<br />
point théorique λ qui se situe à l'intersection définie par les barres d'oreilles et le plan sagittal.<br />
Les coordonnées <strong>de</strong>s implantations intracérébroventriculaires sont déterminées par rapport<br />
aux coordonnées moyennes obtenues par rapport au point théorique λ et au point réel β, qui se<br />
situe à l'intersection <strong>de</strong>s plaques osseuses antérieures du crâne et du plan sagittal.<br />
Les électro<strong>de</strong>s <strong>de</strong> travail sont implantées dans le striatum dorsal, aux coordonnées suivantes:<br />
Striatum : Antériorité = + 10,00 mm,<br />
Latéralité = + 2,90 mm,<br />
Hauteur = + 5,00 mm.<br />
Les gui<strong>de</strong>s <strong>de</strong>s canules d’injection sont fabriqués par nos soins à partir d’aiguilles (21G)<br />
coupées à chaque extrémité. Les canules permettant l’injection sont propres à chaque gui<strong>de</strong>, et<br />
sont fabriquées à partir d’aiguilles <strong>de</strong> taille inférieure (25G). L’extrémité est déplastifiée <strong>de</strong><br />
façon à permettre la fixation <strong>de</strong> la tubulure. Les gui<strong>de</strong>s <strong>de</strong> canule sont implantés dans la<br />
substance noire pars compacta (SNc), la substance noire pars reticulata (SNr) ou dans le<br />
ventricule latéral droit, aux coordonnées suivantes<br />
SNc : Antériorité = + 4,00 mm,<br />
Latéralité = + 1,80 mm,<br />
Hauteur = + 2,20 mm.<br />
SNr : Antériorité = + 3,80 mm,<br />
Latéralité = + 2,50 mm,<br />
Hauteur = + 2,00 mm.<br />
Ventricule : (β) Antériorité = - 0.92 mm,<br />
Latéralité = + 1,50 mm,<br />
Hauteur = - 3,50 mm.<br />
Ventricule : (λ) Antériorité = + 8,08 mm,<br />
122
Latéralité = + 1,50 mm,<br />
Hauteur = + 6,50 mm.<br />
Les fils conducteurs <strong>de</strong>s électro<strong>de</strong>s sont ensuite soudés à un miniconnecteur (Ouest<br />
électronique EM 5F). L’ensemble électro<strong>de</strong>s, miniconnecteur, gui<strong>de</strong>s <strong>de</strong> canule, est fixé au<br />
crâne <strong>de</strong> l’animal par une résine <strong>de</strong>ntaire auto-polymérisante (Unifast trad, Japon). De la<br />
poudre antibiotique est pulvérisée sur ‘ensemble avant que la peau soit recousue. Un gel <strong>de</strong><br />
Xylocaïne est passé sur la plaie. L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong><br />
BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à 0.5 mg/kg pour le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les<br />
injections se font toutes les 6 à 12 heures.<br />
Les gui<strong>de</strong>s <strong>de</strong> canule sont obturés jusqu'au jour <strong>de</strong> l'expérience qui se fera sur <strong>de</strong>s animaux<br />
vigiles libres <strong>de</strong> mouvements. Les animaux sont placés dans une cage <strong>de</strong> réveil, puis après le<br />
réveil dans une armoire à animaux (IFFA CREDO) où ils sont laissés pendant au moins une<br />
semaine avant <strong>de</strong> commencer les expériences.<br />
2 Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s intéractions aci<strong>de</strong>s aminés et monoamines au niveau <strong>de</strong> la voie striato<br />
pallidale. Effets <strong>de</strong>s gaz inertes et <strong>de</strong> la pression.<br />
L’anesthésie et l’intervention chirurgicale sont réalisées sur <strong>de</strong>s rats males Sprague Dawley<br />
(~300g) selon le même protocole décrit précé<strong>de</strong>mment.<br />
Dans ce cas, <strong>de</strong>s gui<strong>de</strong>s canules (Carnegie Me<strong>de</strong>cine, Phymep, Paris) sont implantés dans le<br />
striatum et/ou le globus pallidus<br />
Le gui<strong>de</strong> canule est positionné stéréotaxiquement selon les coordonnées <strong>de</strong> l’atlas <strong>de</strong> Konig et<br />
Klippel (1967) pour que la canule <strong>de</strong> microdialyse, une fois mise en place dans le gui<strong>de</strong>, soit<br />
localisée soit dans le striatum ou dans le globus pallidus.<br />
Striatum Antériorité: 7.98<br />
Latéralité: 2.5<br />
Hauteur:2.00<br />
Globus pallidus Antériorité: 6.67<br />
Latéralité: 2.4<br />
Hauteur:0.5<br />
Ces gui<strong>de</strong>s sont fixés sur la boîte crânienne par <strong>de</strong> la résine <strong>de</strong>ntaire. Après pulvérisation d’un<br />
antibiotique et pose d’un gel <strong>de</strong> Xylocaïne la peau est suturée. L’animal est ensuite placé dans<br />
une cage <strong>de</strong> réveil. Une fois réveillé, l’animal est placé dans une armoire (IFFA CREDO) où<br />
123
il est laissé au moins une semaine avant <strong>de</strong> commencer les expériences. A ce moment la son<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> microdyalise est <strong>de</strong>scendue dans le gui<strong>de</strong> canule sur l’animal vigile et libre <strong>de</strong> mouvement.<br />
L’analgésie est assurée par une injection sous cutanée <strong>de</strong> BUPRECARE à la dose <strong>de</strong> 0.02 à<br />
0.5 mg/kg pour le rat et 0.5 à 2.5 mg/kg pour la souris. Les injections se font toutes les 6 à 12<br />
heures.<br />
3 Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’activité électrique <strong>de</strong>s neurones striataux ou du globus pallidus. Effet<br />
<strong>de</strong>s gaz inertes.<br />
� Animal chronique<br />
L’anesthésie et l’intervention chirurgicale sont réalisées sur <strong>de</strong>s rats males Sprague Dawley (~<br />
300g) selon le protocole décrit précé<strong>de</strong>mment. Les électro<strong>de</strong>s d’électrophysiologie sont en<br />
acier et sont implantées selon la procédure décrite en précé<strong>de</strong>mment pour les électro<strong>de</strong>s MFC<br />
et les gui<strong>de</strong>s canules.<br />
Le même protocole est appliqué pour le réveil et la pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> récupération.<br />
� Animal aiguë<br />
Les rats males Spragues Dawley (~300g) sont anesthésiés au Chloral hydrate (400mg/kg intra<br />
peritonéal) et placés sur un appareil <strong>de</strong> contention selon la procédure décrite en 1. Des trous<br />
sont pratiqués dans l’os du crâne pour pouvoir accé<strong>de</strong>r dans le striatum ou au globus pallidus.<br />
La dure mère est incisée. Les microélectro<strong>de</strong>s <strong>de</strong> verre sont <strong>de</strong>scendues à l’ai<strong>de</strong> d’un micro<br />
<strong>de</strong>scen<strong>de</strong>ur.<br />
A la fin <strong>de</strong> l’expérience l’animal est sacrifié par injection intracardiaque <strong>de</strong> pentobarbital.<br />
4 Etu<strong>de</strong> neurochimique <strong>de</strong>s effets <strong>de</strong> l’hyperoxie ou <strong>de</strong> l’hypoxie sur le<br />
système nerveux central.<br />
Le protocole d’anesthésie et l’intervention chirurgicale est le même que celui décrit en 1. Les<br />
électro<strong>de</strong>s EEG sont constituées <strong>de</strong> vis en acier inoxydables vissés dans l’os. Les soins, le<br />
réveil et la pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> récupération sont les mêmes que celles décrite en 1.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Jean-Clau<strong>de</strong> ROSTAIN, N° d’autorisation : 13-106<br />
Michel LUCCIANO,<br />
Alain BOUSSUGES,<br />
Karine AYME<br />
124
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
Sous anesthésie générale, implantation sous contrôle stéréotaxique d’électro<strong>de</strong>s ou <strong>de</strong> son<strong>de</strong> <strong>de</strong> micro<br />
dialyse, <strong>de</strong> canules d’injection dans <strong>de</strong>s structures nerveuses sous corticales (ganglions <strong>de</strong> la base, noyaux<br />
thalamiques, ventricules …) (voir les protocoles sur les animaux)<br />
- Autres protocoles :<br />
Administration <strong>de</strong> substances pharmacologiques sur animaux vigiles. Enregistrements <strong>de</strong> données électro<br />
physiologiques, électrochimiques, neurochimiques.<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
126
NEURON EXPERTS sas<br />
Responsable : Rémy STEINSCHNEIDER, PhD<br />
127
NEURON EXPERTS sas<br />
Responsable : Dr. Rémy STEINSCHNEIDER<br />
A – Domaine d’activité et justification<br />
Neuron experts est une société <strong>de</strong> recherche (CRO) sous contrats en neurologie. Son activité<br />
est l'étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> nouvelles molécules dans <strong>de</strong>s modèles cellulaires primaires pertinents et<br />
innovants <strong>de</strong> pathologies neurodégénératives, neuropathies périphériques, ou sclérose latérale<br />
amyotrophique inclues. L'hyperspécialisation <strong>de</strong> neuron experts est sa capacité à modéliser<br />
<strong>de</strong>s maladies neuro-dégénératives à partir <strong>de</strong> primocultures <strong>de</strong> neurones issue d’embryons <strong>de</strong><br />
rats et <strong>de</strong> souris.<br />
B – Espèces animales utilisées et justification<br />
Neuron experts utilise <strong>de</strong>s embryons <strong>de</strong> rats ou <strong>de</strong> souris entre 11 et 17 jours pour récupérer le<br />
système nerveux (DRG, moelle épinière, cortex) afin <strong>de</strong> les mettre en culture.<br />
C – Protocole expérimental sur l’animal<br />
Les femelles gestantes sont euthanasiées dans l’animalerie <strong>de</strong> l’IFR Jean Roche et les<br />
embryons sont récupérés dans les locaux <strong>de</strong> neuron experts en condition stérile.<br />
La technique d’euthanasie est une technique chimique avec un agent volatil le dioxy<strong>de</strong> <strong>de</strong><br />
carbone avec une saturation progressive.<br />
D - Liste <strong>de</strong>s membres <strong>de</strong> l’équipe<br />
Noëlle CALLIZOT, Directrice scientifique, Pharmacien et PhD, (Deman<strong>de</strong> <strong>de</strong> transfert<br />
d’autorisation d’expérimenter <strong>de</strong> DDPP 67 en cours)<br />
Mau<strong>de</strong> COMBES, Responsable du laboratoire, Ingénieur, inscrite à la formation Niveau 1<br />
(septembre 2012 sur <strong>Marseille</strong>, CNRS entreprise)<br />
Sylvain EINIUS, Technicien<br />
128
Cadre réservé à<br />
l’Administration<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Administration <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux vigiles<br />
Examens cliniques sur<br />
animaux anesthésiés (les<br />
décrire au verso)<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
vigiles<br />
Prélèvement <strong>de</strong><br />
substances sur animaux<br />
anesthésiés (les décrire<br />
au verso)<br />
Euthanasie <strong>de</strong>s animaux<br />
en vue d’examens et<br />
prélèvements<br />
Interventions<br />
chirurgicales (les décrire<br />
au verso)<br />
Conditionnement,<br />
apprentissage<br />
Autre protocole (à<br />
préciser)<br />
FICHE DE RENSEIGNEMENTS SUR LES PROTOCOLES MIS EN OEUVRE ET LES ANIMAUX<br />
UTILISES FICHE N° 2<br />
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Décrire <strong>de</strong> façon précise les protocoles suivants :<br />
-Examens cliniques sur animaux anesthésiés :<br />
- Prélèvement <strong>de</strong> substances sur animaux anesthésiés :<br />
- Interventions chirurgicales :<br />
- Autres protocoles :<br />
Préciser les espèces utilisées pour les animaux suivants :<br />
-Primates non humains :<br />
-Autres carnivores domestiques :<br />
-Autres rongeurs :<br />
-Autres lagomorphes :<br />
-Autres oiseaux :<br />
-Reptiles :<br />
-Autres amphibiens :<br />
-Poissons :<br />
Préciser les autres espèces utilisées, mentionnées dans la <strong>de</strong>rnière colonne du tableau :<br />
130
LE PERSONNEL<br />
Liste <strong>de</strong>s personnels autorisés à expérimenter<br />
64 personnes détentrices d’autorisation d’expérimenter sur les animaux<br />
vivants<br />
N°<br />
d’autorisation<br />
Date <strong>de</strong> début <strong>de</strong><br />
validité<br />
131<br />
Date <strong>de</strong> fin <strong>de</strong> validité Chirurgie Renouvellemen<br />
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AUTOUR-BERNARD Anne 13-312 16 janvier 2007 15 janvier 2012 non<br />
BECQUET Denis 13-002 22 juillet 2009 21 juillet 2014 oui<br />
BELLAN-FRANCOIS Anne-Marie 13-197 22 juillet 2009 21 juillet 2014 non<br />
BOSLER Olivier 13-53 07 avril 2000 06 avril 2010 oui En cours<br />
BOUGIS Pierre 13-148 14 février 2008 13 février 2013 non<br />
CARLIER Edmond 13-153 06 mai 2008 05 mai 2013 non<br />
CASTETS Francis 13-224 03 février 2010 02 février 2015 non<br />
CEARD Brigitte 13-235 16 février 2005 15 février 2010 non En cours<br />
CHOULAMOUNTRY Kéodavanh 13-373 29 avril 2008 28 avril 2013 non<br />
CLERC Nadine 13-263 28 mars 2006 27 mars 2011 non En cours<br />
CREST Marcel 13-244 10 mai 2005 09 mai 2010 non<br />
DARGENT Bénédicte 13-119 14 février 2013 13 février 2013 non<br />
DEBANNE Dominique 13-145 20 octobre 2008 19 octobre 2013 non<br />
DELPIERRE Stéphane 13-46 03 février 2010 02 février 2015 non<br />
DE REGGI Lucien 13-306 27 décembre 2006 26 décembre 2011 oui<br />
DESPLAT-JEGO Sophie 13-294 14 novembre 2006 13 novembre 2011 non<br />
DEVAUX Jérôme 13-297 14 novembre 2006 13 novembre 2011 non En cours<br />
DJELLOUL Mehdi 13-486 31 octobre 2010 30 octobre 2015 non<br />
DUBRUC Franck 1 ère <strong>de</strong>man<strong>de</strong> En cours<br />
DURAND-GORDE Joséee-Martine 13-194 31 mars 2010 30 mars 2015 non<br />
EL FAR Oussama 13-177 13 février 2009 12 février 2014 non<br />
ENJALBERT Alain 13-51 24 mars 2010 23 mars 2015 non<br />
Faivre-Sarrailh Catherine 13-79 15 mars 2010 14 mars 2015 non<br />
FERON François 13-249 31 octobre 2010 31 octobre 2015 oui<br />
FACHE Marie-Pierre 13-98 13 février 2008 12 février 2013 non<br />
GACKIERE Florian 13-460 29 mars 2010 28 mars 2015 non<br />
GAILLARD Olivier 1 ère <strong>de</strong>man<strong>de</strong> En cours<br />
GERARD Corinne 13-103 13 juin 2006 12 juin 2011 non En cours<br />
GOAILLARD Jean-Marc 13-375 06 mai 2008 05 mai 2013 non<br />
HERMAN Jean-Paul 13-50 28 janvier 2010 29 janvier 2015 oui<br />
IBORRA Cécile 13-284 08 août 2006 09 août 2011 non En cours<br />
IBRAHIM El Cherif 13-252 14 mars 2006 10 octobre 2010 oui En cours<br />
JAMMES Yves 13-44 28 janvier 2010 27 janvier 2015 oui<br />
KESSLER Jean-Pierre 13-168 23 décembre 2009 22 décembre 2014 oui<br />
KHRESTCHATISKY Michel 13-316 30 janvier 2007 29 janvier 2012 non<br />
LEVEQUE Christian 13-184 25 février 2009 24 février 2014 non<br />
LONIGRO Aurélie 13-392 10 novembre 2008 09 novembre 2013 non<br />
LOTFI Ferhat 1 ère <strong>de</strong>man<strong>de</strong> En cours<br />
MAINGRET François 1 ère <strong>de</strong>man<strong>de</strong> En cours<br />
MARCHALANT Yannick 13-501 24 janvier 2011 23 janvier 2016 non<br />
MARCHOT Pascale 13-149 14 février 2008 13 février 2013 non<br />
MARTIN-EAUCLAIRE Marie-France 13-150 14 février 2008 13 février 2013 non<br />
MARTIN-MOUTOT Nicole 13-136 13 novembre 2007 12 novembre 2012 non<br />
MAZET Bruno 13-262 05 septembre 2011 16 septembre 2016 non<br />
MEKAOUCHE Mourad 13-122 17 avril 2007 16 avril 2012 oui<br />
MOLINO Yves 13-411 09 mars 2009 08 mars 2014 non
OSORIO Nancy 13-254 26 janvier 2011 25 janvier 2016 non<br />
PALET Delphine 13-403 06 janvier 2009 05 janvier 2014 non<br />
PAPANDREOU Marie-Jeanne 13-233 16 février 2005 15 février 2010 non En cours<br />
PENALBA Virginie 1 ère <strong>de</strong>man<strong>de</strong> En cours<br />
RAMA Sylvain 1 ère <strong>de</strong>man<strong>de</strong> En cours<br />
RASOLNJANAHARY Ramahefarizo 13-95 08 août 2006 07 août 2011 oui En cours<br />
RIVERA Santiago 13-308 09 janvier 2007 08 janvier 2012 non<br />
RODAT-DESPOIX Lise 13-365 11 mars 2008 10 mai 2013 non<br />
ROSTAIN Jean-Clau<strong>de</strong> 13-106 06 juin 2011 05 juin 2016 oui<br />
RUF Jean 13-195 31 mars 2010 30 mars 2015 non<br />
SEAGAR Michael 13-415 11 mai 2009 10 mai 2014 non<br />
STEINBERG Jean-Guillaume 13-45 23 mars 2010 22 mars 2015 non<br />
STRUBE Caroline 13-211 04 novembre 2009 03 novembre 2014 non<br />
TELL Fabien 13-261 21 février 2006 20 février 2011 non En cours<br />
THIRION Sylvie 13-180 17 mars 2004 16 mars 2009 non En cours<br />
VALLEE Nicolas 13-309 09 janvier 2007 08 janvier 2012 oui<br />
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Personnels ayant suivi une formation approuvée <strong>de</strong><br />
NIVEAU II<br />
13 personnes<br />
Personnels affectés à 100% à l’animalerie<br />
FERNANDEZ Axel<br />
FINA Jean-Luc<br />
GOMEZ-FUENTES Christian<br />
MAZENQ Céline<br />
Personnels exerçant dans les laboratoires<br />
CAILLOL Ghislaine<br />
FERRACCI Géraldine<br />
CHARRAT Eliane<br />
JULLIEN Nicolas<br />
MORENO Mathias<br />
RAVAILH Sylvie<br />
RUEDA Fanny<br />
SANGIARDI Marion<br />
YOUSSOUF Fahamoe<br />
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PROCEDURES DE FONCTIONNEMENT DE<br />
L’ANIMALERIE<br />
1 – Prise en charge <strong>de</strong>s animaux à leur arrivée<br />
Les animaux proviennent essentiellement <strong>de</strong>s trois fournisseurs principaux dont les<br />
coordonnées sont mentionnées dans un chapitre suivant : Elevage JANVIER, CHARLES<br />
RIVER LABORATORIES et HARLAN. Les comman<strong>de</strong>s d’animaux sont faites<br />
directement par les laboratoires utilisateurs, une copie <strong>de</strong> la comman<strong>de</strong> est envoyée à l’équipe<br />
<strong>de</strong> l’animalerie 7 jours avant la date <strong>de</strong> réception <strong>de</strong>s animaux. Les animaux (souris, rats et<br />
cobayes) sont accompagnés d’une copie du contrôle sanitaire négatif. Ils sont livrés par les<br />
transporteurs respectifs <strong>de</strong> ces fournisseurs. Les transports sont effectués par <strong>de</strong>s personnels<br />
sensibilisés et formés au transport <strong>de</strong>s animaux. Les livraisons se font le mercredi et le jeudi<br />
en fonction <strong>de</strong>s fournisseurs et toujours entre 9h00 et 11h00. A leur arrivée, les animaux sont<br />
immédiatement transférés dans <strong>de</strong>s cages et adéquates et nourris et abreuvés. Ils sont ensuite<br />
inspectés et notés sur le registre. Les animaux sont transférés dans la pièce d’hébergement <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>stination.<br />
Il arrive que dans le cadre <strong>de</strong> collaborations nationale ou internationale entre équipes <strong>de</strong><br />
recherche que l’animalerie reçoive <strong>de</strong>s animaux provenant d’autres animaleries. Dans ce cas,<br />
un contrôle sanitaire négatif <strong>de</strong> moins <strong>de</strong> 3 mois est exigé. Le transport est assuré par un<br />
transporteur agrée. A leur arrivée, les animaux sont inspectés, transférés dans <strong>de</strong>s cages<br />
adéquates nourris et abreuvés puis transférés dans la pièce <strong>de</strong> quarantaine au 4 ème étage du<br />
bâtiment B. Ils sont observés régulièrement pendant une pério<strong>de</strong> <strong>de</strong> 7 jours avant leur transfert<br />
dans la pièce d’hébergement <strong>de</strong> <strong>de</strong>stination.<br />
2 – Alimentation est eau <strong>de</strong> boisson<br />
L’eau est la nourriture sont fournies ad libitum. L’eau est stérilisée par autoclavage pour les<br />
animaux <strong>de</strong> la zone A1+ (zone protégée).<br />
Les aliments distribués sont : A03, aliment standardisé rat souris élevage et 114 aliment<br />
standardisé cobaye élevage fournis par SAFE (route <strong>de</strong> Saint Bris Les Tremblats 89290<br />
AUGY)<br />
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Litière : Nous utilisons <strong>de</strong>ux produits <strong>de</strong> chez SAFE en guise <strong>de</strong> litière : la Litière Plus<br />
Epicéa pour les rats et souris et les copeaux pour les cobayes. Pour améliorer le<br />
microenvironnement du cobaye, nous associons aux copeaux <strong>de</strong> bois du foin irradié.<br />
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3 – Plan <strong>de</strong> nettoyage et désinfection <strong>de</strong>s installations<br />
a – La zone protégée A1+<br />
La circulation dans cette zone est à sens unique du propre vers le sale. L’accès est restreint et<br />
les personnes qui y accè<strong>de</strong>nt sont habillées en blouse, sur-chaussures et gants. L’aliment et<br />
l’eau distribués dans cette zone sont stérilisés par autoclavage. Le change <strong>de</strong> cage se fait une<br />
fois par semaine en général le lundi.<br />
Les cages, grilles, biberons et tétines sales sont lavés au lave-cage et lave-biberon puis<br />
autoclavés. L’autoclave est à double entrée ce qui permet <strong>de</strong> stocker le matériel stérile dans<br />
une zone propre <strong>de</strong> la zone A1+.<br />
Les pièces <strong>de</strong> cette zone sont nettoyées une fois par semaine (aspiration <strong>de</strong> la poussière et<br />
nettoyage au détergent : Surfanios ou Ecodion). La désinfection a lieu une fois par an en<br />
utilisant du HM4 en pulvérisation ou HM4 en One Shot.<br />
b – La zone conventionnelle<br />
L’aliment et l’eau distribués ne sont pas stériles. Le change <strong>de</strong> cage se fait une fois par<br />
semaine pour les souris et <strong>de</strong>ux fois par semaine pour les rats. Les personnes qui accè<strong>de</strong>nt à<br />
l’animalerie sont tenues <strong>de</strong> porter une blouse et <strong>de</strong>s gants.<br />
Les cages, grilles, biberons et tétines sont lavés au lave-cage et lave-biberon puis stockés dans<br />
une zone propre <strong>de</strong> la laverie.<br />
Les cages <strong>de</strong>s cobayes sont changées une fois par semaine. Les cages sont lavées dans la<br />
laverie du 4 ème étage.<br />
Les pièces <strong>de</strong> cette zone sont nettoyées une fois par semaine (l’aspiration <strong>de</strong> la poussière et<br />
nettoyage au détergent : Surfanios ou Ecodion). La désinfection une fois par an en utilisant du<br />
HM4 en pulvérisation ou HM4 en One Shot.<br />
c - La zone A2<br />
Cette zone et ventilée et climatisée par une CTA (climatisation et traitement d'air) et <strong>de</strong>s<br />
filtres HEPA sont disposés en sortie. L’accès à cette zone est très restreint. Les personnes qui<br />
y accè<strong>de</strong>nt sont habillées en blouse, sur-chaussures, gants et masque. Les animaux stabulés<br />
dans cette zone proviennent <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux zones <strong>de</strong> l’animalerie A1+ ou conventionnelle ou<br />
directement du fournisseur. Une fois ces animaux inoculés, ils ne sont manipulés que sous<br />
hotte. L’aliment et l’eau distribués ne sont pas stériles. Les litières usagées, les cages, les<br />
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grilles, les biberons et les tétines ainsi que les cadavres d’animaux <strong>de</strong> cette zone sont<br />
autoclavés avant leur nettoyage pour le matériel ou leur élimination pour les cadavres et les<br />
litières.<br />
Le nettoyage <strong>de</strong> cette zone se fait une fois par semaine comme le reste <strong>de</strong> l’animalerie par<br />
contre la désinfection se fait à la fin <strong>de</strong> chaque protocole expérimental.<br />
d – Pièces d’expérimentations<br />
Les pièces <strong>de</strong> chirurgie, la pièce <strong>de</strong> réveil, la partie chronobiologie, les box comportementaux<br />
sont nettoyés en fonction <strong>de</strong> leur utilisation. Il arrive que les salles <strong>de</strong> chirurgie soient<br />
nettoyées une fois par jour.<br />
4 – Contrôle <strong>de</strong>s conditions d’hébergement<br />
a - L’éclairage<br />
Toutes les pièces d’hébergement sont soumises à un éclairage artificiel avec une alternance<br />
jour/nuit <strong>de</strong> 12h <strong>de</strong> lumière et <strong>de</strong> 12h d’obscurité. L’intensité lumineuse est d’environ 150 lux<br />
b - Climatisation et ventilation<br />
La ventilation et la climatisation sont assurées par trois CTA (climatisation et traitement<br />
d'air). Le renouvellement d’air est effectué par ces CTA à raison <strong>de</strong> 15 volumes/heure. La<br />
température dans les différentes pièces <strong>de</strong> l’animalerie est constamment <strong>de</strong> 22+/-1°C. Nous<br />
avons installé dans chaque pièce d’hébergement un thermomètre hygromètre enregistreur. En<br />
plus <strong>de</strong> l’affichage <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux valeurs <strong>de</strong> température et d’hygrométrie, <strong>de</strong>s valeurs sont<br />
relevées et enregistrées toutes les 15 minutes. Une fois par mois nous procédons au transfert<br />
<strong>de</strong>s ces enregistrements sur l’ordinateur.<br />
La pièce d’hébergement rat ou souris B407 du 4 ème étage aile sud n’est pas gérée par les CTA<br />
mais elle bénéficie <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux climatiseurs réversibles (chaud et froid) d’une capacité <strong>de</strong> 5 kg<br />
chacun et d’un extracteur d’air. Tout récemment, nous avons mis en place une télésurveillance<br />
<strong>de</strong> la température qui consiste à installer dans une pièce <strong>de</strong> référence pour chacune <strong>de</strong>s trois<br />
CTA, ainsi que dans la pièce d’hébergement rat ou souris du 4 ème étage, une son<strong>de</strong> thermique.<br />
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Ces son<strong>de</strong>s relèvent les valeurs <strong>de</strong> température toutes les 10 minutes. Ces valeurs sont<br />
consultables à tous moments sur un site internet. L’automate <strong>de</strong> télésurveillance permet <strong>de</strong><br />
réagir à chaque écart <strong>de</strong> température par l’envoi <strong>de</strong> courrier électronique à l’entreprise chargée<br />
<strong>de</strong> la maintenance <strong>de</strong>s CTA et aux responsables <strong>de</strong> l’animalerie.<br />
L’entretien et la maintenance <strong>de</strong>s CTA sont assurés par l’entreprise SPIE pour l’Université <strong>de</strong><br />
la Méditerranée<br />
5 – Procédures d’utilisation <strong>de</strong>s salles <strong>de</strong> chirurgie<br />
Les <strong>de</strong>ux salles <strong>de</strong> chirurgie ainsi que l’appareil d’anesthésie gazeuse sont mis à la disposition<br />
<strong>de</strong>s utilisateurs <strong>de</strong> l’animalerie. Un système <strong>de</strong> réservation est mis en place sur un site internet<br />
interne aux différents laboratoires du site. Les <strong>de</strong>ux salles <strong>de</strong> chirurgie ainsi que les<br />
interventions chirurgicales effectuées sont sous la responsabilité du vétérinaire responsable <strong>de</strong><br />
l’animalerie qui veille à ce que les protocoles d’anesthésie, la gestion <strong>de</strong> la douleur et le réveil<br />
<strong>de</strong> l’animal se déroulent dans les meilleures conditions.<br />
6 – Les registres<br />
Nous utilisons 4 types <strong>de</strong> registres<br />
a – Registre <strong>de</strong> visite<br />
Nous avons disposé à l’entrée <strong>de</strong> l’animalerie un registre dans lequel sont notés nom, prénom,<br />
le laboratoire d’appartenance <strong>de</strong>s personnes qui accè<strong>de</strong>nt à l’animalerie avec l’heure d’arrivée<br />
et l’heure <strong>de</strong> départ. L’accès à l’animalerie est protégé par un digico<strong>de</strong> connu seulement <strong>de</strong>s<br />
utilisateurs <strong>de</strong> l’animalerie.<br />
b – Registre d’entrées et sorties <strong>de</strong>s animaux<br />
Nous avons disposé à l’entrée <strong>de</strong> l’animalerie un registre côté dans lequel les utilisateurs <strong>de</strong><br />
l’animalerie notent <strong>de</strong> façon manuscrite leur nom, le laboratoire d’appartenance, l’équipe, la<br />
date, le N° <strong>de</strong> lot d’i<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong> l’animal qui sort, l’espèce, la souche, le sexe, le nombre<br />
d’animaux et la nature <strong>de</strong> la sortie. Dans ce registre sont notées aussi les entrées soit à l’issue<br />
d’un sevrage quand les animaux sont nés dans l’établissement ou lors d’achat d’animaux ou<br />
<strong>de</strong> transfert d’un autre établissement d’expérimentation.<br />
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Les données du registre sont reportées une fois par semaine sur une base <strong>de</strong> données<br />
informatique conçue sur la base <strong>de</strong> FileMakerPro par Nicolas JULLIEN Ingénieur biologiste<br />
au <strong>CRN2M</strong>.<br />
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Une fois les entrées et sorties <strong>de</strong> la semaine sont enregistrées un rapport est imprimé et<br />
archivé. Cette base est sécurisée et infalsifiables à partir du moment où le rapport est imprimé.<br />
Depuis peu et grâce à son concepteur, nous avons rentré dans la base <strong>de</strong> données les noms et<br />
les N° d’autorisation ainsi que la date <strong>de</strong> fin <strong>de</strong> validité d’autorisation <strong>de</strong>s personnes<br />
autorisées à expérimenter. Ainsi, l’expérimentateur est informé par courrier électronique avec<br />
copie au responsable <strong>de</strong> l’animalerie 6 mois avant la date <strong>de</strong> fin <strong>de</strong> validité.<br />
c – Registre <strong>de</strong> soins<br />
Le responsable tient à jour un registre dans le quel sont consignés les résultats <strong>de</strong>s différents<br />
contrôles sanitaires. Dans notre établissement, nous procédons à <strong>de</strong>ux contrôles par an. Ils<br />
sont faits par le CDTA (Cryopréservation, Distribution, Typage et Archivage animal) CNRS à<br />
ORLEANS.<br />
d – Registre du médicament<br />
Conformément à l’arrêté <strong>de</strong> mai 2003, nous avons mis en place un registre du médicament<br />
côté. Le directeur <strong>de</strong> l’établissement a officiellement (lettre à la DDPP et à l’AFSSA) nommé<br />
Mourad MEKAOUCHE comme responsable du médicament.<br />
Le fournisseur <strong>de</strong>s médicaments est une centrale d’achat <strong>de</strong> médicament vétérinaire :<br />
CENTRAT Lapalisse. Les médicaments sont notés à l’arrivée sur le registre. Ils sont disposés<br />
dans une boîte fermée à clé et disposé dans le réfrigérateur du laboratoire <strong>de</strong> transgénèse dans<br />
la zone A1+.<br />
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7 - Provenance <strong>de</strong>s animaux<br />
a - Fournisseur agrée<br />
CHARLES RIVER LABORATORIES France<br />
Domaine <strong>de</strong>s Oncins<br />
BP 0109<br />
69592 L’Arbresle ce<strong>de</strong>x<br />
Tel : 04 74 01 68 03<br />
Fax : 04 74 01 69 94<br />
HARLAN<br />
ZI Le Marcoulet<br />
RN9 – BP 98<br />
03800 GANNAT<br />
Fax : 04 70 90 68 08<br />
Tel : 04 70 90 02 20<br />
ELEVAGE JANVIER<br />
Route <strong>de</strong>s chênes secs – BP5<br />
53940 Le Genest-St-Isle<br />
Tel : 02 43 02 11 91<br />
Fax : 02 43 02 00 15<br />
THE JACKSON LABORATORY,<br />
600 main street<br />
Bar Harbor, ME 04609<br />
b- Production locale : reproduction<br />
RAT :<br />
Wistar<br />
Sprague Dawley<br />
SOURIS : Différentes lignées transgéniques et non transgéniques<br />
8 – Mesure <strong>de</strong> l’activité<br />
A la date du 16 novembre 2011, nous hébergeons dans l’établissement 28 cobayes, 267 rats<br />
et 2112 souris.<br />
En prévision <strong>de</strong>s <strong>de</strong>man<strong>de</strong>s d’hébergement d’animaux émanant <strong>de</strong>s équipes <strong>de</strong> recherche et <strong>de</strong><br />
plus en plus croissantes, nous souhaiterions ajouter à notre agrément la pièce B407 située au<br />
4 ème étage aile sud.<br />
Le tableau ci-<strong>de</strong>ssous comporte le nombre d’animaux (souris, rats et cobayes) produits et<br />
utilisés dans notre établissement pour <strong>de</strong>ux pério<strong>de</strong>s : du 01 janvier 2010 au 31 décembre<br />
2010 et du 01 janvier 2011 au 17 novembre 2011.<br />
Ce tableau ne comporte pas le nombre d’animaux achetés.<br />
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animaux<br />
produits<br />
De 01/01/10 au 31/12/10 3682<br />
De 01/11/11 au 17/11/11 4941<br />
Souris Rats Cobayes<br />
Animaux animaux Animaux animaux Animaux<br />
utilisés produits utilisés produits utilisés<br />
5026 1529 2736 20 26<br />
4929 1170 1873 42 17<br />
9 - Elimination <strong>de</strong>s cadavres<br />
Jusqu’à aujourd’hui, l’élimination <strong>de</strong>s cadavres d’animaux est assurée par<br />
ACINE-VET<br />
Quartier Mazargues<br />
13120 Gardanne<br />
Tel : 04 42 51 20 30<br />
Fax : 04 42 65 85 24<br />
A partir du 1 er janvier 2012, l’élimination <strong>de</strong>s cadavres sera assurée par :<br />
SARVAL Sud-Est<br />
Site <strong>de</strong> Bayet Les BOUILLOTS<br />
F – 03500 Bayet<br />
Tél : + 33 (0) 4 70 45 32 93<br />
Fax : + 33 (0) 4 70 45 58 07<br />
Les litières sont éliminées sous forme <strong>de</strong> déchets biologique par l’entreprise TEP<br />
10 - Vétérinaire référent<br />
Mourad MEKAOUCHE, docteur en Mé<strong>de</strong>cine Vétérinaire, docteur d’Université<br />
spécialité Physiologie, ingénieur <strong>de</strong> recherche CNRS et responsable <strong>de</strong><br />
l’animalerie.<br />
11 – Transport d’animaux<br />
Il nous arrive <strong>de</strong> faire appel à un transporteur agrée pour envoyer <strong>de</strong>s animaux au CDTA à<br />
Orléans pour le contrôle sanitaire : 2 fois par an. Dans ce cas, nous nous adressons à ATS.<br />
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ANIMAUX TRANSPORTS SERVICES (ATS)<br />
350 Boulevard Michelet<br />
Le Chambon<br />
13009 <strong>Marseille</strong><br />
12 – Mise en place d’un site internet <strong>de</strong> l’établissement<br />
Un site internet à accès restreint est mis à la disposition <strong>de</strong>s utilisateurs <strong>de</strong> l’animalerie. Ces<br />
<strong>de</strong>rniers peuvent réserver les salles <strong>de</strong> chirurgie et l’appareil d’anesthésie gazeuse. Des<br />
informations sont mises en ligne telle que le lien pour s’inscrire aux différentes formations<br />
réglementaires à l’expérimentation animale, les démarches <strong>de</strong> <strong>de</strong>man<strong>de</strong> ou <strong>de</strong> renouvellement<br />
d’autorisation d’expérimenter, le document <strong>de</strong> saisine pour le comité d’éthique régional…<br />
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