UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDAL FACULTÉ DES ... - Toubkal

UNIVERSITÉ MOHAMMED V – AGDALFACULTÉ DES SCIENCESRabatN° d’ordre 2322THÈSE DE DOCTORAT D’ETATPrésentée parIDRISSI LailaDiscipline : ChimieSpécialité : Chimie AnalytiqueETUDE ET DEVELOPPEMENT DE NOUVELLES METHODESELECTROCHIMIQUES POUR LA DETERMINATION DES IONSORTHOPHOSPHATE, NITRITE, NITRATE ET AMMONIUMSoutenue le 27 Décembre 2006Devant le juryPrésident :A. Amine Professeur - Faculté des Sciences et Techniques deMohammediaExaminateurs :F. Cherkaoui El Moursli Professeur - Faculté des Sciences - RabatA. Elyahyaoui Professeur - Faculté des Sciences - RabatA. Bouklouze Professeur - Faculté de Médecine et de Pharmaciede RabatK. Digua Professeur - Faculté des Sciences et Techniques deMohammediaFaculté des Sciences, 4 Avenue Ibn Battouta B.P. 1014 RP, Rabat – MarocTel +212 (0) 37 77 18 34/35/38, Fax : +212 (0) 37 77 42 61, http://www.fsr.ac.ma

Université Mohammed V-AgdalFaculté des SciencesRabatTHÈSE DE DOCTORAT D’ETATPrésentée parIDRISSI LailaDiscipline : ChimieSpécialité : Chimie AnalytiqueETUDE ET DEVELOPPEMENT DE NOUVELLES METHODESELECTROCHIMIQUES POUR LA DETERMINATION DES IONSORTHOPHOSPHATE, NITRITE, NITRATE ET AMMONIUMSoutenue le 27 Décembre 2006Devant le juryPrésident :A. Amine Professeur - Faculté des Sciences et Techniques deMohammediaExaminateurs :F. Cherkaoui El Moursli Professeur - Faculté des Sciences - RabatA. Elyahyaoui Professeur - Faculté des Sciences - RabatA. Bouklouze Professeur - Faculté de Médecine et de Pharmaciede RabatK. Digua Professeur - Faculté des Sciences et TechniquesMohammedia

Avant proposCe travail a été effectué sous la direction du Professeur Fouzia CHERKAOUI ELMOURSLI du Laboratoire d’Electrochimie et de Chimie Analytique de la Faculté des Sciences deRabat.Il est également le résultat d’une collaboration avec le Laboratoire d’Analyses Chimiques etBiocapteurs de la Faculté des Sciences et Techniques de Mohammedia.Ma première pensée va tout naturellement à mon encadrante, le Professeur FouziaCHERKAOUI EL MOURSLI dont j’ai apprécié sa grande chaleur humaine et sa disponibilité. Je laremercie pour la confiance qu’elle m’a témoignée et pour m’avoir permis de mener ce projet à sonterme.J’exprime ma vive reconnaissance au Professeur Aziz AMINE, co-directeur de thèse, pourm’avoir apporté un appui constant au cours du développement de ce travail et de me faire l’honneurde présider mon jury. Son soutien sans limite et ses qualités humaines resteront gravés dans mamémoire.Mes sincères remerciements vont également aux membres du jury de thèse : le ProfesseurAhmed ELYAHYAOUI de la Faculté de Sciences de Rabat pour avoir mobilisé son temps et sescompétences pour examiner ce travail, le Professeur Abdelaziz BOUKLOUZE de la Faculté deMédecine et de Pharmacie de Rabat d’avoir accepté de juger et d’examiner mon manuscrit de thèseet le professeur Khalid DIGUA de la Faculté des Sciences et Techniques de Mohammedia qui m’ahonoré en acceptant d’être rapporteur.Je ne peux manquer de remercier toute l’équipe du Laboratoire d’Analyses Chimiques etBiocapteurs au sein de laquelle j’ai effectué mes travaux.Je suis extrêmement reconnaissante à ma famille et mes amis qui m’ont soutenue etencouragé en tout moment.Je remercie aussi mes enfants Moussa, Taha et Dina, de ne pas leur avoir consacré tout letemps nécessaire.

SOMMAIREINTRODUCTION GENERALE…………………………...……………..…………………..1CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE……………………….………………4A. Généralités sur les éléments à analyser : nitrite, nitrate, ammonium et orthophosphate......5Introduction……………………………………………………………………………….……5I. Phénomène de l’eutrophisation…………………………………………………………..5II. L’azote inorganique en milieu aquatique……………………………………………….7II.1. Cycle de l’azote…………………………………………………………………...7II.2. Origine des pollutions azotées…………………………………………………….8II.3. Conséquences des pollutions azotées……………………………………………..9II.3.1. Pollution par les nitrites et nitrates……………………………………...9a. Voies d’exposition…………………………………………..……..9b. Toxicité des nitrates………………………………………………..9c. Toxicité des nitrites……………………………………………….10II.3.2. Pollution par l’ammonium………………………………………….…11III. Le phosphore…………………………………………………………………………12III.1. Le phosphore en milieu aquatique……………………………………………...12III.2. Le phosphore dans les biofilms de cyanobactéries……………………….…….13B. Généralités sur les techniques utilisées pour la détermination des ions :Nitrate, nitrite, orthophosphate et ammonium ……………………..…………………….15I. Méthodes d’analyse des nitrates et nitrites…………………………………..…………15I.1. Méthodes spectroscopiques……………………………………………..………..17I .2. Méthodes électrochimiques……………………………………………..……….19I.3. La chromatographie ionique…………………………………………..…….……21II. Méthodes d’analyse des ions ammoniums…………………….………………………22II.1. Méthodes spectrophotométriques……………………………………..…………22II.2. Méthodes enzymatiques…………………………………………………………23II.3. Méthodes électrochimiques……………………………………………………...24II.3.1. Potentiométrie…………………………………………………………24

II.3.2. Techniques voltamétriques…………………………………………….25III. Méthodes d’analyse des phosphates………………...…………………………..……27III.1. Méthodes spectrophotométriques………………………………………….……27III.2. Méthodes électrochimiques……………………………………………………..28Références…………………………………………………………………………………….29CHAPITRE II : TECHNIQUES TE CONDITIONS EXPERIMENTALES……………34Introduction………………………………………………………………………………..….35I. Techniques électrochimiques………………………..……………………………………..35I.1. Voltamétrie à tension linéaire et cyclique………………………………………..35I.2. Voltamétrie impulsionnelle différentielle………………………………………..36I.3. Ampérométrie…………………………………………………………………....38II. Système d’analyse par injection directe en milieu batch « Batch InjectionAnalysis » (BIA)………………………………………………………………………….40II.1. Configuration géométrique de la cellule BIA……………………………………40II.2. Modèle théorique de la réponse du détecteur BIA………………………………44II.3. Système BIA et applications………………………………………………….….45III. Dispositifs et conditions expérimentales………………………………………………….48III.1. Cellules électrochimiques………………………………………………………48III.2. Electrodes de référence…………………………………………………………48III.3. Electrodes de travail……………………………………….……………………49III.4. Cellule à microélectrode…………………………………….……………..……50III.5. Appareils…………………………………………………………………….….52Références ………………...………………………………………………………….………54CHAPITRE III : DEVELOPPEMENT D’UNE NOUVELLE METHODE DEDETECTION DES ORTHOPHOSPHATES. …… ………………….………………..….56Introduction………………………………………………………………………………..….57I. Matériels et procédures…………………………………………………………………..…58I.1. Réactifs et échantillons……………………………………………..….....58I.2. Procédures……………………………………………………………...…58I.2.1. Electrode à pâte de carbone……………………………………..58I.2.2. Mesures en milieu batch……………………………………...…59

I.2.3. Analyse en BIA…………………………………………………59I.2.4. Analyse de l’eau de mer………………………………………...59I.2.5. Analyse des échantillons de biofilms de cyanobactéries………..59I.2.6. Méthode des ajouts dosés………………………….. …………..60I.2.7. Calcul du taux de recouvrement…………………………….…..60II. Résultats et discussion..……………………………………………………………………61II.1. Analyse en milieu batch…………………………………….……………61II.1.1. Choix de l’électrode de travail et du potentiel imposé……...….61II.1.2. Effet du pH……………………………………………………..63II.1.3. Etude des substances interférentes………………………..……63II.1.4. Courbe de calibration………………………………………..…66II.1.5. Effet du solvant organique……………………………………..67II.1.6. Effet du sel……………………………………………………..68II.2. Système d’analyse par injection directe en milieu batch (BIA)…………69II.2.1. Détermination des performances analytiques…………….……69II.2.2. Application : Analyse de l’ion PO 3- 4 dans l’eau de mer…….....71II. 3. Analyse des phosphates en milieu batch à l’aide de lamicroélectrode à pâte de carbone………………....………………….…73II.3.1. Performances analytiques……………….…………………..…73II.3.2. Application : Analyse des phosphates dans des biofilmsde cyanobactéries…………..……………………….…………..74III. Conclusion……………...………………………………………………………...………76Références ………………...………………………………………………………………….77CHAPITRE IV : DETECTION ELECTROCHIMIQUE DE L’ION NITRITEBASEE SUR SA REACTION AVEC LE 2,3- DIAMINONAPHTHALENE ………… 78Introduction………………………………………………………………………………...…79I. Techniques et méthodes expérimentales …………………………………………………...80I.1. Réactifs et échantillons…………………………………………………...80I.2. Procédure…………………………………………………………………81I.2.1. Mesures électrochimiques pour quantification…………………81I.2.2. Analyse des standards de nitrite………………………………...81I.2.3. Analyse des échantillons réels…………………………………..82II. Résultats et discussion……………………………………………………………………..82

II.1. Comportement électrochimique du DAN………………………………..82II.2. Optimisation des paramètres de la réaction chimique…………………...85II.3. Analyse des nitrites à l’aide de la DPV………………………………….86II.4. Mesure des nitrites à l’aide de la méthode BIA- ampérométrie…………87II.5. Etude des substances interférentes……………………………………….89III. Application : Analyse des échantillons réels…...………………………………………...91IV. Conclusion………...……………………………………………………………………...92Références ………………...………………………………………………………………….93CHAPITRE V : DETERMINATION ELECTROCHIMIQUE DES NITRATESDANS DES ECHANTILLONS D’EAU ET DE PRODUITS CARNES…………………94Introduction…………………………………………………………………………...………95I. Expérimentation…………………………………………………………………………….96I.1.Réactifs et échantillons……………………………………………………………96I.2. Réduction des nitrates en milieu batch…………………………………………...97 I.3.Préparation de la colonne de cadmium…………………………………...………97II. Résultats et discussion……………………………………………………………………..98II.1. Analyse spectrophotométrique…………………………………………………..99II.1.1. Détermination du temps d’incubation nécessaire pour laréduction des nitrates en milieu batch…………………………………99II.1.2. Influence du pH et de la concentration de la solutiontampon sur le rendement de la réduction. ……………………………101II.1.3. Influence du débit sur le rendement de la réduction………………..102II.1.4. Influence de la concentration initiale du nitrite sur lerendement de la réduction……………………………………………103II.1.5. Courbe de calibration………………………………………………..104II.1.6. Analyse des nitrites et des nitrates dans des échantillons réels……...105II.2. Détermination des nitrites et nitrates par voie électrochimique………………..107II.2.1. Principe de la méthode……………………………………….……….107II.2.2. Procédure expérimentale……………………………………………...108II.3. Comparaison entre les résultats obtenus par spectrophotométrieet les résultats obtenus par voie électrochimique………………………109III. Conclusion……………...……………………………………………………………….111

Références bibliographiques………………………………………………………………...112CHAPITRE VI : NOUVELLE METHODE DE DETERMINATION DE L’ION AMMONIUMDANS L’EAU DE DISTRIBUTION…………………………………….114Introduction………………………………………………………………………………….115I. Réactifs et échantillons……………………………………………………………………116II. Résultats et discussion……………………………………………………………………116II. 1. Etude sur électrode à pâte de carbone modifiée……………………………….116II.2. Comportement du système électrochimique étudié……………………………117II.3. Optimisation des paramètres qui interviennent dans ladétermination de l’ion ammonium…………………………………………...…122II.3.1. Choix de la solution tampon………………………………………….122II.3.2. Etude de l’influence du pH. …………..……………………………...123II.3.3. Effet de la force ionique……………………….……………………...125II.3.4. Influence de la concentration du cuivre………………………………125II.3.5. Choix du potentiel appliqué…………………………………………..126II.3.6. Caractéristiques analytiques de la méthode proposée…….…………..127III. Application : analyse des échantillons réels…………………………………….……….128IV. Conclusion………………………………………………………………………………129Références ……………….………………………………………………………………….130CONCLUSION GENERALE……………………………………..………………………..131

Liste des abréviationsAg/ AgCl : électrode d’argent / chlorure d’argentAOAC : en anglais "Association of Official Analytical Chemists"BIA : "Batch Injection Analysis" c’est l’injection directe en milieu BatchCd-Cu: grains de cadmium sur lesquelles le cuivre a été déposé chimiquementCPG : chromatographie en phase gazeuseCSV : voltamétrie par redissolution cathodiqueDAN : 2,3-DiaminonaphthalèneDPV : voltamétrie impulsionnelle différentielleECS : électrode au calomel saturéeEDTA: acide éthylène diamine tétraacétiqueEPC : électrode à pâte de carboneFIA : injection dans un flux continue, en anglais "Flow injection analysis"GDH : glutamate déshydrogénaseHMDE : électrode pendante de mercureHPLC : chromatographie liquide haute performanceIC : chromatographie ioniqueISE : électrode sélective aux ions, en anglais "ion selective electrode"LDH : lactate déshydrogénaseNAD : nicotinamide adénine dinucléotideNADH : forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotideNADP : forme oxydée du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate.N° CEE : code international des additifs alimentairesNTA : 1-H-NaphthotriazoleOMS : organisation mondiale de la santépK A : constante d’aciditéPTFE : téflonPVC : Chlorure de polyvinyleR 2 : coefficient de déterminationRSD : déviation relative standardSD : déviation standard, c’est l’écart type divisé par la moyenne des mesuresS/N : rapport signal/ bruitSWV : voltamétrie à ondes carrées

s : écart typeUV : ultra-violetZTP : zirconium titanium phosphate.

Introduction généraleINTRODUCTION GENERALE- 1 -

Introduction généraleL’orthophosphate (PO 3- 4 ), le nitrite (NO - 2 ), le nitrate (NO - 3 ) et l’ammonium (NH + 4 ) sont lessels nutritifs les plus utilisés en agriculture moderne et en industrie alimentaire. Présentes en excèsdans la nature, ces substances provoquent de sérieux problèmes environnementaux. Le besoin endétecteurs sensibles et sélectifs de ces composés est d’une importance cruciale. Ce besoinqu’entraîne la croissante sévérité des normes dans tous les domaines de chimie et biochimie(environnement, alimentation, pharmacie, sécurité domestique et industrielle…) a incité lesscientifiques à développer des techniques chimiques et électrochimiques d’analyse de cessubstances de plus en plus performantes.L’essor de l’électronique et l’extension de l’usage d’électrodes solides ont contribué audéveloppement de méthodes électrochimiques. L’électrochimie offre en effet des perspectivesattrayantes quant à la compacité, aux conceptions technologiques simples, de faible coût et sipossible de petite taille permettant une faible consommation d’énergie et donc une utilisation sursite.Les électrodes à base de carbone occupent une position importante dans l’électroanalyse tantpar leur faible coût et leur mise en oeuvre aisée que par leurs performances électrochimiques enanalyses organiques et inorganiques [1].Dans le cadre de ce travail seront présentées de nouvelles méthodes électrochimiques permettant ladétermination du phosphate, nitrite, nitrate et ammonium dans les eaux et celle du nitrite et dunitrate dans les eaux et dans les produits carnés.Notre choix s’est porté sur l’électrode à pâte de carbone parce qu’elle présente des avantagespar rapport aux autres électrodes solides classiques tels qu’un renouvellement de surface aisé etexempt d’effet de mémoire et une grande sensibilité vis-à-vis de certaines substances [2].L’approche expérimentale utilisée dans cette étude repose sur l’utilisation de techniquesvoltamétriques et ampérométriques avec une instrumentation d’analyse portable. Pour rendre letemps de l’analyse aussi bref que possible, l’Analyse par Injection Directe en milieu Batch (BatchInjection Analysis, BIA) est adoptée. Cette méthode en plus d’être simple et économique de pointde vue consommation de réactifs et échantillons, permet une grande cadence de mesure, critèreparticulièrement important en analyse de routine.Après un rappel bibliographique permettant d’introduire les différents éléments à analyserainsi que les méthodes d’analyse développées dans ce sens et citées dans la littérature, nousprésenterons au chapitre II les principes et les techniques expérimentales utilisés dans la suite de cetravail.- 2 -

Introduction généraleDans le chapitre III, nous aborderons la détermination des orthophosphates dans l’eau demer en utilisant la technique BIA couplée à l’ampérométrie et celle du même élément dans deséchantillons de biofilms de cyanobactéries à l’aide de la technique ampérométrie sur microélectrodeà pâte de carbone. Les conditions optimales pour cette détection et les caractéristiques analytiquesde la méthode seront ainsi détaillées.Le chapitre IV sera consacré à l’élaboration d’une nouvelle technique électrochimique dedétection de l’ion nitrite en se basant sur sa réaction avec le 2,3-diaminonaphthalène. L’analyse parinjection directe en milieu batch couplée à l’ampérométrie ainsi que la voltamétrie impulsionnelledifférentielle sont utilisées pour doser les nitrites dans des échantillons des eaux naturelles etcontaminées.Nous examinerons aussi dans le chapitre suivant la réponse des nitrates, en utilisant la mêmeprocédure électrochimique de détection des nitrites, après leur réduction chimique sur colonne decadmium / cuivre. Les paramètres de l’étape de la réduction seront optimisés pour aboutir à uneefficacité maximale. La méthode électrochimique utilisée sera légèrement modifiée pour êtrecouplée avec la réduction sur colonne.Une méthode d’analyse rapide de l’ion ammonium sera élaborée dans la dernière partie dece travail. Elle repose sur la réaction de l’ion NH + 4 avec les ions Cu 2+ en milieu basique pour formerle complexe électroactif Cu(NH 3 ) 2+ n . Les techniques expérimentales utilisées au cours de cetteétude sont la voltamétrie impulsionnelle différentielle et la chronoampérométrie.Références bibliographiques[1] C. Urbaniczky et K. Lundstrom, J. Electroanal. Chem., 1984, 167, 169.[2] R. N. Adams, “Electrochemistry at solid electrodes” 1969, M. Dekker, New York, USA.- 3 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueChapitre ISynthèse bibliographique- 4 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueA. Généralités sur les éléments à analyser : Nitrite, nitrate, ammonium etorthophosphateIntroductionL’utilisation intensive des fertilisants artificiels en agriculture (engrais, minéraux,lisiers) ainsi que l’accroissement des rejets urbains ont augmenté notablement les apportsterrigènes d’éléments nutritifs en milieu aquatique. Ces apports ont conduit, entres autres, àun enrichissement en nitrate (issu principalement du lessivage des terres agricoles), enammonium et en phosphate (très abondants dans les rejets urbains), ce qui a causé undéséquilibre du milieu aquatique, appelé eutrophisation.Les éléments qui nous intéressent au cours de cette étude sont : l’azote inorganiquedissous (nitrite, nitrate et ammonium) et l’orthophosphate. Ces éléments peuvent, en plusde leur contribution au phénomène d’eutrophisation, avoir des effets nocifs pour l’Hommeet pour l’environnement. Les effets des composés azotés se résument principalement dansla synthèse des nitrosamines cancérigènes et la formation de la méthémoglobine chez lesnourrissons, en présence de fortes teneurs en nitrates et en nitrites dans les eaux deconsommation.Le passage des composés azotés (ammoniac et aérosols de nitrate, protoxyde d’azote,…)du sol vers l’atmosphère conduit à de sérieux problèmes non seulement pour la santé del’homme mais aussi pour l’environnement (brouillard et pluie acides).I. Phénomène de l’eutrophisationL’eutrophisation se manifeste par une formation importante d’algues, ce quiconduit à une augmentation de la charge naturelle de l’écosystème en matière organique àdégrader. La décomposition des algues par les bactéries consommatrices d’oxygèneengendre une diminution du taux d’oxygène dans l’eau. Parallèlement, la matièreorganique morte non décomposée s’accumule dans les sédiments. Un déséquilibre seproduit alors entre les eaux de surface oxygénées par aération et photosynthèse et les eauxprofondes où le développement des organismes est limité.- 5 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueEn résumé, l’eutrophisation résulte de l’enrichissement d’une eau en sels minérauxentraînant des déséquilibres écologiques tels que la prolifération de la végétation aquatiqueou l’appauvrissement du milieu en oxygène. Les différentes étapes du phénomène (figure1) sont :1. Apport massif de substances nutritives (nitrates, phosphates)2. Augmentation de la production primaire: stimulation de la croissance duphytoplancton. A ce stade on note une augmentation des Diatomées marquée parune croissance de larve sur le fond.3. Enrichissement du cycle biologique: augmentation du zooplancton, des poissons,forte croissance des plantes enracinées4. Mort progressive des algues en suspension, augmentation de turbidité,sédimentation importante des matières organiques vers les couches profondes etconsommation importante de l’oxygène dissous dans l’eau5. Putréfaction de la vase (diffusion de produits toxiques, H 2 S, NH 3 , CH 4 ) due audéveloppement des bactéries anaérobies6. Désoxygénation des couches inférieures et mort des poissons, prolifération duphytoplancton en surface7. La turbidité empêche la photosynthèse de s’effectuer: Ceci augmentel’appauvrissement de l’eau en oxygène et la reproduction des poissons peuexigeants en oxygène.L’eutrophisation entraîne les nuisances suivantes :- Détérioration de la qualité de l’eau avec déstabilisation des chaînes trophiques.- Diminution de la valeur commerciale de l’aquaculture et de la pêche.- Toxicité et risques chroniques ou intermittents pour la santé.- Diminution de la valeur esthétique et récréative des eaux affectées.Elle débute donc par une prolifération anormale d’algues et se termine par l’asphyxie et ladestruction de l’ensemble de l’écosystème.- 6 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueFigure 1 : Différentes étapes du phénomène d’eutrophisation [1].II. L’azote inorganique en milieu aquatiqueII.1. Cycle de l’azoteL’azote représente 78% de l’atmosphère gazeux et 4 à 6% du poids sec d’unanimal. L’ensemble des réactions biologiques de croissance requiert la présence del’élément azote. Le cycle d’azote est parfaitement connu et fait intervenir des réactions defixation, d’assimilation, d’ammonification, de nitrification et de dénitrification.- 7 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueLa fixation de l’azote correspond à la conversion de l’azote atmosphérique en azoteutilisable par les plantes et les animaux. Elle se fait par certaines bactéries qui vivent dansles sols et dans l’eau et qui réussissent à assimiler l’azote diatomique N 2 . Il s’agit enparticulier des cyanobactéries et de certaines bactéries vivant en symbiose avec les plantes.La réaction chimique type est :2N 2 (g) + 3( CH 2 O) + 3 H 2 O 4 NH + 4 + 3 CO 2Dans les sols où le pH est élevé, l’ammonium se transforme en ammoniac gazeux:NH + 4 + OH -NH 3 (g) + H 2 OLa réaction nécessite un apport d’énergie de la photosynthèse.La nitrification transforme (NH + 4 , NH 3 ) en nitrites et nitrates. C’est une réactiond’oxydation qui se fait par catalyse enzymatique reliée à des bactéries dans le sol et dansles eaux. La réaction chaîne est :2 NH + 4 + 3O 2 2 NO - 2 + 2 H 2 O + 4 H +2 NO - -2 + O 2 2 NO 3La dénitrification fait revenir l’azote à l’atmosphère sous forme N 2 ; il s’agit d’une-réaction de réduction de NO 3 par l’intermédiaire des bactéries transformant la matièreorganique:4 NO - 3 + 5(CH 2 O) +4H + 2N 2 (g) + 5CO 2 (g) + 7H 2 OL’activité humaine perturbe ce cycle par l’introduction de grandes quantités deNH + 4 , NH 3 et NO - 3 , ce qui se produit suite aux combustions industrielles et domestiques.Par contre, la grande majorité des émissions provient de l’agriculture.L’azote est considéré comme second polluant des eaux après le carbone et avant lephosphore. On le retrouve sous différentes formes : il est dissous sous forme d’ammoniac,de nitrite et de nitrate et présent dans les molécules organiques comme les acides aminés etles particules en suspension.II.2. Origine des pollutions azotées :Les apports en azote viennent s’ajouter aux pollutions naturelles et sont soit diffussoit locaux. Parmi les apports diffus, on peut citer :- 8 -

Chapitre ISynthèse bibliographique- La déposition et l’entraînement par l’eau de pluie de gaz et aérosols contenant l’azoteminéral produit par l’industrie (combustion de carburants fossiles, incinérations desordures…) et par la décharge des composés agricoles.- Le ruissellement et le lessivage des terres agricoles fertilisées ou les zones de stockaged’excréments animaux, qui apportent essentiellement les formes ammoniaques et nitrate.Les apports ponctuels concernent essentiellement :- Les industries produisant des émissions d’ammoniaque et les industries utilisant lesnitrates dans leurs procédés de fabrication (salaison de viandes, production de fertilisants,de verre,…)- Les systèmes de traitement des eaux usées et by-pass des stations d’épuration (formesNH + 4 et NO - 3 )II.3. Conséquences des pollutions azotéesII. 3. 1. Pollution par les nitrites et nitratesa- Voies d’expositionL’exposition de la population aux nitrates et aux nitrites se fait principalement parles aliments et occasionnellement par l’eau de consommation (figure 2). Chez l’adulte, laprincipale source des nitrates et des nitrites provient des légumes et des produits carnés(l’action anti-microbienne des NO - 3 /NO - 2 est reconnue depuis longtemps, ils sont utilisésdans la conservation de ces produits). L’apport en nitrate attribuable à l’eau potable devientimportant lorsque les concentrations en nitrates sont anormalement élevées.Dans le cas des enfants nourris avec du lait maternisé, l’eau utilisée pour la préparation dece lait est la seule source des nitrates : elle peut ainsi devenir une source importanted’exposition lorsque l’eau est contaminée.b- Toxicité des nitratesLes nitrates ne sont guère toxiques, mais ce n’est qu’à deux conditions que peut serévéler leur toxicité : s’il y a ingestion vraiment massive de ces composés ou s’ils sonttransformés en nitrites par la microflore digestive au sein de l’organisme. Une fois ingérés,- 9 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueles nitrates sont rapidement absorbés au niveau de l’intestin grêle puis distribués dans toutl’organisme. La microflore buccale transforme une partie des nitrates secrétés dans lasalive en nitrites. Leur réduction en nitrites peut également survenir au niveau des voiesurinaires à la suite d’une infection bactérienne et dans l’estomac.EauLégumesNitratesAdditifsalimentairesAbsorptionAu niveau des intestinsRéductionAu niveau de l’estomacPar des bactériesnitrato-réductricesEn nitritesNO 2-EliminationparEffets pathogènesVoie urinaireMéthémoglobinémieVoie entérohépatiqueCircuit salivaireCancerFigure 2 : voies d’exposition de l’Homme aux nitrates et leur assimilation, élimination outransformation dans le corps humain en fonction de leurs concentrations.Dans les milieux biologiques, la transformation des ions NO - 3 en ions NO - 2 ne peuts’effectuer que sous l’action d’une enzyme : la nitrate réductase qui est présente dans tousles organismes susceptibles de métaboliser le nitrate tels que les plantes, les champignonsainsi que quelques espèces de levures et bactéries.- 10 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquec- Toxicité des nitrites :Les nitrites consommés directement proviennent des produits carnés. Ils sontautorisés comme conservateurs dans ces produits. Ils inhibent le développement du germeresponsable de la toxi-infection alimentaire grave, appelée le botulisme [2]. Ils neutralisentla prolifération des microbes dangereux dans la charcuterie, comme les staphylocoques etle bacille botulique qui est un poison mortel.La méthémoglobinémie (ou syndrome du bébé bleu) est un problème de santéassocié à l’ingestion des nitrites et des nitrates. Dans ce cas, l’ion nitrate est converti en ionnitrite dans l’estomac, puis il est absorbé par la circulation sanguine. Les nitrites oxydentl’hémoglobine sanguine en méthémoglobine qui sous cette forme n’est plus apte à jouerson rôle de transporteur d’oxygène ce qui entraîne une hypoxie au niveau des tissus. Chezl’adulte, l’organisme humain est capable de lutter contre cette agression car il dispose d’unsystème enzymatique apte à effectuer la réaction inverse et à transformer laméthémoglobine en hémoglobine réduite (méthémoglobine réductase). Par contre, cecin’est pas le cas chez le nourrisson ne possédant pas cet équipement enzymatique ; ce quiaugmente les risques des intoxications graves. Ceci altère la capacité des globules rougesde transporter l’oxygène. Les symptômes de cette maladie sont notamment la cyanose(décoloration bleutée de la peau et de la bouche), la difficulté de respirer et la fatigue (descas mortels ont été rapportés).Si le pouvoir cancérigène du nitrite est très discuté, la formation des nitrosamines àpouvoir cancérigène est par contre indiscutable et est possible à partir de nitrite et d’aminessecondaires et même tertiaires. Cette formation se produit dans le tube digestif duconsommateur.II.2.2. pollution par l’ammoniumL’ammoniac existe simultanément sous deux formes, NH 3 (ou ammoniac nonionisé) et NH 4 + (ammoniac ionisé ou ammonium). L’ammoniac total est la somme de NH 3et NH 4 + . L’équilibre entre les deux est régi en grande partie par le pH et la température. La- 11 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquesolubilité de NH 3 dans l’eau pure est élevée et de l’ordre de 900g/L à 0°C [3]. L’ammoniacNH 3 étant une base faible dont la réaction d’ionisation dans l’eau est :NH 3 + H 2 O NH 4 + + OH - pK A = 9.26K A désigne la constante d’acidité de NH 4+Dans la gamme des pH de la plupart des eaux naturelles, l’azote ammoniacal existeprincipalement sous forme de NH + 4 .L’ammoniac est un composé naturel dont ont besoin la plupart des organismespour la synthèse des protéines. Les humains se servent principalement de l’ammoniaccomme source d’azote dans les engrais. Les principales sources quantifiables d’ammoniacdans les écosystèmes aquatiques sont les stations municipales de traitement des eaux usées.L’agriculture est aussi une source de contamination des eaux par l’ammonium.On trouve aussi l’ammoniac dans un certain nombre de denrées alimentaires(fromage, viande vieillie ou entreposée et les légumes entreposées). Les sels d’ammoniumsont largement utilisés dans les aliments cuits au four, les bonbons, la gélatine, les graisses,les huiles, les gelées, les fromages, les fruits traités et les boissons.La présence de l’ammonium dans les eaux peut engendrer divers inconvénientscomme la corrosion des conduites, la diminution de l’efficacité du traitement dedésinfection au chlore et le développement de microorganismes responsables de saveurs etd’odeurs désagréables. Elle peut donc révéler l’existence d’une décomposition de matièresorganiques dans le milieu, ce qui constitue un indice de pollution des nappes phréatiques.Suite à ce type de pollution, les problèmes suivants peuvent intervenir :- L’ammoniac est oxydé par les bactéries en nitrite et nitrate conduisant à une baisse dela concentration en oxygène dissous et à la mort des poissons.- L’ammoniac NH 3 et l’ammonium NH + 4 sont en équilibre chimique ; l’augmentation dela température et /ou du pH provoque une production de plus en plus importanted’ammoniac qui est toxique pour les poissons et pour l’homme. Si l’ammonium estdisponible en excès, la forme ammoniac libre NH 3 peut s’accumuler dans l’organisme et- 12 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquecauser des effets néfastes. Il est irritant, affecte souvent les yeux, le nez, la gorge et lespoumons. S’il est ingéré, il corrode les parois de la bouche, l’œsophage et l’estomac.- La volatilisation de NH 3 contribue aussi à un transfert de l’azote contenu dans leseffluents d’élevage vers l’atmosphère. Ce qui entraîne des conséquences potentiellesvariées sur la santé humaine et animale (asthme, bronchites chroniques, diminution desperformances zootechniques) et sur les écosystèmes (acidification et eutrophisation).III. Le phosphoreIII. 1. Le phosphore dans le milieu aquatiqueLa principale source naturelle du phosphate est la pierre. Il est généralement libérépar l’érosion. Durant son parcours vers la mer, la molécule du phosphate pourra êtreabsorbée par des plantes ou des animaux puis retourne au sol ou à l’eau par le biais de ladécomposition végétale, animale ou par voie urinaire. Le cycle du phosphate est par lasuite perturbé avec l’arrivée de l’agriculture et de l’urbanisation.Dans les eaux, le phosphore se trouve principalement sous forme d’orthophosphate(H x PO x-3 4 ), de polyphosphates (polymères d’acide phosphorique) et de forme organique duphosphore. La forme orthophosphate est la prépondérante, en raison de l’hydrolyse desdeux autres espèces. L’ion phosphate peut se trouver sous trois états de protonisation:H 3 PO 4 + OH - H 2 PO 4 - + H 2 O pK A1 = 2.1H 2 PO 4 - + OH - HPO 42-+ H 2 O pK A2 = 7.2HPO 42-+ OH - PO 4 3- + H 2 O pK A3 = 12.5K Ai désigne les constantes d’acidité des espèces H 3-i PO 4 i- .Le phosphore est un élément indispensable à la vie. En soi, il n’est pas toxique maisil provoque l’eutrophisation lorsqu’il est en excès dans l’eau. Le phosphate est la formesous laquelle le phosphore peut être assimilé par les êtres vivants, en particulier les algues.La prolifération de ces algues peut avoir de nombreux effets néfastes, telles par exemple,l’augmentation de la turbidité de l’eau, la diminution de l’aspect esthétique et la réduction- 13 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquedes activités de loisirs. Certaines algues (algues bleues) peuvent produire des substancesqui empoisonnent le zooplancton, les poissons, les oiseaux aquatiques, le bétail et leshumains.Présentes à forte densité, les algues font augmenter les coûts de traitement de l’eaupotable et donnent à l’eau une mauvaise odeur et un mauvais goût [4].D’un autre point de vue, les algues sont depuis toujours utilisées comme aliments,engrais ou médicaments. Aujourd’hui, elles font l’objet de demandes importantes etvariées dans différents domaines : industries alimentaires ou textiles, cosmétologie,thalassothérapie, diététique ou agriculture (compost à base d’algues). Les algues sont aussiutilisées comme bioindicateurs du niveau de radioactivité en milieu marin car ellesconcentrent certains éléments radioactifs [5].Le phosphate remplit différentes fonctions dans la formation des détergents, enparticulier anticalcaire et anti redéposition. Il est présent dans les eaux sous différentesformes : forme dissoute ou particulaire, organique ou minéral.III.2. Le phosphore dans les biofilms de cyanobactériesLe contrôle du phosphore est d’une grande importance pour la protection deshéritages culturels. Il a été montré que le phosphate est en partie responsable de labiodéterioration des sites archéologiques causé par la prolifération des cyanobactéries. Eneffet, une grande variété de microorganismes envahissant la pierre peut être observée audessous et au dessus de la roche, à l’extérieur comme à l’intérieur des monuments. Cesmicroorganismes développent des systèmes complexes contenant plusieurs espècesappelées biofilms.En particulier, dans l’Hypogée Romain archéologique à Rome, l’abondance desnutriments dans des substrats lithiques, les apports de quelques composés par le milieuenvironnant, le taux d’humidité assez élevé ainsi que l’éclairage artificiels constituent desconditions très favorables à la formation de ces microorganismes.Les cyanobactéries étant des microorganismes photosynthétiques capables des’adapter et s’acclimater à des émissions de photons de très faibles et variables énergies- 14 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquesont les plus capables d’attaquer la surface de la pierre. Exposés à la lumière, ces biofilmscausent des dommages chimiques, physiques et esthétiques [6].En même temps, la disponibilité de la matière organique, produite à partir de laphotosynthèse de cyanobactéries et de la fixation de l’azote N 2 , favorise la croissance desmicroorganismes hétérotrophiques (bactéries et champignons au niveau du biofilms), quisont capables de consommer la matière organique tout en libérant des composésorganiques acides. Ces derniers solubilisent les minéraux constituant les roches [7]. Ainsi,les sels nutritifs comme le phosphore peuvent se libérer du substrat, se transformer ou setrouvent stocker dans les cellules de cyanobactéries [8]. Généralement, 0.6% du poids secde ces cellules est constitué de phosphore qui est principalement sous formed’orthophosphate [9].B. Généralités sur les techniques utilisées pour la détermination des ions : Nitrate,nitrite, orthophosphate et ammoniumI. Méthodes d’analyse des nitrates et nitrites :Les nitrites et nitrates sont rarement analysés séparément parce qu’on ne peut pastrouver l’un sans trouver l’autre dans un milieu donné. Par conséquent, la majorité derecherches repose sur les interconversions, particulièrement la réduction chimique de l’ionnitrate pour former l’ion nitrite qui est plus réactif. L’essor des techniques d’analyse de cesions devient de plus en plus important à cause des problèmes environnementaux quirésultent de leur usage excessif.Selon Moorcroft et ses coll. [10], les méthodes de détection des nitrites / nitratessont basées sur les réactions représentées sur la figure 3.Des méthodes électrochimiques associées à l’électrophorèse capillaire permettentla détection simultanée des ions nitrite et nitrate. Chaque ion est mesuré indépendammentde l’autre au cours d’une seule analyse. Les analyses séquentielles reposent sur l’analysedans une première étape de l’ion nitrite initial, suivie de la réduction de l’échantillon (parexemple en utilisant une colonne Cu/ Cd), ce qui permet la conversion totale du NO - 3 enNO - 2 . Une seconde analyse des nitrites totaux permet de déterminer la concentration desions nitrates égale à la différence entre NO - 2 total et initial.- 15 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueGénéralement, le NO - 3 relativement inerte est réduit chimiquement (voie 1, figure-3) en NO 2 plus réactif avant d’entamer l’étape de la détection.Un grand nombre d’agents réducteurs a été étudié dans ce cas tels que : le zinc [11],hydrazine- cuivre [12] et le cadmium cuivré [13]. Les colonnes de cadmium/ cuivre sontles plus efficaces (le rendement de la conversion est proche de 100%).Takeda et coll. [14] ont développé une nouvelle méthode de réduction à l’aide desradiations UV à des longueurs d’onde comprises entre 200 et 300nm, l’ion nitrate esttransformé en ion nitrite et oxygène selon la réaction ci-dessous.200 – 300nmNO 3-NO 2 - + 1/2 O 2La chimiluminescence nécessite aussi une étape de conversion des NO 3 - en NO(voie 3, figure I). Plusieurs agents réducteurs ont été utilisés à ce propos, tels Ti 3+ [15, 16],V 3+ [15, 17], Mo 5+ + Fe 2+ et Cr 3+ [13].La plupart des méthodes développées ces dernières années utilisent le systèmed’analyse par injection en flux continu (FIA) qui permet d’améliorer la sensibilité et larapidité de l’analyse.Figure 3 : Différentes voies pour la détection de NO 2 - et NO 3 - . Ar est un noyau aromatique.- 16 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueI.1. Méthodes spectroscopiques :Les méthodes spectroscopiques (UV / Visible [18-26], la chimiluminescence [15,16, 27] et la fluorimétrie [28- 31]) sont largement utilisées pour la détermination des ionsnitrites et nitrates. Pour l’analyse de l’ion NO - 2 , la méthode de Griess est la plus exploitée.Développée depuis 1879 [32], elle ne cesse d’avoir des applications jusqu’à présent. Cettetechnique repose sur la réaction de diazotation entre le nitrite acidifié et une aminearomatique. Le produit de la réaction est un complexe hautement coloré dont la densitéoptique permet de déduire la concentration des ions NO - 2 (voie 2, figure 3). Le complexeformé présente un maximum d’absorption entre 500 et 600 nm et peut être détecté par unspectrophotomètre visible conventionnel. Les réactifs utilisés sont la sulfanilamide et le N-(1-naphthyl) ethylènediamine.La limite de détection dans le cas du protocole de Griess varie entre 0.2 et 2µmol/Lavec une gamme de linéarité qui s’étend de 1 à 100µmol/L et une longueur du trajetoptique qui varie de 1 à 5 cm. Cette technique est simple et sensible mais non fiable dans lecas des milieux complexes : les antioxydants (par exemple l’acide ascorbique)additionnées aux aliments détruisent le nitrite acidifié avant qu’il réagisse avec l’aminearomatique et conduit à une baisse du taux de recouvrement [33]. D’autres problèmes sontaussi rencontrés dans l’analyse des échantillons fortement colorés et turbides. Lachromatographie liquide haute pression (HPLC) et le système d’analyse par injection enflux continue (FIA) ont été couplés au détecteur spectrophotométrie reposant sur leprotocole de Griess afin de permettre l’analyse des nitrates et nitrites dans des matricesparticulièrement complexes tels que les produits alimentaires [34,35].Les méthodes spectrophotométriques utilisent une variété de réactifs pour formerles produits colorés. La réaction entre l’ion nitrite et le 3,6-diaminocridine (proflavin) enmilieu acide donne naissance à un composé violet et stable (λmax = 328nm). Cettetechnique est sensible mais l’ion Fe 3+ interfère si sa concentration dépasse 1mg/L [36].D’autres techniques permettent la mesure des nitrites en mettant à profit sur soneffet catalytique vis-à-vis des réactions de complexation. Par exemple, l’oxydation dugallocyanine par le bromate en milieu acide [37] se déroule très lentement mais la présence- 17 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquedes nitrites permet d’accélérer cette réaction. Le complexe ainsi formé est mesuré à 530nm. L’inconvénient de cette technique est dû à l’interférence d’un grand nombre d’ionslors de la mesure. Dans le même sens, Pettas et coll. [38] ont montré que la réactiond’oxydation du bleu de thymol par le bromate dans un milieu acide est catalysée par l’ionnitrite. L’absorbance est mesurée à 543nm.La dosage fluorimétrique des ions cérium Ce 3+ provenant de l’oxydation des nitritespar Ce 4+ représente le protocole indirect le plus simple pour analyser NO - 2 . Cependant,l’interférence de quelques espèces redox présente un inconvénient pour cette méthode [39].Lapat et coll. [40] ont étudié deux méthodes fluorimétriques pour analyser l’ion nitriteaprès complexation par l’acide 2-amino-4-chloro-1-hydroxybenzéne-6-sulfonique ou le 4-aminofluorescien. Les complexes ainsi obtenus sont hautement fluorescents. De même le2,3-diaminonaphthalène réagit en milieu acide avec l’ion nitrite pour former le 2,3-nitronaphthotriazole dont la longueur d’onde d’excitation est égale à 365nm et celled’émission est d’environs 387nm. La limite de détection dans ce cas est de l’ordre de 0.1µmol /L [41].Pour le dosage des ions nitrites par chimiluminescence, la conversion de NO - 2 enNO gazeux se fait en présence de l’iodure de potassium en milieu acide. Cette méthodepermet de déterminer l’ion nitrite dans des échantillons complexes en libérant le monoxyded’azote. Elle repose sur la réaction entre NO gazeux et l’ozone [42, 43] qui conduit audioxyde d’azote à l’état excité (NO 2 *) et l’oxygène moléculaire. La molécule excitéerevient spontanément à son état fondamental en émettant une radiation infrarouge delongueur d’onde voisine de 600nm (voie 4, figure 1). La chimiluminescence permetd’analyser les nitrates à condition d’utiliser des réducteurs forts comme Ti 3+ [42]. Coupléeau système FIA, cette technique a permis d’obtenir des limites de détection très faibles del’ordre de 10nmol/L [42, 43].La spectroscopie d’absorption atomique couplée au système d’analyse par injectionen flux continu FIA [44] a été aussi utilisée pour le dosage indirecte des ions nitrates etnitrites. Ces ions réagissent avec le chélate du cuivre (I)-neocuproine et forment des pairesd’ions qui sont extraits par le methyl-isobutyl-cétone. Le signal du cuivre en phase- 18 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueorganique est proportionnel à la concentration des ions NO 3 - ou NO 2 - . Le système permetd’analyser 35 échantillons par heure.I .2. Méthodes électrochimiques :Dans le même sens, les méthodes voltamétriques sont élaborées pour la premièrefois pour réduire électrochimiquement l’ion nitrate à des électrodes de cuivre [45- 47].D’autres types d’électrodes sont par la suite étudiées et sont en Nickel [48], cadmium [49],platine [50], carbone vitreux [51], en argent [52] et récemment les électrodes de graphitedopée par le bore [53- 54]. Ces méthodes présentent généralement une cinétique detransfert de charge assez lente, montrent souvent une faible sensibilité et une mauvaisereproductibilité.Par contre, l’ion nitrite est plus réactif et peut être oxydé ou réduit à l’électrode decarbone vitreux [55, 56]. Même si de nombreuses applications sont envisageables à l’aidedes électrodes conventionnelles, leur mise en œuvre directe dans des milieux complexes seheurte à des problèmes de surface (salissures…) et à un manque de sélectivité. Afin derésoudre ces problèmes, de nouvelles stratégies destinées à modifier la surface desélectrodes furent envisagées pour augmenter leur sensibilité. Il a été aussi montré que cecipeut être réalisé en introduisant un sel de métal approprié dans le milieu. A titre d’exemple,l’ion métallique Cu [47] ou le mélange Cu/Cd [57] est électrolytiquement déposé surl’électrode et fournit une surface active fraîche au sein de laquelle se produit la réaction deréduction des ions nitrates et nitrites.Des protocoles de modification de l’électrode plus délicats ont été élaborés. Ilsutilisent toujours des ions métalliques sous forme de complexes [58] pour la réduction desions nitrates / nitrites : des films de polypyrrole dopés avec l’anion tungstodiphosphate(P 2 W 18 O 6- 62 ) [59], des hétéropolytungstates substitués de fer [60] et des électrodes de filmde mercure recouvertes de nafion avec des ions Yb 3+ ou UO 2+ 2 incorporés [61].-Les ions NO 2 peuvent aussi être réduits en monoxyde d’azote NO. Le signalampérométrique est mesuré à une électrode d’or modifié par du PTFE [62].- 19 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueDans le cadre des biocapteurs, les enzymes réductases [63] permettent d’améliorerla sélectivité et la sensibilité lors de la réduction des ions nitrates et nitrites. Reshetilov etses coll. [64] ont développé un biocapteur basé sur l’oxydation des nitrites par la bactérieN. vulgaris strain. L’étape d’oxydation est suivie de mesure ampérométrique du tauxd’oxygène formé au cours de cette réaction. Malgré les avantages que présentent lesbiocapteurs, ils sont rarement utilisés pour le dosage du nitrite / nitrate parce que lesréactifs sont très coûteux et le système est très complexe et instable.Comme mentionné auparavant, dans le cas des méthodes spectrophotométriques, ladétermination directe des ions nitrates n’est pas facile. En effet, l’analyse de NO - 3 nécessitedans la plus part des cas, une étape préliminaire de réduction chimique en utilisant lacolonne de cadmium / cuivre ou un autre système réducteur. Ce pendant, cet ion peut aussiêtre déterminé par l’intermédiaire de ses propriétés chimiques de substitution descomposés aromatiques tels que l’acide benzoïque, l’acide salicylique, l’isoquinoline etl’acide thiophène- 2-carboxylique (voie 5 figure 3). Les produits ainsi obtenus (dérivésnitrés) sont dosés en mesurant le courant de réduction à une électrode de carbone vitreuxpar la voltamètrie linéaire entre +0.0 et +0.5V. Il s’est avéré que l’acide thiophène-2-carboxylique donne la meilleure réponse [65] avec une limite de détection de l’ordre de0.1µmol/L et quelques problèmes d’interférences, notamment celle de l’oxygène dissous.Des méthodes indirectes pour l’analyse de nitrite ont été développées en se basantsur la réaction de Griess. Le sel diazonium formé suite à la réaction entre le nitrite acidifiéet le phenylènediamine substitué est réduit électrochimiquement [66]. Le signal deréduction est bien défini, intense et situé aux environs de -0.2V où le problèmed’interférences des éléments électroactifs ne se pose pas.Le système iodure / iodate (I - / I - 3 ) peut aussi être exploité dans l’analyse indirectedu nitrite. C’est un système électrochimique réversible à l’électrode d’or et de platine enmilieu acide sulfurique [67]. La technique repose sur la réaction chimique entre le nitrite etl’iodure en milieu acide pour former l’ion iodate I - 3 qui est réduit ampérométriquemententre +0.2 et +0.3V par rapport à l’électrode au calomel saturé (ECS). Des microélectrodesen platine sont aussi utilisées pour mesurer l’ion I - 3 . Couplé au système FIA, une limite de- 20 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquedétection de l’ordre de 70nmol/L en nitrite a été atteinte. Le nombre d’échantillonsanalysés par heure est de 60.Les méthodes potentiométriques ont été aussi étudiées [68, 69, 70] pour l’analysedes nitrites / nitrates. L’approche la plus connue est l’électrode sélective (ISE : en anglaision sélective electrode) qui est commercialisée depuis longtemps par diverses sociétés(Tableau 1). La diffusion sélective des espèces chargées de la solution vers la membranedonne une différence de potentiel qui varie en fonction de l’activité des espèces ioniquesselon le modèle de Nernst. Par conséquent, la courbe de calibration du potentiel enfonction de la concentration des ions nitrates ou nitrites est obtenue. La durée de vie del’électrode peut dépasser 15 mois [70].Tableau 1 : Exemples d’électrodes sélectives commercialiséesSociété, pays Electrode Linéarité (ppm) Limite dedétectionSubstancesinterférentesNico2000 Ltd, UK-ELIT 8021, NO 3 3- 62 0.3 ppm Cl - -, NO 2-ELIT 8071, NO 2 1- 460 0.5 ppm CN - , AcétateThermo-Orion, USA Orion nitrateelectrode Model 93070.4- 62000 -- NO - 2 , ClO - 4 , I -CN - , PO 3- 4 ,SO 2- 4 ,....RadiometerAnalytical, FranceISE25NO 3 0.2 – 60000 -- Cl - , Br - -, NO 2Pour la plupart des prototypes commercialisés, la limite de détection est insuffisantepour la mesure de faibles concentrations en ion nitrite. Ces détecteurs sont par conséquentutilisés pour des échantillons fortement contaminés. Par contre, l’électrode sélective auxions nitrates, présente toujours des limites de détection de l’ordre des micromolaires. Sonseul désavantage est la présence des éléments interférents.I.3. La chromatographie ioniqueLa chromatographie ionique est mise à profit pour la première fois en 1975lorsqu’elle est couplée à la détection conductimétrique a été réalisé. Cette technique a- 21 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueconnu un succès réel dans la détermination entre autres des ions SO 2- 4 , F - , Cl - , PO 3- 4 , NO - 3 ,NH + 4 , Na + --. En ce qui concerne les ions NO 3 et NO 2 qui nous intéressent, lachromatographie ionique a apporté des progrès remarquables dans l’analyse de ces ions.Son principal inconvénient est son coût élevé et son protocole expérimental assezcompliqué. En effet, des prétraitements des échantillons sont recommandés. Les détecteursassociés dans ce cas au système chromatographique sont les détecteurs électrochimiques[71, 72].La détection électrochimique du nitrite est réalisée par l’oxydation de ce dernier à uneélectrode de carbone vitreux à un potentiel voisin de +0.9V [73]. Les nitrates peuvent êtreanalysés par le même système après leur conversion en nitrite par exposition aux radiationsUV. Des limites de détection très faibles ont été obtenues (0.9 nmol/L en nitrite et 4.4nmol/L en nitrate).II. Méthodes d’analyse des ions ammoniums :L’analyse de l’ion ammonium dans les eaux naturelles est d’une grande importancetant que des teneurs élevées en cet élément sont un indice de pollution par les rejetsdomestiques et l’agriculture. Il est également important d’éliminer NH + 4 avantl’introduction de l’eau dans le réseau parce qu’il réagit avec le chlore pour produire deschloramines, qui sont des désinfectants moins efficaces et peuvent provoquer des goûtsdésagréables. Certaines bactéries prolifèrent aussi en transformant l’ammonium en nitritespuis en nitrates.Le développement de nouvelles techniques d’analyse et de contrôle de l’ammoniacdans l’eau est important car cette espèce est considérée parmi les substances indésirablespar l’OMS. On peut déterminer la quantité d’ammoniac / ammonium dans l’eau au moyende diverses méthodes.II.1. Méthodes spectrophotométriquesLa réaction de Nessler [74] ou la Nesslérisation est une méthode standard d’analysede NH 4 + . Le réactif de Nessler synthétisé à partir du chlorure mercurique, d’iodure depotassium et de potasse, ajouté aux échantillons permet de mettre en évidence la présence- 22 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquede NH + 4 . Une coloration jaune à brune se développe selon la concentration de cet ion.Cette technique n’est pas très utilisée à cause des problèmes environnementaux engendréspar l’usage du mercure.La Méthode de Berthelot [75] est par la suite développée. Elle repose sur le bleul’indophénol qui se forme par réaction des ions ammonium avec l’hypochlorite et le phénolen solution alcaline. L’usage de cette technique est limité à la chimie clinique. Cetteréaction est relativement lente, elle est difficilement reproductible et exige des réactifsfraîchement préparés.La méthode recommandée actuellement [76] est celle de Berthelot améliorée. Elleest basée sur la mesure de l’absorbance à 640nm de l’indophénol fortement coloré et formésuite à la réaction entre l’ammoniac, hypochlorite et le salicylate catalysée par lenitroprusside de sodium.D’autres techniques ont également été développées : Ghodratollah Absalam et sescoll. [77] ont mesuré la variation de l’absorbance sous 408 nm, due à la présence del’ammoniac, du complexe bis (acetylacétoneethylenediamine) tributylphosphin cobalt (III)tétraphenylborate imprégnant une membrane transparente en triacétylcellulose. Le pH dumilieu est de 9. La limite de détection est de 5.10 -6 mol/L. Cette membrane est utilisée avecsuccès dans l’analyse de l’eau de robinet.Conway [78] a procédé à la libération de l’ammoniac par alcalinisation, suivie d’unpiégeage en milieu acide et d’une révélation par le réactif de Nessler ou par la réaction deBerthelot, suivi d’une mesure spectrophotométrique. Ces méthodes sont très sensibles.Elles mesurent non seulement NH + 4 libre mais également l’ammoniac susceptible d’êtredégagé en milieu alcalin.II.2. Méthodes enzymatiquesEn 1963, Kirsten et coll. [79] ont mis au point une méthode enzymatique de dosagede l’ammoniac basée sur la réaction du glutamate déshydrogénase (GDH). Bien que cetteméthode ne soit révélée extrêmement spécifique et qu’elle permette une évaluation directefondée sur la faculté d’absorption molaire du NADH (forme réduite du nicotinamide- 23 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueadénine dinucléotide), plusieurs problèmes ont surgi. Parmi lesquelles des difficultés àstabiliser les réactifs utilisés.Da Fonseca-wollheim [80] a amélioré la réaction enzymatique de départ parl’addition de NADPH au mélange réactionnel au lieu de NADH selon l’équation :α-cétoglutarate + NH 4 + + NAD(P)HNAD(P) + + glutamate + H 2 OL’utilisation de NADP (forme oxydée du nicotinamide adénine dinucléotidephosphate) au lieu de NAD permet d’améliorer la spécificité de la méthode en éliminantl’interférence potentielle de substrats consommant du NADH comme le pyruvate (enprésence de la LDH plasmatique). La modification de la concentration du NAD(P)H estmesurée à 340nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Ces techniques sont les plus adéquatespour traiter des échantillons de faible volume.D’autres techniques enzymatiques ont utilisé les méthodes électrochimiques commeoutil de mesure : J. P. Hart et coll. [81] ont développé un biocapteur ampérométrique àbase d’électrodes de carbone sérigraphiées imprégnées de Meldola’s blue (MB). Cesélectrodes détectent la réaction d’oxydation du NADH à un potentiel égal à +0.05V (parrapport à l’électrode Ag/AgCl). L’ammoniac est mesuré en recouvrant la surface desélectrodes modifiées par du glutamate dehydrogénase, du 2-oxoglutarate et du NADH.Lorsque l’ion NH + 4 est présent en solution, le courant anodique diminue suite à la réactionenzymatique de conversion du 2-oxoglutarate en glutamate qui consomme le NADH. Lalimite de détection est aux environs de 2µmol/L lorsqu’on utilise 4.6 unités d’enzyme.II. 3. Méthodes électrochimiquesII.3.1. La potentiométrie :L’ammoniac dissous (NH 3 aq et NH + 4 ) est converti en NH 3 aq en ajoutant une baseforte aux standards et aux échantillons. La concentration de NH 3 est mesurée à l’aide del’électrode sélective d’ammoniac. Ce détecteur constitué d’électrode de verre équipéed’une membrane perméable à gaz est plus employé [82]. Dans ce système, Le gazammoniac produit diffuse à travers une membrane en PTFE (téflon) dans le compartiment- 24 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquede l’électrode en verre contenant une solution de NH 4 Cl. Cette diffusion de l’espèce NH 3crée un nouvel équilibre réactionnel et par la suite un changement de pH de la solutionsituée à proximité de la surface de l’électrode.Pour pallier au problème de fragilité de l’électrode de verre, de nombreusesmembranes polymériques contenant des molécules sélectives ont été proposées pour lafabrication de l’électrode sensible à l’ammonium (Meyerhoff [83] et Meyerhoff et coll.[84]). A titre d’exemple, les membranes en chlorure de polyvinyl (PVC) avec desmolécules du nonactin incorporées. Ce système présente l’avantage d’être simple, sensibleet pas coûteux mais sa durée de vie est très courte (1 semaine).Les détecteurs potentiométriques développées par la suite sont basés sur desmembranes épaisses obtenues par incorporation d’échangeurs d’ions inorganiques à despolymères plastifiés. Ces membranes spécifiques à l’ion NH + 4 , présentent une grandestabilité thermique et une grande résistance vis-à-vis des acides minéraux et des oxydantsforts. Ce pendant, ce type de détecteur n’a pas connu beaucoup d’applications à cause de safaible sélectivité. Par contre, Saad S. M. Hassan et ses Coll. [85] ont beaucoup gagné enterme de sélectivité en utilisant l’échangeur d’ions zirconium titanium phosphate (ZTP).Ce détecteur a été couplé au système FIA, 30 échantillons peuvent être analysés par heuredans une large gamme de linéarité qui s’étend de 12µmol/L jusqu’à 1 mol/L.II.3.2. Les techniques voltamétriquesLa mise au point de capteurs hautement sélectifs et faciles à manipuler nécessite engénéral la modification de la surface d’électrodes en utilisant des enzymes immobilisées oudes polymères conducteurs. A titre d’exemple, citons le détecteur ampérométriquedéveloppé par B. Strehlitz et coll. [86] qui consiste à mesurer l’ion ammonium à unpotentiel égal à +0.3V par rapport à Ag/AgCl en utilisant des électrodes sérigraphies dePlatine-carbone modifiées par de la polyaniline. Le même type de capteur a été couplé ausystème FIA [87].Il existe peu de techniques voltamétriques pour le dosage de NH 4 + : la méthodebasée sur sa réaction avec l’hydroquinone en présence de dimethylformamide [87] a- 25 -

Chapitre ISynthèse bibliographiquemontré que l’équilibre acide base qui existe entre l’hydroquinone et l’ammonium peut êtreexploité pour détecter NH + 4 . L’ion ammonium arrache des protons à l’hydroquinone quis’oxyde vers +1.0V. Ceci permet de déplacer le processus d’oxydation vers un potentielmoins positif (aux environs de +0.5V). Le pic résultant a une intensité proportionnelle à laconcentration de NH + 4 .Un amalgame d’ammonium peut être obtenu par électrolyse d’une solution de seld’ammonium à une cathode de mercure [88]. Cet ion est réduit à l’électrode à goutte demercure à un potentiel de demi vague égal à -1.72V. La solubilité de NH + 4 dans le mercureest suffisante (∼10 -4 mol/L) pour le préconcentrer à la surface de la microélectrode dumercure en utilisant la voltamétrie par redissolution anodique. Gladyshev [89] a montréque cette technique n’est pas efficace pour l’analyse de l’ammoniac et l’ammonium et quecette analyse est possible tout en choisissant un moyen plus simple : mesurer l’ammoniumà une électrode à film mince de mercure en utilisant la voltamétrie par redissolution dansune solution de chlorure de potassium. La limite de détection obtenue est de 0.2µmol/L.Une autre méthode très sensible a été développée par Anne Marie Harbin et Coll.[90]. Elle repose sur la réaction entre l’ammoniac et le formaldéhyde à pH 3.8 donnantnaissance au composé méthylenimine. Ce produit est adsorbé à la surface de l’électrodependante de mercure (HMDE). La voltamétrie impulsionnelle différentielle permet demesurer le courant de réduction à -0.91V. Après le déroulement de la réaction chimiquequi dure 20 minutes, la réponse est enregistrée en utilisant la voltamétrie par redissolutioncathodique (CSV). Elle est proportionnelle à la concentration de l’ion ammonium dansl’intervalle 0.01 à 3µmol/L. La réaction de réduction du méthylenimine protonée donnantnaissance au méthylanine est la suivante:H 2 C = NH 2 + + 2 e- + H + H 3 CNH 2- 26 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueIII. Méthodes d’analyse des phosphatesIII.1. Méthodes spectrophotométriquesLes méthodes d’analyse de l’orthophosphate basées sur sa réaction avec les ionsmolybdate sont largement mises à profit dans la littérature.La méthode standard colorimétrique [91] est basée sur la réaction des ions PO 3- 4 avecl’acide molybdique pour former le phosphomolybdate, qui est par la suite réduit pourformer le complexe fortement coloré : le phosphomolybdate bleu. Cette méthode a connuplusieurs modification notamment en cherchant d’autres agents de réduction du 12-molybdophosphate afin d’améliorer la sélectivité et la stabilité du complexe bleu formé[92, 93]. Le réducteur le plus utilisé est l’acide ascorbique et le tartrate de potassium etd’antimoine comme catalyseur de la réaction [91]. Le seuil minimal de détection est del’ordre de 10µgP/L sous une longueur d’onde égale à 880nm, la longueur du trajet optiqueest de 5cm.Dans les eaux naturelles, les ions silicates interfèrent avec les ions phosphates.Cette interférence peut être réduite en ajustant les proportions de l’acide et du molybdateen solution [94]. Pour analyser l’orthophosphate dans les eaux naturelles il faut par ailleursarriver à détecter des teneurs de l’ordre de 1µgP/L. En effet, plusieurs techniques sontdéveloppées pour améliorer la sensibilité et la sélectivité de la spectrophotométrie.A titre d’exemples, le phosphomolybdate réagit avec un grand nombre de composésbasiques (le vert de malachite, le cristal violet et la rhodamine 6G) en milieu acide. Lecomplexe extrait est mesuré par spectrophotométrie ou par fluorimétrie. L’association duphosphomolybdovanadate et le vert de malachite a permis de déterminer le phosphate dansl’eau de rivière [95]. Les ions présents dans cette eau n’interfèrent pas. Quant à l’ionsilicate, son interférence est plus faible que celle trouvée par les techniques de mesure déjàcitées. La limite de détection est de 0.1µgP/L.Couplée au système d’analyse par injections en flux continu FIA [96], la méthodespectrophotométrique est très utilisée pour l’analyse des phosphates au laboratoire maisn’est pas applicable pour le contrôle et les mesures sur le terrain.- 27 -

Chapitre ISynthèse bibliographiqueIII.2. Les méthodes électrochimiquesLes méthodes électrochimiques ont été aussi développées : les techniquesampérométriques utilisent le complexe phosphomolybdique comme élément électroactif[97, 98]. Le phosphate a été déterminé à l’aide des méthodes voltamétriques à l’électrode àpâte de carbone [97], à la microélectrode d’or [98], à l’électrode au carbone vitreux [99] età l’électrode à goutte de mercure [100]. Les signaux obtenus mesurent la réduction ducomplexe phosphomolybdique. Les limites de détection sont de quelques micromoles parlitre.Fogg et coll. [101] ont analysé le phosphate sous forme dephosphomolybdovanadate à l’électrode au carbone vitreux. Couplé au système FIA, laprocédure permet de détecter 1µmol/L en phosphate avec un coefficient de variationinférieur à 1%. Des meilleures sensibilités ont été aussi atteintes en analyse par injection enflux continu. La limite de détection pour un rapport signal/ bruit égal à 2 est de 0.02µmol/Lsachant que le milieu électrolytique contient du méthanol à 30%.Les biocapteurs électrochimiques sont aussi reportés [102 – 104]. Ces détecteursutilisent plus qu’une seule enzyme (exemple la xantine oxydase et la nucléosidephosphorylase [104, 105], la phosphorylase A, phosphoglucomutase et la glucose 6-phosphate déshydrogénase [103], la maltose phosphorylase, acide phosphatase et laglucose oxydase [106].Les ions phosphate ont été aussi déterminés dans l’eau par chromatographie ioniquecouplé au détecteur conductimétrique [107, 108].- 28 -

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Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesIntroductionLes techniques que nous avons utilisées pour analyser les ions en question sontprincipalement la voltamétrie cyclique, la voltamétrie différentielle impulsionnelle etl’ampérométrie couplé au système d’analyse en milieu Batch. Pour la validation desméthodes proposées, nous avons comparé nos résultats à ceux trouvés en utilisant lesméthodes spectrophométriques de référence.I. Techniques électrochimiquesAfin de rivaliser avec les méthodes analytiques les plus sensibles, l’électrochimies’est dotée de techniques modernes comme la voltamétrie et l’ampérométrie. Nous allonsdans cette partie, nous limiter à la présentation de techniques ampérométriques, lavoltamétrie linéaire et cyclique et une méthode dérivée couramment employée dans cemémoire, la voltamétrie impulsionnelle différentielle.I.1. Voltamètrie à tension linéaire et cycliqueDans la pratique, on peut obtenir plus d’informations sur le systèmeélectrochimique étudié à partir d’une seule expérience, en appliquant à l’électrode unbalayage de potentiel variant avec le temps et en enregistrant directement la courbe I-Ecorrespondante. Si le mode de balayage correspond à une variation linéaire de potentielavec le temps et on enregistre le courant en fonction du potentiel alors c’est la voltamétrieà balayage linéaire.La voltamétrie cyclique consiste à soumettre l’électrode stationnaire à unedifférence de potentiel variant linéairement en fonction du temps selon une fonction endents de scie, dont les côtés sont symétriques. La première partie du voltamogramme estcomparable à la courbe enregistrée en voltamètrie linéaire. Le balayage retour apporte desinformations quant à la réversibilité de la réaction électrochimique par la position etl’intensité des courants faradiques enregistrés. L’analyse et l’interprétation des courbesintensité / potentiel ont fait l’objet de nombreux travaux et d’ouvrages de synthèse [1-3].Cette technique est souvent utilisée pour étudier le comportement des espèces en solution- 35 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentales(système rapide, réversible, nombre d’électrons échangés…) et pour avoir desrenseignements quant aux processus qui ont lieu à la surface de l’électrode (adsorption,passivation…).I.2. la voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV)Au début des années 60, on voit apparaître divers développements pour améliorer lasensibilité et la sélectivité des méthodes voltampérométriques. En effet, la présence d’uncourant de charge non négligeable, lié à la double couche représentée par l’interfaceélectrode - solution, limite considérablement l’application analytique de ces techniques. Lecourant capacitif, résultant du comportement de la double couche comme condensateur estdifficile à éliminer.Ainsi, pour différencier le courant faradique (directement lié au transfertd’électrons) et le courant capacitif (lié à la double couche représentée par l’interfaceélectrode-solution), divers signaux ont été surimposés à la tension continue habituellementappliquée. Ces techniques impulsionnelles et impulsionnelles différentielles servirent enpremier lieu au développement de la technique polarographique. Le gain sur la limite dedétection est d’un facteur de 10 2 à 10 3 .Le principe de la voltamétrie impulsionnelle différentielle [4,5] (figure 1) est desuperposer des impulsions d’amplitude constante à une tension continue qui varielinéairement avec le temps. Une impulsion rectangulaire d’amplitude ? E et de durée ? t estsuperposée sur chaque marche de hauteur ? Es et de durée ?t 1 , d’un escalier de potentiel.L’impulsion aboutit à la fin de la marche de l’escalier et ? t 1 > ? t.Le courant résultant comporte, outre la composante faradique continue, unecomposante capacitive qui diminue rapidement et une composante faradique due àl’impulsion. La mesure du courant est réalisée deux fois : une première fois avant quel’impulsion ne soit donnée, c'est-à-dire que tout courant qui n’est pas dû à l’impulsion estmesuré et mis en mémoire ; une deuxième fois à la fin de l’impulsion, afin que le courantcapacitif dû à l’impulsion ait le temps de s’annuler. Le voltamogramme est construit enportant la différence ?I = I 2 – I 1 , des courants échantillonnés à la fin de l’impulsion I 2 et- 36 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesjuste avant l’impulsion I 1 en fonction du potentiel E de la marche de l’escalier de potentiel.Son allure est présentée sur la figure 1B.(A)(B)Figure 1 : la voltamétrie impulsionnelle différentielle. (A) Le courant est mesuré justeavant (en 1) et juste après l’impulsion de mesure (en 2). L’appareil enregistre la différencede ces deux courants en fonction du potentiel (en B). La solution analysée contient deuxespèces électroactives.- 37 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesI.3. Ampérométrie :La dénomination ampéromètrie est réservée aux mesures du courant quand lepotentiel est constant et la variation de courant est due à un changement de concentrationde l’espèce électroactive résultant d’une cause extérieure, par exemple un ajout de réactif.L’agitation du milieu est nécessaire mais cela entraîne des fluctuations qui se traduisentparfois par un courant instable. On peut palier cet inconvénient en maintenant une agitationuniforme et en additionnant lentement le réactif.Il est souvent préférable d’appliquer des tensions correspondant au plateau dediffusion afin de minimiser les risques de fluctuations du courant liés à des perturbationsau niveau de l’électrode de référence. Toutefois, il est possible et parfois indispensable, detravailler à des potentiels moins élevés (potentiel correspondant à la partie ascendante de lavague) afin d’améliorer la sélectivité de la mesure.En ampéromètrie, le courant résiduel faradique dû à la présence de tracesd’impuretés électroactives, limite la sensibilité de l’analyse. Le courant capacitif résultantde la mise sous tension de l’électrode s’annule très rapidement. La limite de sensibilité estd’environ 10 -8 mol/L. Le courant résiduel dépend également de la nature de l’électrode etdes traitements chimiques ou électrochimiques qui lui été imposées [6, 7].L’ampéromètrie est très utilisée en association avec la chromatographie liquide.Cette dernière technique, d’un grand intérêt dans la séparation des espèces chimiques,nécessite une détection sensible. Mise à part, la spectrophotométrie ultraviolette, qui esttrès largement employée, la détection ampérométrique a su s’imposer en raison de sasensibilité en régime hydrodynamique et de sa complémentarité.Les détecteurs ampérométriques sont surtout utilisés en régime hydrodynamique.De nombreux auteurs avaient étudié sur le plan théorique les courants aux électrodesplacés dans les conditions hydrodynamiques, notamment Levich [8] et Matsuda et Yamada[9]. En général, lors de l’usage de tels détecteurs, la connaissance exacte du courant est depeu d’importance, puisque seul est observé le signal correspondant à une variation de- 38 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesconcentration dans l’écoulement. Toutes fois, il s’avère intéressant d’en vérifier lefonctionnement pour optimiser certains facteurs.Le champ d’action des détecteurs ampérométriques s’est élargi avec les électrodessolides de platine et de carbone. Trois géométries sont fréquemment utilisées : l’électrodetubulaire, en couche mince et à jet orthogonal (wall jet electrode).Le terme wall jet fut introduit par Glauret [10] pour décrire le phénomènehydrodynamique qui se manifeste lorsqu’un jet de fluide issu d’un orifice, frappeperpendiculairement une surface solide et s’étend radialement sur celle-ci. Ce système aété appliqué par la suite dans le domaine de la détection électrochimique. Matsuda etYamada [11] ont présenté une équation de courant limite correspondante à ce cas :I l = 1.43 n F C 0 D 2/3 ν -5/12 V 3/4 a -1/2 r 3/4ν : est la viscosité cinématiquea : le diamètre de l’entréer : est le rayon de l’électrode indicatrice.V : le débit d’écoulementF : le nombre de Faradayn : est le nombre d’électrons échangésD : est le coefficient de diffusion de l’espèce électroactive (cm 2 /s).La configuration géométrique de la cellule électrochimique adoptée en mode BIA(Système d’analyse par injection directe en milieu batch « Batch injection Analysis ») aucours de ce travail est semblable au système wall-jet. En effet, l’arrivée de la solution àanalyser dans les deux cas se produit perpendiculairement à la surface de l’électrode detravail et il a été montré que le courant mesuré en BIA est une fonction linéaire de V 3/4 [12,13].- 39 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesII. Système d’analyse par injection directe en milieu batch (BIA).II.1. Configuration géométrique de la cellule BIALe terme système d’analyse par injection directe en milieu batch « batch injectionanalysis » fut introduit par Wang et Taha [14] pour décrire une nouvelle techniqued’analyse qui entraîne l’injection, à l’aide d’une micropipette, de très petits volumes de lasolution à analyser à la surface de l’électrode de travail. Cette dernière est immergée dansun grand volume d’électrolyte support et soumise à une agitation continue (figure 2).L’orifice de la micropipette est directement placé au centre et perpendiculairement à lasurface de l’électrode à disque, cette configuration est très similaire à la configuration walljet[12, 13].Figure 2 : Diagramme schématique de la cellule BIA réalisée par Wang et Taha [14]. (A)électrode de travail ; (B) électrode auxiliaire ; (C) électrode de référence ; (D) embout de lamicropipette ; (E) orifice ; (F) barreau magnétique et (G) sortie de la solution- 40 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesDans le cas du système wall-jet couplé à la détection électrochimique, le flux de lasolution analysée, émanant d’un orifice de faible diamètre, est normal à la surface del’électrode de travail. La solution qui touche la surface de l’électrode provientessentiellement du jet et non du volume mort de la cellule ; la solution qui arrive dans ledétecteur est toujours fraîche. En effet, le volume de la cellule wall-jet n’est pas important.De même pour le système BIA, plusieurs configurations ont été présentées avec un volumede la solution de l’ordre des microlitres [15, 16] et d’autres avec des grands volumes [17].En BIA, si le temps d’injection est suffisamment long, le courant stationnaire àl’électrode sera achevé et aura la même valeur que celle obtenue dans le cas de l’électrodewall-jet sous les mêmes conditions expérimentales et pour le même système géométrique[13]. Lorsque la solution est injectée à la surface de l’électrode BIA, il se forme une zoneoù la dispersion se fait d’une façon reproductible, contrôlée dans l’espace et dans le temps[18]. La réponse est sous forme de pic : une montée puis une chute rapide du courant pouratteindre la ligne de base (figure 3). La hauteur du pic obtenu est proportionnelle à laconcentration de l’espèce analysée.Figure 3 : différentes étapes de l’opération BIA.- 41 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesLa différence qui existe entre les deux systèmes est : dans le cas du système BIA,l’injection de l’échantillon se fait directement sur l’électrode à l’aide d’une micropipetteréglable tandis que dans le cas d’un détecteur à jet frontal couplé avec le FIA, le systèmed’analyse exige la présence d’une vanne d’injection, des tubes de connexions et d’unepompe permettant de véhiculer le liquide porteur et l’échantillon.Le succès du système BIA est du principalement à la combinaison de deuxfacteurs : le principe hydrodynamique de la cellule wall- jet et la grande dilution desmicrolitres injectés dans le grand volume de la cellule. Les premières cellules BIAdéveloppées avaient des volumes allant de 250ml à 700ml ce qui assure une dilution del’ordre de 10000 fois et plus du volume injecté. Cependant, il a été montré que des mesuresen BIA - Ampérométrie peuvent être réalisées avec succès dans des petites cellules oùl’effet de mémoire du à l’accumulation du soluté n’est pas observé [15].Dans le cas du détecteur Wall- jet, le volume de la cellule est un paramètre qui nefigure pas dans l’expression théorique du courant résultant. Le volume effectif de la celluleest représenté par le diamètre de l’orifice du jet, le diamètre de l’électrode indicatrice, ledébit d’écoulement et la viscosité de la solution. L’utilisation des cellules BIA à volumeréduit présente d’autres avantages tels que la prévention des risques et pertes dus àl’emploi de la cellule à volume large, diminution de la consommation en électrolyte et lapossibilité de développer des instruments BIA portables.Il a été aussi montré que pour ce type de cellule, il est nécessaire de maintenir lasolution en agitation. L’agitation n’affecte dans ce cas ni la forme ni l’intensité des pics.Par contre sans agitation de la solution, une forte diminution du courant a été observée [18]Au cours de ce travail, la cellule BIA utilisée est une cellule wall-jet de volume égalà 40ml, fabriquée en plexiglas. La configuration adoptée (figure 4) permet une circulationrapide de la solution et permet aussi de passer du mode (FIA) au mode (BIA) ou vice versapar un simple ajustement du couvercle (figure A et B). L’électrode de travail est inséréedans l’orifice situé en bas de la cellule, le couvercle de cette dernière comprend quatreautres orifices. En mode BIA, l’orifice placé en face de l’électrode de travail sert pour ymettre la micropipette dont l’embout est situé à une distance fixée de la surface de- 42 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesl’électrode de travail, la distance optimale est comprise entre 2 et 3mm et pour l’ajuster, ilsuffit de déplacer l’électrode de travail vers le bas ou vers le haut à l’aide d’un adaptateuren PVC muni d’un joint étanche. L’électrode de référence et l’électrode auxiliaire sontplacées dans les deux autres orifices. L’entrée et la sortie permettent le drainage de lasolution sans déplacer l’électrode de travail. Le quatrième orifice sert pour ajouter lesréactifs et l’échantillon dans le cas du mode stationnaire. La solution est tout le tempsagitée à une vitesse égale à 300rpm. L’électrode de référence est une électrode d’argent/chlorure d’argent Ag/AgCl. Un tube en acier inox sert comme contre électrode. L’électrodede travail est à pâte de carbone.Figure 4: Diagramme représentatif de la cellule BIA et un détecteur à jet perpendiculairecouplé au système FIA.- 43 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesII. 2. Modèle théorique de la réponse du détecteur BIABrett et ses coll. [13] ont étudié la détection électrochimique en utilisant le systèmeBIA. Ils ont montré qu’il y a une analogie entre la détection ampérométrique en utilisant cesystème et la réponse obtenue par un détecteur à jet perpendiculaire appliqués en fluxcontinu (FIA).L’équation relative au courant limite pour ce type de détecteur est de la forme [11] :I l = 1.43 n F C 0 D 2/3 ν -5/12 V 3/4 a -1/2 r 3/4Même si le paramètre orifice du jet – électrode n’intervient pas dans l’expressionanalytique du courant limite de diffusion, il parait raisonnable de vérifier si cette distance(d) a une certaine influence sur la valeur du courant limite. Cette distance qui représente ladistance embout de la micropipette – surface de l’électrode en BIA, s’avère un paramètretrès important dans les études du système wall-jet [19, 20].La cellule BIA utilisée au cours de ce travail (figure 4) présente la mêmeconfiguration géométrique que celle réalisée par Amine et coll. [21].Il a été démontré et vérifié que la distance d dans le domaine 0.5 - 3mm n’a pasd’influence sur les courants des pics mesurés. Par contre pour d supérieure à 3mm, lecourant I l diminue. Ceci est expliqué par une dispersion du jet avant qu’il n’atteigne lasurface de l’électrode. Cette hypothèse est confirmée par le fait que le courant limitediminue au fur et à mesure qu’on s’éloigne de la surface de l’électrode.L’influence du volume injecté a également été étudiée, ce qui a permis de montrerque pour V donné dans le domaine 30µl - 100µl, l’intensité du courant du pic ne changepratiquement pas.Cette configuration adoptée donne les caractéristiques suivantes :- Une très grande sensibilité en raison de la vitesse élevée du transfert de masse(convection-diffusion) au point d’impact du liquide- Un volume mort faible.- 44 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentales- Un risque de salissure (adsorption, colmatage par les produits d’oxydation) moinsgrand en raison de l’effet mécanique de rinçage provoqué par l’impact du jet à lasurface de l’électrode.II. 3. Système BIA et applications :Comme c’est indiqué auparavant, J. Wang et Z. Taha ont été les premiers à utiliserle système BIA. Deux séries de 60 injections de ferrocyanure (A) et d’hydroquinone (B)ont été effectuées et sont illustrées sur la figure 5. Ces résultats montrent que :- La déviation standard relative ne dépasse pas 1.6 % même si les injections sontfaites à l’aide d’une micropipette manuelle.- La reproductibilité dépend de la distance séparant la surface de l’électrode etl’embout de la micropipette.- La vitesse d’injections peut atteindre 720 échantillons/ heure.- Le volume de l’échantillon injecté est de l’ordre du microlitre, ce qui permet unefaible consommation de réactifs.- Les limites de détection trouvées 5.10 -8 mol/L d’hydroquinone et 8.310 -8 mol/Ld’acide ascorbique sont nettement inférieures à celles trouvées dans le cas dusystème FIA.- 45 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesFigure 5 : réponses ampérométriques de 60 injections successives de 0.5mmol/L deferrocyanure (A) et de 0.5mmol/L d’hydroquinone (B). Potentiel appliqué +0.9V pour leferrocyanure et +1.1 V pour l’hydroquinone, volume injecté : 50µL, électrolyte support :KCl en (A) et tampon phosphate 0.1mol/L en (B).J. Wang a couplé par la suite le système BIA élaboré avec la détectionfluorimétrique [22] et spectrophotométrique [23]. Actuellement, les études qui mettent àprofit la technique BIA donnent un grand intérêt à l’ampéromètrie et la voltamétrie.Par la suite Amine et ses coll. [21] ont étudié la réponse ampérométrique d’uneélectrode enzymatique à base de glucose oxydase, de xanthine oxydase et du glutamatedéshydrogénase en utilisant la technique BIA. Cette étude a montré que la combinaison desélectrodes enzymatiques avec cette nouvelle technique s’est avérée avantageuse.Au cours des premières études faites dans ce cas, les injections ont été faites avecdes micropipettes manuelles et les performances de la méthode dépendent beaucoup de- 46 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesl’opérateur. L’usage des micropipettes automatiques programmables permet d’obtenir desrésultats avec une grande précision à cause de la grande reproductibilité des mouvementsdu piston [18]C. M. A. Brett et ses coll. [12] ont montré que le système BIA peut aussi êtrecouplés aux techniques voltamétriques telles que la voltamètrie linéaire, cyclique et àondes carrées (square wave voltametry SWV). Les performances de la méthodeampérométrique et celles de la méthode voltamétrique ont été étudiées en examinantl’oxydation de l’acide ascorbique et celle du ferrocyanure à une électrode de platine. Lavoltamétrie à ondes carrées (SWV) a donné un profil voltamétrique continu à partir d’uneseule injection de 100µL de la solution à analyser. Les courbes de calibration ont montréune augmentation de la sensibilité d’un facteur égal à 4 par rapport à la techniqueampérométrique à potentiel imposé. Cette combinaison a permis de détecter les traces desmétaux lourds à des concentrations de l’ordre de nanomolaire [24].Le système BIA a été aussi étudié en utilisant l’électrode pendante de mercure pourmesurer la teneur en acide ascorbique dans différents jus de fruits. Le minimum détectableest de 2.5µmol/L [25]. Ce système a permis aussi d’atteindre de très faibles limites dedétection dans l’analyse les traces de métaux lourds en utilisant un détecteur voltamètriqueavec électrode à film de mercure modifiée par du nafion [26] et dans l’analyse du mercure(II) par l’intermédiaire d’un détecteur ampérométrique couplé à la BIA. Au cours de cedernier travail réalisé par H. Mohammadi et ses coll. [27], la réaction d’hydrolyse dusucrose catalysée par l’invertase produit le glucose et le fructose. Ces deux formes desucres sont détectés électrochimiquement en injectant 100µL de chacune sur la surface del’électrode indicatrice (une électrode de platine modifiée par du glucose oxydase mobiliséepour la mesure du glucose et une électrode de carbone vitreux modifiée par du cuivre pourl’analyse du fructose) ; l’addition de Hg 2+ réduit la hauteur du pic d’oxydation du sucre etle taux d’inhibition de l’invertase est mesuré en fonction de la concentration du mercure(II) ajoutée. La limite de détection est de 3.0 à 4.0ng/mL.Le système d’analyse directe en milieu batch couplé à une variété de techniquesanalytiques présente beaucoup d’intérêts par rapport au système FIA. Il est plus simple, il- 47 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesn’utilise ni pompes, ni vannes d’injections ni tubes de connexion. Il consomme moinsd’électrolyte, produit moins de rejets. Il permet aussi de faire des analyses sur site si lesystème est conçu dans ce sens.De notre part nous avons développé une nouvelle méthode ampérométrique dedétection des orthophosphates en utilisant le système BIA. Cette technique a été utiliséepour l’analyse des échantillons d’eau de mer et des films des cyanobactéries [28]. Nousavons aussi développé dans le même sens une autre procédure pour l’analyse des nitritesdans des échantillons réels [29].III. Dispositifs et conditions expérimentalesIII.1. Cellules électrochimiquesNous disposons de deux cellules différentes à trois électrodes :- La première est utilisée pour les mesures voltamètriques et ampérométriques en milieuBatch, c’est une cellule classique en verre. Son volume est de 10 mL.- La deuxième est la cellule BIA décrite précédemment. Le matériau choisi pour saréalisation est le plexiglas. Son volume est plus important, il est égal à 40 mL.Il faut noter que la géométrie de ces cellules exige une disposition bien déterminée destrois électrodes. Il est important en effet, afin d’assurer une densité de courant homogène àl’électrode de travail et de minimiser le phénomène de la chute ohmique, de mainteniraussi proche que possible l’électrode de travail et l’électrode auxiliaire [30].III.2. Electrode de référenceLes électrodes de référence utilisées sont des électrodes d’argent / chlorure d’argentAg/AgCl (KCl 3M) de marque BAS (Bioanalytical Systems, USA) ou l’électrode aucalomel saturée de marque METTLER TOLEDO.- 48 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesIII.3. Electrode de travailEn règle générale, l’électrode de travail doit être stable pendant une très grandepériode, doit posséder un bon rapport signal/ bruit du fond et doit être également simple àmanipuler et à conditionner. De plus, les solutés à analyser doivent y développer unecinétique de réaction électrochimique rapide dans un large domaine de potentiel accessible[3]. L’utilisation dans le domaine électroanalytique du carbone comme matériaud’électrode remonte au début des années 1950 [31]. Les premiers travaux furent effectués àl’aide des tiges de graphite ultra pur dont la surface était renouvelée après chaque mesurepar simple frittage de l’extrémité de l’électrode [32]. La non reproductibilité des mesuresainsi que la présence d’importants courants résiduels limite l’utilisation de cette électrode.Plusieurs stratégies ont été déployées afin de minimiser ces phénomènes desurfaces gênants. Cela consiste à réduire la porosité du graphite soit en colmatant les poresà l’aide d’une substance organique inerte [33, 34] soit en réalisant une pâte à base degraphite finement pulvérisé et dispersé au sein d’un liant organique non soluble dans l’eau[35, 36].L’électrode à pâte de carbone (EPC) fut introduite dès 1958 par R. N. Adams [35].Les propriétés de ce type d’électrode dépendent de la pureté des composés utilisés pourpréparer la pâte, de la proportion carbone / agent liant [37], de la taille des particules degraphite, du traitement et de mode de renouvellement de la surface de l’électrode [38].Nous avons choisi l’électrode EPC comme électrode de travail en raison de safacilité de mise en œuvre et de son faible courant résiduel. Un rapport judicieux entre laquantité du graphite et le liant organique assure une bonne stabilité mécanique et unecinétique de transfert électronique maximum. L’électrode à pâte de carbone utilisée estpréparée en mélangeant 1.6g de la poudre de graphite avec 0.4g de l’huile minérale enutilisant un mortier et un pilon. La pâte de carbone préparée est encastrée dans un embouten PVC. Le contact électrique est assuré avec un fil en acier inox.L’empoisonnement des électrodes ainsi que l’évolution constante de la surface aucours du temps constituent des problèmes propres aux électrodes solides qu’il convient de- 49 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalessurmonter afin d’’obtenir une bonne reproductibilité des mesures. Pour cela, plusieurstraitements sont utilisés. Ces traitements dépendent de la nature de l’électrode, du soluté etdes composés contenus dans l’échantillon à analyser : Un nettoyage mécanique, chimique,électrochimique, par renouvellement, par modification ou spontané dans le cas du systèmehydrodynamique.Dans cette étude, la surface de l’électrode à pâte de carbone est renouvelée parextrusion de la pâte puis polie à l’aide d’un papier lisse. Dans le cas du système BIA, lasurface de l’électrode EPC est nettoyée spontanément par simple agitation de la solutionélectrolytique dans laquelle cette électrode est immergée.Dans le cas de l’analyse des ions PO 3- 4 , une électrode au carbone vitreux dediamètre 3 mm (marque BioAnalytical System) est testée. Elle est polie avec la poudred’alumine de granulométrie égale à 0.3µm puis avec celle dont le diamètre des particulesest inférieur à 0.05µm. Cette électrode est par la suite rincée avec de l’eau distillée puistraitée dans un appareil à ultrasons pour une durée de 10 minutes afin d’éliminer les tracesd’alumine et d’impuretés qui restent.III.4. Cellule à microélectrodeLa miniaturisation des électrodes (1 à 25µm) a pu être développée grâce aux récentsprogrès de l’électronique, progrès qui ont permis d’accéder à la mesure de courants aussifaibles que le picoampère (10 -12 A). Ces microélectrodes présentent plusieurs avantages :- mesures en milieu organique (milieu pauvre en électrolyte support) grâce auxfaibles courants engendrés (faible chute ohmique) [39].- rapport signal /bruit optimal.- analyse d’échantillon de l’ordre du dixième de microlitres [40].Au cours de ce travail, nous avons utilisé des microélectrodes en pâte de carbone.La cellule électrochimique correspondante est représentée sur la figure 6.La pâte de carbone a été introduite dans un capillaire en verre de diamètre interneégal à 20µm. Ce capillaire a été étiré en utilisant une étireuse Narishige pp-83 (Japan). Lecontact électrique est assuré avec un fil en tungstène de diamètre égal à 100µm enfoncé- 50 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesdans la pâte de carbone. Le tungstène a été choisi au lieu de l’argent à cause de sa plusforte dureté par rapport au fil d’argent ayant le même diamètre.Le fil en tungstène utilisé pour la connexion électrique (di = 0.1mm) et celuid’argent (di = 0.5mm) sont de marque Goodfellow (cambridge UK). Alors que lescapillaires en verre borosilicatés (di = 0.84mm) sont de marque World PrecisionInstruments Inc. (Berlin, Germany).Figure 6 : Schéma de la cellule à microélectrode à pâte de carbone.L’électrode de référence est aussi réalisée au laboratoire : elle est constituée par unfil d’argent de diamètre égal à 500µm recouvert de chlorure d’argent élaboré par traitementélectrolytique en milieu KCl. L’électrolyse est réalisée en imposant un potentiel constantsitué entre +0.6 et +0.8V. Sa durée varie de 20 à 30 minutes. Une fois le dépôt du chlorured’argent réalisé, le fil est exposé à la lumière UV pendant quelques minutes puis introduitdans un autre tube capillaire. On place enfin la microélectrode et l’électrode de référencedans un tube en acier inoxydable qui lui-même joue le rôle d’électrode auxiliaire. Cette- 51 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesmicroélectrode a été conçue avec une cellule adaptée, permettant des mesures sur desfaibles volumes d’électrolyte (3 mL).III. 5. AppareilsLes voltamètries cycliques de l’ion orthophosphate sont pilotées par un potentiostatAutolab type PGSTAT 10 piloté par un ordinateur. D’autres mesures voltamètriqueseffectuées au cours des analyses des nitrates, nitrites et ammonium sont assurées par unpotentiostat PalmSens piloté par un ordinateur de poche (PC Pocket).Les mesures ampérométriques de l’ion PO 3- 4 sont réalisées à l’aide d’un détecteurélectrochimique BAS LC-3D (Bioanalytical systems, USA) et d’un enregistreur X-Y demarque Yokogawa 3025 (Japan). Quant à la détermination des nitrates, nitrites etammonium, les mesures ampérométriques sont effectuées à l’aide du potentiostat portablePalmSens déjà cité. Sa photographie est donnée sur la figure ci- dessous.Les mesures spectrophotométriques sont effectuées à l’aide du spectrophotomètre UVvisible marque 6100 JENWAY.Figure 7 : Photographie du potentiostat PalmSens et de l’ordinateur de poche.- 52 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesDans le chapitre V consacré à la détermination des ions nitrates, nous utilisons dansla partie électrochimique le dispositif expérimental représenté sur la photographie de lafigure 8. La pompe péristaltique de marque Gilson utilisée est munie de tubes en siliconede diamètre interne égale à 0.6mm.Figure 8 : Photographie du dispositif expérimental utilisé : (1) PC de poche, (2) Colonnechromatographique utilisée comme colonne de réduction (50mm de longueur et 3mm dediamètre intérieur). (3) Potentiostat Palm Sens, (4) Pompe péristaltique (Gilson), (5)Cellule électrochimique- 53 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentalesRéférences[1] D. Bauer, M. Lamache, C. Collin et G. Cote, « Voltampérométrie sur électrodeSolide ». Techniques de l’Ingénieur, 10, 1984, 161.[2] A. J. Bard, et L. B. Faulkner, « Electrochimie : principe, méthodes et applications »Editions Masson, 1983.[3] P. T. Kissinger et W. R. Heinemann, « Laboratory techniques in electroanalyticalChemistry », Marcel Dekker, New York, 1984.[4] C. M. A. Brett, A. M. O. Brett, Electroanalysis, Oxford University Press Inc. NewYork 1998.[5] J. Wang, “Stripping Analysis, principles, Instrumentation and applications”, V. C. HPublishers Inc., New York, 1985.[6] B. D. Epstein, E. Dalle-Molle et J. S. Mattson, Carbon, 9, 1971, 609.[7] P. Bauer, M. Lamache, C. Colin, G. Cote, Techniques de l’ingénieur, P2, 125-15.[8] V. G. Levich, Physicochemical Hydrodynamics, Prentice-Hall, Englewood cliffs, N.J. 1962.[9] H. Matsuda et J. Yamada, J. Electroanal. Chem., 30, 1971, 261.[10] M. B. Glauert, J. Fluid. Mech., 1, 1956, 652.[11] J. Yamada, H. Matsuda, J. Electroanal. Chem. 44, 1973, 189.[12] C. M. A. Brett, A. M. O. Brett et L. C. Mitoseriu, Anal. Chem. 66, 1994, 3145.[13] C. M. A. Brett, A. M. O. Brett et L. C. Mitoseriu, Electroanalysis, 7, n° 3, 1995, 225.[14] J. Wang et Z. Taha, Anal. Chem. 63, 1991, 1053.[15] J. Wang, L. Chen, Analyst, 119, 1994, 1345.[16] M. S. M. Quintino, D. Corbo, M. Bertotti, L. Angnes, Talanta, 58, 2002, 943.[17] Y. I. Tur’yan, E. M. Strochkova, I. Kuselman, A. Shenhar, Fresenius J. Anal. Chem.354, 1996, 410.[18] M. S. M. Quintino, Lùcio Angnes, Electroanalysis, 16, n° 7, 2004, 513.[19] H. Gunashingham, Anal. Chim. Acta, 159, 1984, 139.[20] H. Gunashingham, K. P. Ang, P. Y. Teo, C. B. Tan, B. T. Tay, T. C. Aw, A. C.Thothai, Anal. Chim. Acta, 221, 1989, 205.[21] A. Amine, J.6M. Kauffmann, G. Palleschi, Anal. Chim. Acta, 273, 1993, 213.[22] J. Wang, G. D. Rayson, Z. Taha, Applied Spectroscopy, 46, 1992, 107.[23] J. Wang, L. Angnes, Anal. Lett. 26, 1993, 2329.- 54 -

Chapitre IITechniques et conditions expérimentales[24] C. M. A. Brett, A. M. O. Brett, L. Tugulea, Anal. Chim. Acta 322, 1996, 151.[25] A. De Donato, J. J. Pedrotti, I. G. R. Gutz, Electroanalysis, 11, n° 15, 1999, 1124.[26] C. M. A. Brett, D. A. Fungaro, J. Braz. Chem. Soc. 11, n° 3, 2000, 298.[27] H. Mohammadi, M. El Rhazi, A. Amine, A. M. O. Brett et C. M. A. Brett, Analyst,127, 2002, 1088.[28] J. C. Quintana, L. Idrissi, G. Palleschi, P. Albertano, A. Amine, M. El Rhazi, D.Moscone, Talanta, 63, 2004, 567.[29] L. Idrissi, A. Amine, M. El Rhazi, F. Cherkaoui El Moursli , Anal. Lett. 38, 2005,1943.[30] M. Cardosi, European Chromatography and Analysis, April, 1992, 9.[31] S.S.Lord et L. B. Rogers, Anal. Chem. 26, 1954, 284.[32] V. F. Gaylord, PJ. Elving et A. L. Conrad, Anal. Chem. 25, 1953, 1078.[33] J. B. Morris et J. M. Schempf, Anal. Chem., 31, 1959, 286.[34] P. J. Elving et D. L. Smith, Anal. Chem. 32, 1960, 1849.[35] R. N. Adams, Anal. Chem. 30, 1958, 1576.[36] J. Lindquist, Anal. Chem. 45, 1973, 9.[37] J. Lindquist, J. Electroanal. Chem. 52, 1974, 37.[38] K. Stulik et V. Pacakova, “Electroanlytical measurements in flowing liquids“ EllisHoewood, Chichester, UK, 1987.[39] I. Isildak et A. K. Covington, Electroanal. 5, 1993, 815.[40] Y. Hirata, P. T. Lin, M. Novotny et R. M. Wightman, J. Chromatogr. 181, 1980, 287.- 55 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode de détection desorthophosphates.- 56 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….IntroductionL’étude bibliographique (chapitre I) décrivant le rôle des phosphates dansl’environnement ainsi que les nuisances engendrées par la présence d’un excès de ceséléments, a montré qu’il est très important de développer des méthodes de mesure et decontrôle des teneurs de phosphates dans la nature. Ce domaine connaît actuellement unregain d’intérêt considérable concrétisé par la publication de nombreux travaux [1- 7].L’objet de ce chapitre est de développer une méthode simple, rapide et sélectived’analyse des ions phosphates. Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons le systèmed’analyse par injection directe en milieu Batch (BIA) et l’amperomètrie sur microélectrodeà pâte de carbone.Dans la première partie de ce travail, nous nous intéressons d’abord àl’optimisation de la réduction électrochimique de PO 3- 4 en milieu Batch et ensuite auxanalyses faites par le système BIA dans l’eau de mer. Enfin nous terminons par la mesuredes phosphates dans des biofilms de cyanobactéries à l’aide de la microélectrode à pâte decarbone.Notre choix s’est porté sur des analyses de l’eau de mer et des films decyanobactéries pour les raisons suivantes :- D’une part, le phosphate est un élément essentiel pour le développement duphénomène de l’eutrophisation. En excès, il peut aboutir à une forte mortalitédes organismes benthiques et des poissons. La diminution de la productivité deslagunes semi-fermées et peu profondes s’est manifestée, depuis les années 50ou 60, d’une façon alarmante.- D’une autre part, les cyanobactéries sont des espèces qui habitent également lesroches et la pierre. Elles obscurcissent la couleur originale des roches etcontribuent à leur dégradation. Elles se nourrissent généralement des sourcesinorganiques de phosphore et d’azote. Elles sont par conséquent riches enphosphate.- 57 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Les scientifiques s’intéressent beaucoup à l’étude des cyanobactéries, lichens etautres organismes qui se forment à la surface des murs et toits des monuments historiqueset notamment ceux situés aux sous sol. A ce niveau, les conditions sont très favorables à laprolifération de ces microorganismes qui sont capables de croître dans une gamme detempérature allant de 5 à 35°C. Les plus hautes températures favorisent habituellement undéveloppement plus rapide. Le phosphate est généralement l’élément limitant. Sa présenceest déterminante quant à l’apparition des cyanobactéries. Les conditions favorables à cetteapparition sont toutes présentes au niveau des sites de prélèvement choisis tels que lescatacombes de Rome en plus du taux d’humidité assez élevé et des teneurs suffisantes engaz carbonique (dégagé essentiellement par les visiteurs de ces sites touristiques).I. Matériels et procéduresI.1. Réactifs et échantillonsLe molybdate d’ammonium, le méta-silicate de sodium, le dihydrogénophosphatede sodium et l’acide nitrique sont tous de qualité pour analyse. Les solutions sont préparéesavec de l’eau bidistillée.Les échantillons de l’eau de mer ont été prélevés sur la côte de la ville deMohammedia au Maroc. Ceux de cyanobactéries ont été collectés dans deux hypogéesromains : St. domitille et St. Callistus de la ville de Rome en Italie.La verrerie est lavée avec l’acide chlorhydrique 20% puis rincée avec de l’eaudistillée. Toutes les expériences sont réalisées à température ambiante (23 ±1°C). Chaquemesure est répétée trois fois, la moyenne est calculée et présentée.I.2. ProcéduresI.2.1. Electrode à pâte de carboneAfin d’avoir une électrode à pâte de carbone traitée est préparée à partir de lapoudre de graphite qui est lavée avec l’acétone, rincée à l’eau puis traitée avec le mélangeeau régale (acide nitrique/ acide chlorhydrique) (1/ 3, V/ V) pendant 30 minutes. Legraphite est par la suite lavé à l’eau distillée jusqu’au pH neutre puis séché à 400°C- 58 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….pendant 4 heures [8]. La macroélectrode et la microélectrode à pâte de carbone sontpréparées comme c’est déjà décrit dans le chapitre précédent.I.2.2. Mesures en milieu batchCes mesures ont été réalisées dans une cellule de capacité 10ml. Quelquesmicrolitres de solutions de phosphate de concentrations égales à 10 -2 ou 10 -3 mol/L sontinjectés dans la cellule contenant le molybdate d’ammonium et l’acide nitrique commeélectrolyte support. Les concentrations finales obtenues varient de 1 à 100µmol/L enphosphate. Après chaque injection, un signal ampérométrique est enregistré.Dans le cas des mesures en milieu batch avec la microélectrode, le volume de lacellule utilisée est de 3mL.I.2.3. Analyse en BIAPour les mesures en BIA, la cellule est remplie d’acide nitrique 0.2mol/L qui jouele rôle d’électrolyte support. Le schéma de la cellule adoptée est donné sur la figure 4 dansle chapitre précédant. Les injections sont effectuées à l’aide d’une micropipetteélectronique programmable de marque Eppendorf permettant des injections dans la gamme5 à 100µL. La réponse est représentée sous forme de pic de courant.I.2.4. Analyse de l’eau de merLes échantillons de l’eau de mer sont filtrés sur une membrane filtrante dont lediamètre des pores est égal à 0.45µm. Ils sont par la suite analysés par la méthoded’analyse par injection directe en milieu batch BIA - Ampérométrie puis par la méthodespectrophotométrique standard. Cette dernière est basée sur la réduction de l’acidephosphomolybdique par l’acide ascorbique pour former un complexe très coloré [9].I.2.5. Analyse des échantillons de biofilms de cyanobactériesLes échantillons de cyanobactéries séchés sont homogénéisés à l’aide d’un mortier.A 100mg de chaque échantillon mis dans un flacon, on rajoute 3mL de la solution- 59 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….contenant HNO 3 0.2mol/L et KCl 0.1mol/L. Le mélange est par la suite mis sous agitationpendant une minute en utilisant un vortex puis centrifugé pendant 10 minutes à une vitesseégale à 10.000 rpm. Un volume de 60µL du liquide surnageant est ajouté à 3mL d’unesolution contenant l’acide nitrique0.2mol/L, le Chlorure de potassium 0.1mol/L et lemolybdate d’ammonium à la concentration 1mol/L. D’autres aliquotes du surnageant devolume égal à 100µL sont analysés avec la méthode spectrophotométrique standard [9].I.2.6. Méthode des ajouts dosésLa matrice représente l’ensemble des constituants composant l’échantillon quicontient le soluté. L’effet de matrice est lié à une différence de nature chimique entre leséchantillons et la solution contenant les étalons utilisés.Pour s’affranchir d’éventuels effets de matrice, des méthodes d’étalonnagepermettent de déterminer le plus précisément possible la relation entre la réponse del’appareil de mesure et la quantité de soluté introduite dans celui-ci. Parmi ces méthodes, laméthode des ajouts dosés qui consiste à faire des réplicas de l’échantillon à analyser, enajoutant à chacun d’eux des volumes croissants de l’élément à doser. On obtient ainsi unegamme de calibration croissante de même matrice et à volume final constant.L’analyse des échantillons, celui pour qui aucun ajout n’a été effectué et ceux avecles ajouts croissants, permet d’établir une droite d’étalonnage. L’intersection de cette droiteavec l’axe des abscisses détermine l’origine de cet axe et par conséquent la concentrationde l’élément dans l’échantillon. Théoriquement, une meilleure précision est obtenue avecl’ajout correspondant à la valeur attendue de la concentration de l’élément analysé.I.2.7. Calcul du taux de recouvrementLe taux de recouvrement ou pourcentage de récupération permet d’identifier, pourun échantillon donné ou un type de matrice donnée et à un niveau de concentration donné,la présence d’interférence potentielle lors du processus d’analyse.- 60 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Le taux de récupération correspond à la différence en pourcentage entre laconcentration mesurée d'un échantillon fortifié et la concentration mesurée du mêmeéchantillon non fortifié divisée par la concentration de la substance ajoutée. Ce rapporttient compte de transformation chimique qui s’est produite, s’il y a lieu. Ce taux est doncexprimé comme suit :Avec C f concentration mesurée de l’échantillon fortifiéC : concentration mesurée de l’échantillon non fortifiéC a : concentration de la substance ajoutée.II. Résultats et discussionII.1. Analyse en milieu BatchII.1.1. Choix de l’électrode et du potentiel imposé.La figure 1 montre les voltamogrammes cycliques sur l’électrode de carbone vitreux(A) et sur l’électrode à pâte de carbone (B) du molybdate 2mmol/L en absence et enprésence du phosphate l mmol/L en milieu acide nitrique 0.2mol/L.En absence du phosphate, nous obtenons des courants faibles. Après l’ajout du phosphate,nous observons un pic intense pour les deux électrodes testées. La meilleure réponse enterme de forme du voltamogrammes ainsi qu’un faible courant résiduel sont obtenus enutilisant l’électrode à pâte de carbone. Cette électrode est choisie pour le reste du travail.Deux pics de réduction apparaissent lors du tracé : un pic situé à +0.32V/ ECS defaible intensité et un deuxième situé à +0.17V/ ECS. Ce dernier est intense et bien défini.Dans le but de choisir le potentiel à appliquer pour la détermination ampérométrique duphosphate, nous représentons sur la figure 2, la courbe hydroampérométrique du complexephosphomolybdique sur l’électrode à pâte de carbone dans la gamme du potentiel +0.5 –+0.1V/ Ag/AgCl. Même si l’intervalle +0.1 à +0.2V présente un courant plus intense, ungrand bruit et une dérive de la ligne de base sont aussi observés lors de la réduction du- 61 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….molybdate en appliquant ces potentiels. Ce courant instable et difficile à reproduire est dûaux phénomènes d’adsorption à la surface de l’électrode indicatrice [2].Nous retenons donc pour le reste du travail le potentiel +0.3V / Ag/AgCl correspondant aupremier pic.40200I / µA cm -2-20-40-60A0,1 0,2 0,3 0,4 0,5E / V20100I / µA cm -2-10-20-30B0,1 0,2 0,3 0,4 0,5E / VFigure I : Variation de la densité de courant en fonction du potentiel de : (---)2mmol/L de molybdate et de (⎯) 2mmol/L de molybdate et 1mmol/l de phosphate dansHNO 3 0.2 mol/L, sur deux électrodes différentes: (A) l’électrode de carbone vitreux et (B)l’électrode à pâte de carbone.- 62 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Figure 2 : Voltamogramme hydrodynamique enregistré à l’électrode à pâte de carboned’une solution contenant : l’acide nitrique 0.2mol/L, le molybdate d’ammonium0.5mmol/L et 0.1mmol/L de phosphate, l’électrode de référence est une électrode Ag/AgCl.II.1.2. Effet du pHLes tracés chronoampérométriques (i – t) du complexe phosphomolybdique forméau potentiel +0.3V/ Ag/AgCl montrent que la réponse de l’électrode EPC ne changepratiquement pas pour des différentes concentrations d’acide situées entre 0.1 et 0.4mol/L.Elle est de 0.43µA pour une concentration en phosphate égale à 0.1mmol/L en présencedu molybdate 1mmol/L. Une réponse similaire est observée même si on change la naturede l’acide (HCl, H 2 SO 4 ou HNO 3 ). Pour des raisons de disponibilité, nous avons opté pourl’utilisation de l’acide nitrique 0.2mol/L, ce qui correspond à un pH égal à 0.7, pour lereste du travail.- 63 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….II.1.3. Etude de substances interférentesDiverses techniques analytiques ont été utilisées pour déterminer les phosphates. Laplupart de celles-ci présentent le problème d’interférence avec le silicate [6, 10- 12]. Eneffet, le silicate forme des complexes de couleur bleue avec le molybdate.Zhang et coll. [12] ont montré que cette interférence peut être minimisée enchoisissant un rapport [H + ] / [molybdate] approprié. Par conséquent, en fixant laconcentration de l’acide nitrique à 0.2mol/L, on fait varier la concentration du molybdatede 0.5 à 10mmol/L et on enregistre les réponses en courant pour des solutions contenantsoit 0.1mmol/L en phosphate soit 0.1mmol/L en silicate. Les mesures sont effectuéesséparément pour chacun des deux ions à un potentiel appliqué de +0.3V/ Ag/AgCl (figure3A et 3B)La figure 3A montre la réponse en courant du phosphate 0.1mmol/L à différentesconcentrations du molybdate. La meilleure réponse est obtenue pour une concentration enmolybdate égale à 2mmol/L. Cette figure montre aussi que pour des faibles concentrationsen phosphates (1- 20µmol/L), une variation de la concentration du molybdate dansl’intervalle 0.5 à 2mmol/L n’a pas d’influence sur la réponse ampérométrique. Parconséquent, pour des faibles concentrations en phosphates, un taux de molybdate égal à0.5mmol/L est suffisant pour la complexation de la totalité des phosphates dans l’intervalle1 à 20µmol/L. Nous avons aussi observé que le courant résiduel et le bruit sont très faibleslorsque la concentration de molybdate est située dans la gamme 0.5 – 1mmol/L. Parconséquent, la concentration en molybdate que nous utiliserons par la suite ne dépasse pas1mmol/L.La courbe représentée sur la figure 3B montre qu’une teneur en silicate égale à0.1mmol/L n’est mesurable que si la quantité du molybdate mis en solution dépasse2mmol/L.- 64 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….ABFigure 3 : Variation du courant de réduction des phosphates à la concentration0.1mmol/L et 0.02mmol/L en (A) et des silicates 0.1mmol/L en (B) en fonction de laconcentration du molybdate en solution. [HNO 3 ] 0.2mol/L.E imposé = +0.3V/Ag/AgCl.- 65 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Figure 4 : Voltamogramme cyclique à l’électrode à pâte de carbone ; l’électrolyte supportest celui utilisé dans la figure 2. (a) silicate 0.1mmol/L ; (b) phosphate 0.06mmol/L et (c)phosphate 0.1mmol/L. Vitesse de balayage 50mV/s.La courbe voltamétrique présentée à la figure 4 confirme la bonne sélectivité de laméthode dans les conditions décrites précédemment. Dans l’intervalle de potentiel étudié(+0.5 à +0.1V), on observe qu’il n’y a pas de réponse de silicate. Cependant, en présencedes phosphates, on observe deux pics bien définis en concordance avec la figure 1.II.1.4. Courbe de calibrationNous avons enregistré pour six valeurs de concentrations en phosphate allant de 0 à100µmol/L, la courbe représentant au potentiel fixe (+0.3V/Ag/AgCL) le courant de- 66 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….réduction sur électrode à pâte de carbone du complexe phosphomolybdique en fonction dela concentration du phosphate. La teneur en molybdate est de 0.5mmol/L, celle de l’acidenitrique est de 0.2mol/L. La réponse des phosphates est linéaire dans l’intervalle 1 –20µmol/L. La déviation relative standard des pentes de six électrodes est de l’ordre de 6%avec un coefficient de détermination égal à 0.999. La limite de détection calculée,correspondant à un rapport signal /bruit (S/N) égal à 3, est de 0.3µmol/L de phosphate.II.1.5. Effet du solvant organiqueUn ensemble de travaux a montré l’influence de la présence d’un solvant organiqueen solution électrolytique sur la réponse du phosphate [2, 3, 6, 7]. Il a été démontré quel’utilisation d’un mélange eau/ solvant organique permet d’améliorer la réponse en courant.Dans notre cas, en utilisant le mélange eau / méthanol (70/ 30 en volume) comme solvant,nous représentons sur la figure 5 les réponses ampérométriques pour différentesconcentrations de PO 3- 4 .0.60.5Courant / µA0.40.30.20.10.00 20 40 60 80 100[Phosphate] µMFigure 5 : Courant de réduction en fonction de la concentration du phosphate. L’électrolytesupport est celui utilisé dans la figure 2 ; potentiel imposé +0.3V par rapport à Ag/AgCl.(?) : avec 30% méthanol, (♦) sans méthanol.- 67 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Nous n’observons un effet sur le courant de réduction que pour les concentrationsen phosphates supérieures ou égales à 20µmol/L. Ces teneurs en phosphate sont suffisantesdu fait que les concentrations attendues dans les échantillons réels sont assez faibles. Ainsi,nous n’avons pas besoin d’utiliser de solvant organique au cours de cette étude, ce qui rendla méthode proposée plus simple.II.1.6. Effet du selNous avons étudié l’effet de la présence de NaCl 0.6mol/L (valeur approximativede la teneur en sel de l’eau de mer) dans l’électrolyte support sur l’analyse des ionsorthophosphates.0.350.30sans NaClNaCl 35g/l0.250.20I / µA0.150.100.050.000 20 40 60 80 100(Phosphate) / µMFigure 6 : Courant de réduction en fonction de la concentration du phosphate en milieubatch. Electrolyte: acide nitrique 0.2 mol /L + molybdate 0.5 mmol/L.La pente de la courbe de calibration diminue de 22% en présence de NaCl 0.6mol/L. Pourrésoudre ce problème, la méthode des ajouts dosés a été adoptée pour l’analyse deséchantillons réels- 68 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….II. 2. Système d’analyse par injection directe en milieu batch « BIA »II. 2.1. Détermination des performances analytiquesNous avons observé en cours des mesures effectuées en milieu batch, que si onrefait la mesure plusieurs fois, le signal de réduction du molybdate ou duphosphomolybdate devient instable. En effet, les fluctuations du signal augmententconsidérablement à partir de 20 à 30 minutes de contact entre l’électrode EPC et lasolution de molybdate ou de phosphomolybdate. La sensibilité diminue de 20% après sixmesures si on ne nettoie pas la surface de l’électrode indicatrice. Il est donc impossibled’effectuer d’autres mesures sans renouveler cette surface ou la nettoyer en l’émergeantpendant 5 minutes dans une solution d’hydroxyde de sodium 1mol/L en agitation afind’éliminer le complexe phosphomolybdique adsorbé.Dans le but de trouver une technique plus pratique et plus reproductible, nous avonsadopté la méthode d’analyse par injection directe en milieu batch (BIA). En utilisant cesystème BIA, les solutions du molybdate et de phosphomolybdate sont préparées àl’extérieur de la cellule puis injectées, à l’aide d’une micropipette, directement sur lasurface de l’électrode immergée dans une solution d’acide nitrique 0.2 mol/L en agitation.Une réponse ampérométrique transitoire est enregistrée parce que le contact entre lasolution à analyser et l’électrode est de quelques secondes. Tout phénomène de salissure oud’adsorption à la surface de l’électrode est par conséquent éliminé.Pour préparer les solutions de phosphates à analyser (standards ou échantillons),nous les avons diluées deux fois avec une solution contenant l’acide nitrique 0.4 mol/L etle molybdate à la concentration 2mmol/L.Pour vérifier par la suite que les silicates n’interférent pas dans la mesure desphosphates, nous avons injecté, dans la cellule BIA, une solution contenant l’acidemolybdique 1mmol/L et le silicate 0.1mmol/L immédiatement après leur mélange : il n’yavait pas de réponse indiquant la formation du complexe silicomolybdique. Cependant, sile mélange silicate/ molybdate est laissé reposé plus que 5 minutes, la réponse des silicates- 69 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….apparaît pour montrer que la cinétique de formation du complexe silicomolybdique estlente. Cette observation est en accord avec les travaux de Hodgan et Pletcher [13].L’interférence des silicates est parfaitement éliminée en ajoutant l’oxalate 0.25%aux mélanges molybdate/ acide nitrique avant l’ajout des silicates et phosphates. Cesrésultats rejoignent le travail publié dans la littérature par Galhardo et Masini [14].Dans ces conditions, la linéarité de la méthode s’étend de 1 à 20µmol/L (31 –620µgP/L) en phosphate, l’équation de régression est la suivante :I = 3.70 + 4.43CAvec I est le courant en nA et C est la concentration des phosphates en µmol/L. Lecoefficient de corrélation est égal à 0.998 avec une déviation relative standard de six pentesde courbes de calibration égale à 4%. La limite de détection correspondant à un rapportsignal/ bruit S/N égal à 3 est de 1µmol/L.La figure 7 montre un exemple de tracés BIA représentant des courants detransition successifs obtenus suite à des injections de concentrations croissantes dephosphates. Le potentiel imposé est de 0.3V / Ag/AgCl. Le temps de réponse est de 42secondes correspondant à une vitesse d’injection égale à 85 échantillons par heure.- 70 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….d0.02µAa1minbcFigure 7 : Exemple de pics enregistrés en utilisant le système BIA couplé àl’ampérométrie. Potentiel imposé +0.3V / Ag/AgCl. Injections successives de solutionscontenant HNO 3 0.2 mol/L, molybdate d’ammonium 1mmol/L et (a) 0µmol/L ; (b)5µmol/L; (c) 10µmol/L et (d) 20µmol/L en phosphate. Le volume injecté est de 70µL.II.2.2. Application : Analyse de l’ion PO 4 3- dans l’eau de merUn milieu complexe tel que l’eau de mer est choisi pour tester la fiabilité de latechnique élaborée. Le calcul du taux de recouvrement a été effectué pour des échantillonsd’eau de mer ne contenant pas de phosphate. Des quantités bien définies ont été ajoutées.Les résultats (tableau 1) montrent que le taux de recouvrement varie entre 70 et74%. Ces faibles valeurs s’expliquent par la présence de grandes concentrations de selsdans l’eau de mer. En effet, nous avons étudié l’effet de la présence de NaCl 0.6 mol/Ldans l’électrolyte support (figure 6).- 71 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Tableau 1: Taux de recouvrement du phosphate ajouté dans l’eau de merEchantillon n°Phosphate ajoutéPhosphate trouvéRecouvrementen µmol L -1en µmol L -1%15.03.570210.07.272312.59.274415.011.073Dans les conditions citées précédemment, huit échantillons sont analysés (tableau2). Les résultats sont comparés avec la méthode spectrophotométrique standard [9].Tableau 2 : Comparaison des méthodes spectrophotométrique et ampérométrique pour ladétermination du phosphate dans les échantillons de l’eau de mer.Concentration du phosphate (mg /L)Echantillon n°Ampérométrie - BIASpectrophotométrieErreur relative(A)(B)(A-B)/B x 10010.150.1315.420.130.128.330.07--40.05--50.120.16-24.160.250.26-3.870.290.31-6.480.360.38-5.3- 72 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Nous avons constaté d’après ce tableau que pour les échantillons contenant desconcentrations en phosphate supérieures à 0.2mg/L, les deux méthodes montrent desrésultats comparables avec une erreur relative comprise entre 4 et 6%. Cependant, pour leséchantillons dont les concentrations sont inférieures à 0.2mg/L, l’erreur relative augmenteet peut atteindre 24% : La méthode spectrophotométrique n’est pas assez sensible danscette zone de concentrations. Il faut noter ici que la gamme de linéarité de cette méthodes’étend de 0.12 à 1.2mg/L en phosphate pour une longueur d’onde de 880 nm et un trajetoptique de 1cm. On peut en déduire que la méthode spectrophotométrique n’est pas autantsensible que la méthode électrochimique couplée au système BIA.II. 3. Analyse des phosphates en milieu batch à l’aide de la microélectrode à pâte decarboneII.3.1. Performances analytiquesNous avons entrepris la même étude faite en milieu batch avec une microélectrodeà pâte de carbone. Les mêmes paramètres optimisés lors de l’usage de la macroélectrode(+0.3V, 1mmol/L de molybdate, 0.2 mol/L d’acide nitrique) sont utilisés. Lamicroélectrode donne des réponses en densité de courant nettement supérieures à cellestrouvées sur l’électrode EPC décrite précédemment.Dans ces conditions, l’intensité des courants de réduction augmente uniformémentavec la concentration des phosphates en solution. La courbe de calibration, répétée 4 foisest linéaire sur une plage allant de 0.5 à 20µmol/L avec un RSD (déviation relativestandard) égal à 4%.La limite de détection (pour un rapport S/N = 3) est de 0.5µmol/L en phosphate.L’équation de la courbe de calibration est donnée par la formule:I= 0.09 + 0.1C R 2 = 0.990Avec I est le courant en nA, C la concentration en µmol/L de phosphate et R 2 est lecoefficient de détermination.Après une période de 35 secondes, le courant de réduction mesuré atteint son étatstationnaire.- 73 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….II.3.2. Application : Analyse des phosphates dans des biofilms de cyanobactéries.La méthode proposée est appliquée à l’analyse de différents échantillons debiofilms de cyanobactéries prélevés dans des catacombes à Rome. Dans le but d’étudierl’effet de la matrice sur la détermination des phosphates, les taux de recouvrement de 5échantillons ont été calculés (tableau 3). Des quantités de l’orthophosphate variant de 0.2 à1.0µmol/L sont ajoutées à 1ml de surnageant des cyanobactéries centrifugées. Le taux derecouvrement varie de 88 à 117% avec une moyenne de 99± 7%. De la même manière,nous avons déterminé les taux de recouvrement pour la méthode spectrophotométrique. Ilsvarient de 90 à 107% avec une moyenne de 96 ±6%.La figure 8 représente une comparaison entre les résultats des analyses desphosphates dans les biofilms de cyanobactéries effectuées par les deux méthodes :spectrophotométrique standard et ampérométrique sur microélectrode à pâte de carbone.Les concentrations de phosphate trouvées dans dix échantillons sont situées entre 57 et362µg de phosphate / gramme de cyanobactéries séchées.La pente est de 1.03, l’ordonné à l’origine est égal à -0.51µg/g avec R 2 = 0.984 et n = 10.Nous constatons que la pente n’est pas loin de 1 et l’ordonné à l’origine est proche de 0. Lecoefficient de corrélation indique une bonne association entre les deux méthodes.Figure 8: Comparaison entre la méthode spectrophotométrique standard et la méthodeproposée.- 74 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Table 3: Taux de recouvrement du phosphate ajouté dans les échantillons de biofilms decyanobactériesEchantillons Phosphate ajouté(µmol/L)Phosphate trouvé(µmol/L)Recouvrement(%)*CD12e 0 0.094 -0.2 0.294 1000.4 0.476 960.6 0.652 930.8 0.913 1021.0 1.155 106*CD13d 0 0.553 -0.2 0.767 1070.4 0.960 1020.6 1.126 960.8 1.352 1021.0 1.629 108°CSC13a 0 0.267 -0.2 0.495 1140.4 0.647 960.6 0.840 960.8 1.004 921.0 1.169 90°CSC16c 0 0.082 -0.2 0.317 1170.4 0.508 1060.6 0.641 930.8 0.810 911.0 0.958 88°CSC16e 0 0.067 -0.2 0.260 970.4 0.467 1000.6 0.640 970.8 0.849 981.0 1.059 99Hypogées romains: *St. Domitille et ° St.Callistus (Rome, Italie)- 75 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….III. ConclusionBasée sur une mesure de courant, la méthode développée offre un certain nombred’avantages tels qu’une utilisation simple, rapide, relativement peu onéreuse avec lapossibilité d’effectuer des mesures dans des faibles volumes et également en milieutroubles. Le système envisagé peut être portable offrant ainsi la possibilité d’effectuer desmesures sur le terrain.Les travaux présentés dans ce chapitre ont montré qu’il est possible d’analyser lesorthophosphates avec des limites de détection très faibles en utilisant l’ampérométriecouplé au système BIA. L’utilisation de cette approche offre des avantages attrayants.Outre la réduction des volumes d’essais, le temps d’analyse est encore réduit et leprotocole expérimental est simplifié.Dans la seconde partie de ce chapitre portant principalement sur la réalisation de la celluleà microélectrode, la réduction du courant capacitif autorisé par la diminution de la surfacede l’électrode indicatrice a également favorisé l’augmentation du rapport signal / bruit,donc de la sensibilité.La méthode développée a également montré une grande sélectivité. Elle présentel’avantage d’être appliquée dans des milieux complexes tels que l’eau de mer et dans deséchantillons de biofilms de cyanobactéries.- 76 -

Chapitre IIIDéveloppement d’une nouvelle méthode dedétection des orthophosphates…. …….Références[1] R. L. Benson, L. D. Mckelvie, B. T. Hart, Y. B. Truong, I. C. Hamilton, Anal. Chim.Acta 326, 1996, 29.[2] S. M. Harden, W. K. Monidez, Anal. Chem. 56, 1984, 2218.[3] A. G. Fogg, N. K. Bsebsu, Analyst, 107, 1982, 566.[4] L. Guangham, W. Xiaogang, L. Yanhu, Y. Shenlai, Talanta 49, 1999, 511.[5] N. G. Carpenter, A. W. E. Hodson, D. Pletcher, Electroanalysis 9, 1997, 1311.[6] K. Matsunaga, I. Kudo, M. Yanada, K. Hasebe, Anal. Chim. Acta 185, 1986, 355.[7] A. G. Fogg, N. K. Bsebsu Analyst 106, 1981, 1288.[8] D. Moccone, D. D’Ottavi, D. Compagnone, D. Palleschi, A. Amine Anal. Chem. 73,2002, 2529.[9] Standards Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed., 1998(APHA), pp. 4- 139.[10] Determination of Orthophosphate in Estuarine and Coastal Waters by AutomatedColorimetric Analysis. US-EPA, Method 365.5, September 1997, p. 1-9.[11] A. G. Fogg, G. C. Cripps, B. J. Birch, Analyst 108, 1983, 1485.[12] J. Z. Zhang, C. J. Fischer, P. B. Ortner, Talanta, 49, 1999, 293.[13] A. W. E. Hodgson, D. Pletcher, Electroanalysis 10, 1988, 321.[14] C. X. Galhardo, J. C. Masini, Anal. Chim. Acta 417, 2000, 191.- 77 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite basée sur saréaction avec le 2,3-diaminonaphthalène- 78 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …IntroductionLes nitrites sont instables au plan biochimique. Entre le remplissage des flacons etl’analyse au laboratoire, il faut compter une importante dégradation biologique durant letransport. En présence de fortes concentrations en ammonium dans l’échantillon, desnitrites peuvent également apparaître par nitrification. C’est la raison pour laquelle leséchantillons devraient être réfrigérés (

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …L’objectif de notre étude est de développer une méthode simple, rapide et sélectivede détermination des nitrites dans les eaux naturelles et contaminées.Dans ce travail, nous avons exploité l’activité électrochimique du 2,3-diaminonaphthalène (DAN) en milieu acide. Le nitrite réagit avec ce monomère pourformer le 1-N-naphthotriazole (NTA) qui n’est pas électroactif (figure 1). La diminution del’intensité de courant de DAN est par conséquent proportionnelle à la concentration ennitrite. Cette réaction chimique qui se produit entre le nitrite et le DAN est la base de laméthode fluorimétrique de détermination du nitrite déjà publiée dans la littérature [5, 6, 7]Dans la première partie de ce travail, la voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV) estutilisée pour mesurer le courant d’oxydation du DAN avant et après sa réaction avec lenitrite.La méthode BIA est introduite par la suite pour simplifier le protocoleexpérimental et réduire le temps de l’analyse de la méthode proposée. Enfin, la techniquedéveloppée est appliquée à la détermination du nitrite dans des échantillons réels.NH 2NNaNO 2 NH 2 SO 4NH 2 NH2,3-diaminonaphthalène (DAN)1(H)-naphthotriazole (NTA)Figure 1 : Réaction chimique entre le DAN et le nitrite en milieu acideI. Techniques et méthodes expérimentalesI.1. Réactifs et échantillonsLe 2,3-diaminonaphthalène (sigma, Aldrich) est préparé à une concentration de120µmol/L. Une solution de concentration égale à 20µmol/L du DAN est aussi obtenue endiluant la première solution. Une solution mère de nitrite de sodium 10 -2 mol/L est utilisée- 80 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …pour préparer les standards de nitrite. L’acide sulfurique et l’acétonitrile (2%) sont utiliséspour solubiliser le DAN. L’EDTA 10 -2 mol/L est préparée et joue le rôle d’agent masquantles interférences. Ces réactifs sont tous de qualité pour analyse. Les échantillons des eauxusées, d’eau de puit sont collectés dans la région de Mohammedia.I.2. ProcédureI.2.1. Mesures électrochimiques pour quantification :La voltamétrie cyclique est effectuée pour des solutions de 0.1mmol/L du DANdans l’acide sulfurique 0.04mol/L. Le balayage de potentiel se fait entre +0.4V et +1.0V(par rapport à Ag/AgCl) dans le sens anodique à une vitesse égale à 50mV/s.D’autres mesures quantitatives sont effectuées en mode DPV (voltamétrie impulsionnelledifférentielle). Le potentiel de départ est +0.4V, celui d’arrivée est de +1.0V. L’amplitudede l’impulsion est de 100mV. La vitesse de balayage est de 13mV/s et la hauteur de lamarche de potentiel est égale à 10mV.Les mesures ampérométriques sont réalisées en mode BIA en utilisant uneélectrode à pâte de carbone. Le potentiel est fixé à +0.7V /Ag/AgCl et la réponse estpilotée par le potentiostat PalmSens.I.2.2. Analyse des standards des nitritesToutes les expériences sont réalisées à la température ambiante (23±1°C). Chaquemesure est répétée au moins 5 fois et la moyenne est présentée. La courbe de calibrationest tracée chaque jour pour des solutions de nitrite de sodium allant de 0.1 à 10µmol/L. Laméthode proposée est basée sur la réaction du DAN avec le nitrite en milieu acide pourformer le 1-H-naphthotriazole. L’analyse du nitrite est réalisée en deux étapes :Au cours de la première étape, le DAN acidifiée (120µmol/L ou 20µmol/L dansl’acide sulfurique 0.4mol/L) est diluée 10 fois avec de l’eau bidistillée et le courantd’oxydation est mesuré par la voltamétrie différentielle impulsionnelle DPV ou la méthodeBIA couplé à l’ampéromètrie. Le courant résultant est désigné par I 1 .- 81 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …Dans une deuxième étape, un volume de 500µL du DAN fraîchement préparé, à lamême concentration déjà citée, est ajouté à 4.5ml de l’échantillon ou du standard, on agiteimmédiatement le mélange et on le laisse reposer. Après une période d’incubation àtempérature ambiante, la quantité du DAN qui n’a pas réagi est mesurée. Le courantd’oxydation résultant est noté I 2 . Ce courant est plus faible que I 1 suite à la consommationdu DAN.Le pourcentage de diminution peut être calculé à partir du courant d’oxydation deDAN en absence et en présence du nitrite :I 1 – I 2I (%) = x 100I 1I.2.3. Analyse des échantillons réelsAprès leur collection, les échantillons sont filtrés par une membrane de porositéégale à 0.45µm puis mesuré le même jour par la méthode proposée et par la méthodespectrophotométrique de référence [8].II. Résultats et discussionLa détermination électronique du nitrite en présence du DAN nécessite les étapessuivantes :- La mesure de la réponse du DAN en milieu acide en absence du nitrite par la DPVou par la BIA- ampérométrie.- L’incubation des solutions contenant le nitrite et le DAN pendant un intervalle detemps appropriée.- La mesure de la réponse en courant du DAN qui n’a pas réagi.II.1. Comportement électrochimique du DANDes voltamogrammes cycliques (figure 2) sur électrode à pâte de carbone ont ététracés en présence du composé DAN seul à la concentration 0.1mmol/L puis en présence- 82 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …du nitrite à la même concentration. Un pic anodique irréversible du à l’oxydation du DANest apparu lors du premier tracé, ce qui est en concordance avec les travaux présentés parquelques auteurs portant sur l’oxydation du DAN sur des électrodes solides [9, 10]. Lafigure 2 montre que le pic d’oxydation du DAN est obtenu aux environs de+0.7V/Ag/AgCl. Le signal du nitrite est observé à +1.0V/Ag/AgCl indiquant que le nitritepeut être détecté directement en absence du DAN. Malheureusement, ce potentiel élevécause l’oxydation directe de certains interférents.1312111098current / µA76543122103-10,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1E / V (vs. Ag/AgCl)Figure 2: Voltamétrie cyclique du : (1) DAN 0.1mmol/L, (2) nitrite 0.1mmol/L et (3)acide sulfurique 0.04mol/L. Vitesse de balayage 0.05V/s, électrolyte : acide sulfurique0.04mol/L.Par la suite, nous avons enregistré la courbe représentant le logarithme décimal ducourant faradique en fonction du logarithme de la vitesse de balayage tout en suivant lesvoltamogrammes cycliques à l’électrode EPC du DAN 0.1mmol/L en milieu acide pH 1.1.Sachant que, dans le cas d’un régime contrôlé par la diffusion, l’expression du courant depic i p en ampères s’écrit :i p = (2.69 x 10 5 ) n 3/2 A D 0 1/2 v 1/2 C 0- 83 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …avec A : aire de l’électrode en cm 2 , D 0 est le coefficient de diffusion en cm 2 /s, C 0 est laconcentration de l’élément à doser en mol/cm 3 et v est la vitesse de balayage exprimée enV/s.La courbe représentée est linéaire dans l’intervalle de vitesse allant de 20 à400mV/s. La pente est de 0.5 indiquant que le processus est diffusionnel.La voltamétrie impulsionnelle différentielle est une technique très sensible, elle estdonc choisie pour étudier l’influence du nitrite sur le signal du DAN. La figure 3 montreles voltamogrammes du DAN enregistrés en milieu acide. Les pics d’oxydation dumonomère diminuent au fur et à mesure que les concentrations de l’ion nitrite augmentent.1,21Current (µA)1,00,80,60,42340,20,00,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9E (V/ AgAgCl)Figure 3 : Voltamogrammes de 12µmol/L du monomère DAN en absence du nitrite (1) eten présence du nitrite aux concentrations 2µmol/L (2), 4µmol/L (3) et 6µmol/L (4),électrolyte support : acide sulfurique 0.04mol/L, conditions de la technique DPV: vitessede balayage 0.013V/s, hauteur du pas de potentiel =10mV, amplitude de l’impulsion ? E =100mV.La courbe de calibration du DAN dans l’intervalle 0.5 – 20µmol/L est linéaire.L’équation de régression est la suivante : Ip (µA) = -0.02 + 0.14C (µmol/l) avec un- 84 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …coefficient de régression égal à 0.999. La limite de détection est de 0.1µmol/L dans lesconditions de la technique DPV décrites précédemment.Nous avons choisi cet intervalle de concentration parce qu’à des concentrationsélevées du monomère, l’électropolymérisation se produit [10]. Il faut noter que la surfacede l’électrode à pâte de carbone est renouvelée après chaque mesure pour éviter lesproblèmes d’adsorption.II.2. Optimisation des paramètres de la réaction chimique :Pour déterminer le temps nécessaire pour que la réaction soit complète, unesolution de nitrite 6µmol/L est incubée avec le DAN à la concentration 12µmol/L dansl’acide sulfurique 0.04 mol/L. Le pourcentage de diminution du signal du DAN est calculépour des périodes d’incubation variables. Les résultats représentés sur la figure 4 montrentque la réaction nécessite 30 minutes pour donner le plus grand pourcentage de diminution.Par conséquent, une période de 30 minutes est retenue pour la suite du travail.% de diminution du signal du DAN504030201000 20 40 60 80 100 120temps en minutesFigure 4: Effet du la période d’incubation sur le pourcentage de diminution du signal duDAN. Electrolyte acide sulfurique 0.04mol/L; concentration initiale du DAN : 12µmol/L ;concentration initiale du nitrite est 6µmol/L.- 85 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …L’effet du pH du milieu est aussi étudié. Une solution contenant 6µmol/L de nitriteest incubée avec 12µmol/L de DAN pendant 30 minutes. Les valeurs de pH varient de 0.8à 1.8. Nous avons montré (figure 5) que cette réaction chimique se produit effectivementdans un milieu acide (pH < 2) comme c’est reporté dans la littérature [6, 7]. La meilleureréponse est observée à un pH égal à 1.1 qui correspond à 0.04 mol/L d’acide sulfurique.50% de diminution du signal de DAN4540353025200.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8pHFigure 5: Effet du pH sur le pourcentage de diminution du signal du DAN. Le tempsd’incubation est de 30 minutes; concentration initiale du DAN : 12µmol/L ; concentrationinitiale du nitrite est 6µmol/L.II.3. Analyse des nitrites à l’aide de la voltamétrie impulsionnelle différentielleEn utilisant la voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV), nous avons mesuréles nitrites dans une large gamme de linéarité. Des pics bien définis sont enregistrés. Deuxéquations de régression sont exprimées comme suity = 0.33 + 8.17 C R 2 = 0.997 si la concentration du DAN est égale à 12µmol/Let y = 1.30 + 47.38C R 2 = 0.998 pour 2µmol/L de DANOù y est le pourcentage de diminution du signal du DAN et C est la concentration dunitrite en µmol/L.- 86 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …Les courbes de calibration sont respectivement linéaires dans les intervalles 0.2 –1.6µmol/L et 2 – 10µmol/L pour les concentrations 2 et 12µmol/L de DAN. La déviationrelative standard RSD (n=5) de la pente de la courbe de calibration est égale à 5.7% pour12µmol/L de DAN et 3.0% pour 2µmol/L. la limite de détection est égale à 0.2µmol/L denitrite.II.4. Mesure de NO 2-milieu Batch (BIA)à l’aide de la méthode d’analyse par injection directe enLes avantages apportés par l’utilisation de la technique BIA sont : la réduction dutemps de l’analyse et la simplification du protocole expérimental (renouveler la surface del’électrode à pâte de carbone n’est pas nécessaire dans un système BIA). En effet, X. G. Liet ses coll., N. Oyama et ses coll. [9, 10] ont montré qu’en milieu acide, la polymérisationse produit à la surface de l’électrode solide ; ce qui demande un nettoyage fréquent de cettesurface.La cellule adoptée pour les analyses en BIA- ampérométrie, décrite précédemmentdans le chapitre II, est remplie de 40 mL d’acide sulfurique 0.04mol/L. La micropipette estfixée exactement par-dessus le centre de l’électrode indicatrice à une distance de 2 à 3mmde la surface. Le volume de soluté est ensuite injecté à l’aide d’une micropipetteautomatique de marque Eppendorff.Après l’écoulement du temps d’incubation, des aliquotes de 100µL du mélange denitrite et DAN préparé à l’extérieur de la cellule électrochimique sont injectés directementpar-dessus l’électrode à pâte de carbone plongée dans une solution acide en agitation. Uneréponse transitoire est enregistrée parce que le contact avec l’électrode ne dépasse pasquelques secondes. Par conséquent, la surface de l’électrode est en permanence nettoyée.Avant de commencer les mesures, il est nécessaire de choisir le meilleur potentielqui peut être appliqué pour la détermination ampérométrique du nitrite. Les détecteursampérométriques du nitrite permettent généralement de mesurer ce soluté à des potentielsproches de +1.0V [11]. Dans cette zone plusieurs espèces présentes dans les milieuxcomplexes sont électroactives et peuvent interférer dans la mesure du nitrite. En effet, la- 87 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …méthode proposée permet cette mesure à un potentiel proche de +0.7V où la réponse desinterférences est significativement réduite. De plus, pour éliminer les interférencespossibles, nous avons analysé l’échantillon seul pour reproduire le signal du blanc qui estsoustrait par la suite du signal enregistré en présence du DAN.La figure 6 présente des courants de transition successifs du DAN obtenus aprèsinjection, à potentiel fixe, des mélanges contenant 2µmol/L du DAN et des concentrationscroissantes de nitrite. En se basant sur la largeur du pic, on peut évaluer le nombred’échantillons analysés par heure : il est de 120.En utilisant la technique BIA, la gamme de linéarité est de :0.2 - 1.6µmol/L pour 2µmol/L de DAN avec une équation de régression présentéecomme suit : y = 4.18 + 48.01C avec R 2 = 0.995 et1.6 – 10µmol/L en utilisant 12µmol/L de DAN, l’équation est :y= 0.98 + 8.25C et R 2 = 0.999où y est le pourcentage de diminution du signal du DAN, C est la concentration en nitriteen µmol/L et R 2 est le coefficient de détermination.La déviation relative standard déterminée en répétant les mesures 5 fois pour 1µmol/L denitrite est calculée. Elle est de 3.8%. La plus faible quantité détectable vaut 0.1µmol/L, cequi correspond à un rapport signal/ bruit égal à 3.- 88 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …0,25 70,20560,15Ip / µA0,100,0512340,000 50 100 150 200time / sFigure 6: Exemples de réponses en courant d’électro-oxydation, en BIA, de 2µmol/L deDAN en absence du nitrite (7) et en présence de nitrite aux concentrations suivantes : (6)0.2µmol/L , (5) 0.5µmol/L, (4) 0.8µmol/L, (3) 1.2µmol/L, (2) 1.6µmol/L et (1) 1.8µmol/L.Durée de l’incubation 30 minutes, électrolyte acide sulfurique 0.04mol/L, potentielappliqué +0.7V / Ag/AgCl.II.5. Etude des substances interférentes :Les éléments qui peuvent interférer dans la détermination des nitrites sont lessubstances électroactives aux environs de +0.7V ou celles qui réagissent avec le DAN dansles mêmes conditions de l’analyse du nitrite. En utilisant la voltamétrie impulsionnelledifférentielle ou l’ampéromètrie couplé au BIA, on mesure les réponses des espècesélectroactives avant l’ajout du DAN et on les soustrait sous forme de blanc. La réaction duDAN avec d’autres substances présentes dans les échantillons contenant le nitrite estétudiée en utilisant des solutions contenant 6µmol/l de nitrite et 60µmol/L de chacune deces espèces. Les signaux de la technique DPV obtenus sont comparés à ceux donnés pardes solutions de nitrite seul. Ceci nous a permis de déterminer les erreurs relatives résultantde la présence des espèces introduites (tableau 1).- 89 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …Tableau 1: Etude des interférences.Ion NO 3-SO 42-Cl - Zn 2+ Cu 2+ Pb 2+ Mg 2+ Fe 2+% of variation +0.8 +4.3 +4.7 +32.1 +12.7 +7.0 -9.0 +7.1Ces résultats montrent que les métaux peuvent interférer dans la détermination desnitrites. Ce pendant, l’utilisation de 200µmol/L de l’acide éthylènediamine-tétraacétique(EDTA) comme agent complexant réduit ces interférences. Par conséquent, l’EDTA estajouté à l’échantillon pour le reste du travail. En présence de ce réactif, la pente de lacourbe de calibration est diminuée de 4% (figure 7).Figure 7 : Pourcentage de diminution du signal de DAN (enregistré en mode DPV) enfonction de la concentration en nitrite. Période d’incubation : 30 minutes, pH = 1.1, (? ) enprésence de l’EDTA à 200µmol/L, (¦ ) Sans EDTA.- 90 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …III. Application : Analyse des échantillons réelsQuatre échantillons de l’eau de puit et cinq des eaux usées sont analysés en premierpar la voltamétrie impulsionnelle différentielle en présence du DAN puis par la méthodespectrophotométrique standard.La méthode des ajouts dosés est adoptée pour la détermination des nitrites dans leséchantillons réels (4µmol/L de nitrite est ajouté). Le taux de recouvrement varie entre 94 et98%, le RSD (n = 5) est inférieur à 5. L’analyse des échantillons réels montre que notreméthode est comparable à la méthode spectrophotométrique sauf dans le cas desconcentrations en nitrite proches de la limite de détection (tableau 2).Tableau 2: Détermination du nitrite dans des échantillons d’eau.Echantillon(B) concentration du nitrite(A) concentration du nitriteA - B x100/µM (méthode proposée DPV)/µM (méthode colorimétrique)AEau usée19.810.748.75Eau usée24.905.124.29Eau usée30.990.95-4.21Eau usée412.2812.24-0.33Eau usée56.406.36-0.62Eau de puit12.302.393.7Eau de puit20.420.444.5Eau de puit30.200.2725.9Eau de puit40.320.3713.5- 91 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …IV. ConclusionA partir de ce travail sur le développement d’une nouvelle méthode dedétermination des nitrites par voie électrochimique, nous pouvons tirer les conclusionssuivantes :- Le système électrochimique étudié (le 2,3-diaminonaphthalène) est un systèmeirréversible. Le processus électrochimique est contrôlé par la diffusion.- La technique développée est basée sur la réaction chimique se déroulant entre leDAN et le nitrite en milieu acide, elle donne naissance à un composé nonélectroactif (le naphthotriazole). Nous exploitons ainsi l’activité électrochimique duDAN pour mesurer son courant d’oxydation (à l’électrode EPC) qui diminuelorsque la quantité du nitrite ajoutée augmente.- Cette réaction chimique nécessite un temps d’incubation égal à 30 minutes, un pHde 1.1 et une concentration du DAN qui ne dépasse pas 20µmol/L.Ainsi, nous avons pu développer une méthode simple à mettre en œuvre et peucoûteuse (peu de réactifs) pour la détermination des nitrites dans les eaux usées et les eauxde puits. En mode DPV (voltamétrie impulsionnelle différentielle), nous avons montréqu’il est nécessaire de polir l’électrode par extrusion de sa couche externe après chaquetracé et que le système d’analyse par injection directe en milieu batch couplé àl’ampérométrie peut remédier à ceci : on peut faire des injections successives sans traiter lasurface de l’électrode à pâte de carbone et ceci en un temps très court. Ce qui rend laméthode plus attractive de point de vue simplicité et rapidité.Nous avons montré par la suite que quelques métaux interfèrent dans la mesure desnitrites. Afin de réduire cet effet, nous avons ajouté préalablement de l’EDTA à la solution.La pente de la courbe de calibration n’a pas beaucoup changé ; elle a diminué de 4%.En fin, l’avantage de la technique proposée est en plus d’être simple, elle estsensible et sélective. Des concentrations inférieures à 0.1µmol/L sont mesurées enprésence du DAN à la concentration 2µmol/L. La gamme de linéarité peut être étendue enchoisissant d’autres concentrations du DAN. L’instrumentation analytique utilisée est unpotentiostat portable, la fréquence des analyses est très élevée (120 échantillons par heure).La technique développée nous permet donc d’effectuer des analyses sur le terrain.- 92 -

Chapitre IVDétection électrochimique de l’ion nitrite …Références[1]. A. Buldt, U. Karst; Anal. Chem. 1999, 71, 3003-3007.[2]. H. Li, C. J. Meininger, G. Wu; J. Chromatogr. 2000, 745 (2), 199-207.[3]. I. H. H Murad, K. Takashi; Journal of Chromatography: Biomedical Sciences andApplications. 2000, 744 (2), 433-437.[4]. P. Mikuska, Z. Vecera; Anal. Chim. Acta. 2003, 495 (1-2), 225-232.[5]. T. Odake, M. Tabuchi, T. Sato, H. Susaki, T. Korenaga; Anal. Sci., 2001, 17,535- 538.[6]. T. P. Misko, R. J. Schilling, D. Salvenini, W. M. Moore, Mark G. Currie; Anal.Biochem. 1993, 214, 11-16.[7]. P. Damiani, G. Burini; Talanta 1986, 33 N° 8, 649-652.[8]. Standard methods for the examination of water and waste water. American PublicHealth Association, New York, 1995, 4500 nitrite, 112-118[9]. X-G. Li, M-R. Huang, W. Duan, Y-L. Yang ; Chem. Rev, 2002, 102, 2961.[10]. N. Oyama, M. Sato, T. Ohsaka; Synth. Met. 1989, 29: E501.[11]. R. Guidelli, F. Pergola, G. Raspi; Anal. Chem. 1972, 44 (4), 745-755- 93 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….Chapitre VDéveloppement d’une technique d’analyse des nitratesdans les échantillons d’eau et de produits carnés- 94 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….IntroductionLe nitrate (NO - 3 ) est la principale forme d’azote trouvée dans les eaux naturelles Ilprovient de l’oxydation complète des composés de l’azote. Les principales sources de rejetdes nitrates sont les aérosols d’acide nitrique ou de nitrate d’ammonium provenant d’usinesd’acide nitrique ou de fertilisants et les effluents de certaines industries alimentaires .Lesnitrates sont aussi largement utilisés comme agent oxydant dans l’industrie chimique. Lenitrate est un élément nutritif présent dans les engrais comme le phosphate (PO 3- 4 ). Saprésence en excès dans l’environnement représente un risque majeur pour la santé del’Homme. Sa dispersion dans les eaux de surface et les eaux profondes est un sérieuxproblème environnemental qui se manifeste principalement par le phénomèned’eutrophisation [1, 2]. Le principal danger du nitrate pour la santé provient de satransformation en nitrite dans l’appareil digestif. Ce nitrite pourrait provoquer des effetscancérigènes pour l’homme. Le nitrate est plus dangereux pour les nourrissons, satransformation en nitrite se fait plus facilement. Il agit au niveau du sang, empêchel’oxygénation de l’organisme et peut provoquer des dommages au cerveau. La valeurmaximale tolérée (normes Organisation Mondiale de la Santé) pour l’eau deconsommation de l’homme est fixée à 50mg/L (exprimée en NO 3 ).Plusieurs méthodes d’analyses directes ou indirectes des nitrates ont étédéveloppées. Parmi les méthodes d’analyse directes, nous citons :- La chromatographie ionique [3, 4] : Elle a connu beaucoup de développement cesdernières années. Elle est très sensible (la limite de détection peut atteindre 0.5µmol/L [4])et reproductible. Néanmoins, cette technique présente deux inconvénients : un coût et untemps d’analyse élevés.- Les méthodes électrochimiques de détermination directe du nitrate sur des électrodesmétalliques ont été également développées [5, 6, 7, 8]. Cependant, ces méthodesimpliquent une faible sensibilité et un manque de reproductibilité. D’autres techniques-électrochimiques utilisant des électrodes modifiées permettent de mesurer le taux de NO 3à partir de son signal de réduction. Parmi ces électrodes, nous avons les électrodesmodifiées par du sulfate de cuivre en milieu acide [9, 10, 11], par du polypyrrole [12] etpar de l’iridium [13]. Les nitrates ont été aussi déterminés par polarographieimpulsionnelle différentielle [14,15] et en utilisant des biocapteurs [16,17].- 95 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….Par contre les méthodes indirectes de détermination des nitrates, impliquent leurréduction préliminaire en nitrites. Cette réduction peut être réalisée en utilisant desréducteurs très forts [18- 21] ou en utilisant des radiations UV à des longueurs d’onde entre200 et 300nm qui permettent la dissociation du nitrate en nitrite et en oxygène. Après laréaction de conversion des nitrates en nitrites, les méthodes de dosage des nitrites déjà cités[22- 31] sont utilisées pour en déduire le taux des nitrates.Dans ce présent travail, nous nous sommes intéressés à la réduction de NO - 3 par lecadmium cuivré. Nous proposons de coupler cette technique à la méthode électrochimiquede détermination des nitrites (chapitre 4) basée sur la réaction chimique entre les nitrites etle 2,3-diaminonaphthalène (DAN) [32]. Les nitrites formés seront aussi détectés par laméthode standard de Griess afin de pouvoir faire une comparaison des deux méthodes.-L’utilisation du DAN au lieu des réactifs de Griess, après la réaction de réduction de NO 3a apporté des améliorations de point de vue simplicité du protocole expérimental etsensibilité pour les échantillons colorés.I. ExpérimentationI.1. Réactifs et échantillonsPour les analyses spectrophotométriques, nous avons procédé à un étalonnage del’appareil en utilisant des solutions standard de nitrite de différentes concentrations. Lenitrite de sodium NaNO 2 est préalablement séché pendant 4 heures dans un four à 100°C.Les solutions standard de nitrate sont préparées par dilution de la solution mère deconcentration égale à 100mg/L en NaNO 3 séché pendant 1 heure à 100°C.Le réactif de diazotation est préparé selon la méthode standard de dosage desnitrites (réaction de Griess [25]). Il contient 40g/L de sulfanilamide et 2g/L de chlorure deN-(naphtyl) éthylénediamine dissous dans une solution d’acide phosphorique à 10%.Le cadmium choisi est sous forme de granules avec deux dimensions différentes : desgranules d’environ 3mm de diamètre et d’autres de diamètre inférieur à 1mm.Le chlorure d’ammonium et l’hydroxyde d’ammonium sont utilisés pour préparer lasolution tampon à pH 8-10 utilisée au cours de la réduction des ions nitrates. Le sel- 96 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….disodique de l’EDTA (l'acide éthylène diamine tétracétique) est ajouté à cette solution afinde complexer tous les métaux interférents. Pour former le cadmium cuivré, le sulfate decuivre 2% a été choisi.Pour les mesures électrochimiques, le 2,3-diaminonaphthalène sert pour complexerles ions nitrites en milieu acide sulfurique. Les solutions standard de nitrite sont préparéesen diluant la solution mère de concentration 10 -3 mol/L.Une concentration du DAN 120µmol/L est préparée dans l’acide sulfurique 0.4 mol/L enprésence de 2% d’acétonitrile. Nous avons aussi préparé le DAN à 20 µmol/Lpar dilutionde la solution précédente.Les échantillons réels sont l’eau de puit prélevée dans la ville de Mohammedia et lamortadelle de bœuf provenant d’un super marché de Casablanca.Toutes les expériences sont réalisées à température ambiante. Chaque essai sera répété 5fois, et la moyenne de ces valeurs est présentée.I.2. Réduction des nitrates en milieu batchDes quantités de 1.5g de granules de cadmium cuivré Cd-Cu (le cadmium à undiamètre moyen égal à 3mm) sont introduites dans une série de tubes à essai. Des aliquotesde 2mL de la solution de nitrate (préparée par l’ajout de 75mL de la solution tamponNH 4 Cl- NH 4 OH- EDTA de pH égal à 8.5 à 25mL de la solution standard de nitrate) sontajoutées à l’aide d’une pipette jaugée dans ces tubes. Cette réaction nécessite un tempsd’incubation suffisant, pendant lequel le mélange est remué toutes les cinq minutes entournoyant les tubes à essai.I.3. Préparation de la colonne de réductionLa colonne utilisée est en verre de dimensions (50mm x 3mm d.i). Elle est remplied’environ 3g de grains de cadmium, recouverts de dépôt de cuivre, de diamètre inférieur à1mm. Des frittés en verre sont placés aux extrémités de la colonne pour y fixer ces grainsde cadmium.- 97 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….Pour la préparation du cadmium cuivré, plusieurs protocoles ont été examinés. La méthodeutilisée au niveau de notre laboratoire est la procédure décrite par Badea et sescollaborateurs [33] : Des grains de cadmium sont d’abord placés dans une solution acideHCl (6N) pendant 1 heure, rincés à l’eau distillée, et ensuite mis dans une solution desulfate de cuivre à 2%. Une forte agitation permet la disparition de la couleur bleue forméeet l’apparition d’un précipité brun colloïdale. La préparation est laissée par la suitedécantée puis l’ensemble est lavé plusieurs fois avec de l’eau distillée jusqu’à disparitioncomplète du précipité. Le cadmium est mis dans une solution tampon de pH égal à 8.5contenant l’EDTA qui sert à complexer les métaux interférents et à éviter la formation ducomplexe Cd(OH) 2 en favorisant la formation du complexe Cd- EDTA. Pour éviter sonoxydation, le cadmium cuivré préparé ne doit jamais être en contact avec l’air.Enfin, la colonne chromatographique est remplie avec beaucoup de précautionsavec le cadmium traité. Avant de passer à l’étape de la réduction des nitrates, il estrecommandable de rincer la colonne avec 150mL d’eau distillée. La solution contenant lesnitrates est véhiculée à travers la colonne à l’aide d’une pompe péristaltique. Après usage,cette colonne est conservée dans une solution de NH 4 Cl – EDTA.II. Résultats et discussionsLes nitrates des métaux communs (par exemple NaNO 3 et KNO 3 ) sont très solublesdans l’eau. L’ion nitrate libre qui se forme ne réagit pas chimiquement, car il a peutendance à former des complexes de coordination avec d’autres ions. Par conséquent, il estnécessaire de transformer le nitrate en d’autres formes plus réactives. En effet, les ionsnitrates sont réduits en ions nitrites en présence du cadmium cuivré. La réaction deconversion du nitrate en nitrite a lieu en milieu légèrement alcalin (pH 8 à 9) selon leséquations suivantes :1 ère étape: dépôt du cuivre à la surface du cadmiumCd Cd 2+ + 2e- E° = -0.40VCu 2+ + 2e- Cu E° = +0.34V2 ème -étape: réduction de NO 3Cu Cu 2+ + 2e-- 98 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….NO 3 - + H 2 O + 2e- NO 2 - + 2OH - E° = +0.01VD’où la réaction globale:NO 3 - + Cu + H 2 O NO 2 - + Cu 2+ + 2OH -La conversion des nitrates en nitrites est basée sur la réduction stœchiométrique desnitrates en présence d’un excès de cuivre et de cadmium en milieu légèrement basique.Après la conversion, les teneurs en nitrites sont évaluées par la méthodespectrophotométrique ou par la nouvelle méthode électrochimique. Ces teneursreprésentent la somme des nitrites initialement présents dans l’échantillon et ceux résultantde la réaction de réduction des nitrates. La quantification individuelle de chaque ion estdéterminée par la différence après avoir mesurer le taux du nitrite dans l’échantillon avantl’ajout du cadmium cuivré.L’efficacité de la conversion est vérifiée en comparant la réponse des nitrates à uneconcentration standard notée C avec la même valeur de concentration en nitrites. Lessignaux doivent approximativement avoir la même intensité.II.1. Analyse spectrophotométriqueUne optimisation de divers paramètres comme le temps d’incubation en milieu batch,le débit d’écoulement de la solution à travers la colonne, le pH du milieu et laconcentration en nitrate s’avère nécessaire pour obtenir un bon rendement de la réaction deréduction.nitrates en milieu batch.II.1.1. Détermination du temps d’incubation nécessaire pour la réduction desPour étudier l’effet du temps d’incubation sur l’efficacité de la réaction de réductiondes nitrates, les solutions contenues dans les tubes à essai (décrites dans le paragraphe I.2.)sont successivement recueillies, filtrées, puis transvasées immédiatement dans une cuvettecontenant 40µL du réactif de diazotation. La solution est laissée reposer à l’abri de la- 99 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….lumière pendant au moins dix minutes (il ne faut pas dépasser deux heures). La densitéoptique du complexe coloré formé est déterminée à une longueur d’onde ? égale à 543nm.Le rendement de la réaction de conversion des nitrates en nitrites peut être exprimé commesuit :Le temps optimum d’incubation a été déterminé en évaluant le rendement de la réaction deconversion des nitrates toutes les dix minutes pour des teneurs de 2µmol/L et 10µmol/L ennitrates. La figure 1 représente la variation du rendement en fonction du tempsd’incubation.100Rendement en %80604020(1)(2)00 100 200 300 400 500Temps d'incubation en minutesFigure 1 : Variation du rendement de la réaction de réduction des nitrates en fonction dutemps d’incubation du cadmium cuivré en présence des standards de nitrate deconcentrations (1) : 2µmol/L et (2) : 10µmol/L. Le pH de la solution tampon est de 8.5.Le protocole utilisé nécessite 80 minutes pour réduire 2µmol/L de nitrate avec uneefficacité égale à 97%. Pour une concentration égale à 10µmol/L, il faut attendre plus que6 heures. La gamme de linéarité n’est donc pas très étendue si on veut réaliser des analysesrapides de l’ion nitrite. Par conséquent, le protocole adopté pour réaliser la réduction des- 100 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….nitrates, sans utiliser de colonne consiste à laisser reposer les mélanges (solutions standardde nitrate ou échantillons en présence des granules du cadmium- cuivre) pendant une nuitsous une faible agitation afin de s’assurer que la totalité des nitrates soit réduite. Ensuite,les tubes sont mis dans la centrifugeuse. Après centrifugation, on récupère le surnageantpuis on ajoute le réactif de diazotation. La mesure de l’absorbance est effectuée aprèsdéveloppement de la couleur.Nous réalisons par la suite la réduction des nitrites sur colonne de cadmium. Leprotocole adopté est plus coûteux comparativement à la réduction réalisée en milieu batch(granulométrie des particules de cadmium plus grande) mais plus avantageux de point devue temps d’analyse et linéarité.II.1.2. Influence du pH et de la concentration de la solution tampon sur lerendement de la réaction de réduction.Le cadmium utilisé, pour le remplissage de la colonne, est de granulométrie plusfine (diamètre < 1mm). Son protocole de traitement est le même que celui décritprécédemment.Pour la colonne de cadmium choisie, on fait circuler une solution de concentrationégale à 2 µmol/L en nitrate à un débit de 1ml/min. le pH de la solution varie entre 4.5 et11.5. La figure 2 présente des variations du rendement de la réaction de réduction desnitrates en fonction du pH de la solution. Des rendements faibles sont obtenus à pH 4.5 etau-delà de 10. Entre le pH 7 et 9, ce taux augmente et à un pH égal à 8.5, on enregistre unrendement de 97%. Ce résultat est en accord avec les données de la littérature [26,34].- 101 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….11010090Rendement en %807060504030204 5 6 7 8 9 10 11 12pHFigure 2 : Variation du rendement de la conversion du nitrate en nitrite en fonction du pHde la solution, la concentration en nitrate est de 2µmol/L.Nous avons également constaté qu’une variation de la concentration du chlorured’ammonium de 100 à 150 mmol/L n’a pas d’influence sur l’efficacité de la colonne. Nousavons donc choisi, pour le reste du travail, une concentration de 100mmol/L de chlorured’ammonium et un pH de 8.5 ajusté par ajout de l’hydroxyde d’ammonium concentré.II.1.3. Influence du débit sur le rendement de la réductionPour une colonne de diamètre interne égal à 3mm et de longueur 50mm, pour desconcentrations en nitrate égale à 2 et 10 µmol/L et un pH de 8.5, nous avons remarquéqu’une variation du débit d’écoulement de la solution allant de 0.5ml/min à 3.0mL/minagit nettement sur la densité optique de la solution et par conséquent sur le taux deconversion de nitrates en nitrites. Un palier est observé à partir de 1.5mL/min pour uneteneur en ion nitrate égale à 2µmol/L et à partir de 2 mL/min pour 10µmol/L. Le débitoptimum doit être supérieur ou égal à 2mL/min (figure 3).- 102 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….100(1)Rendement en %95908580(2)750.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0Débit en mL/minFigure 3 : Variation du rendement de la réaction de réduction des nitrates en fonction dudébit d’écoulement de la solution à travers la colonne. La concentration des nitrates est de(1) 2µmol/L. (2) 10µmol/L. pH= 8.5.réduction :II.1.4. Influence de la concentration initiale de nitrite sur le rendement de laNous avons aussi étudié l’influence de la concentration du nitrite initialementprésent dans l’échantillon sur l’efficacité de la colonne de cadmium. Quatre standardscontenant le nitrate et le nitrite sont analysés spectrométriquement après leur passage dansla colonne. Les résultats montrent que le rendement est indépendant de la concentration dunitrite initialement présent dans la solution. En choisissant la somme (nitrate + nitrite)égale à 0.6mg/L, l’absorbance est toujours la même, elle est de 0.583 ± 0.008 quelque soitla concentration des nitrites (figure 4).- 103 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….100Rendement en %9080700.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6concentration initiale en nitrite en mgL -1Figure 4 : Rendement de la réduction des nitrates sur colonne de cadmium, V = 2mL/min,pH du milieu 8.5, ([nitrate] + [nitrite]) = 0.6mg/L.II.1.5. Courbe de calibration :Dans les conditions optimisées précédemment (pH = 8.5, débit = 2mL/min, tamponammoniacal 100mmol/L), la variation de la concentration des ions nitrates ajoutés enfonction de la concentration des ions nitrites mesurée à la sortie de la colonne a été étudiée.L’équation de la courbe résultante est la suivante :[NO - 3 ] = 0.02 + 0.99 [NO - 2 ] avec R 2 = 0.998, pour la gamme de concentration 1 – 20µmol/L de nitrate (fig. 7). Les échantillons dont les concentrations sont supérieures à20µmol/L sont mesurés après leur dilution. La limite de détection est estimée enconsidérant un rapport signal/ bruit de fond égal à 3 (3σ), à 1µmol/L.La répétitivité de l’analyse est déterminée en effectuant cinq mesures répétées avecune concentration de 5µmol/L de nitrate. Le coefficient de déviation relative standard nedépasse pas 5%.- 104 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….Figure 5 : Variation de la concentration de nitrate à l’entrée de la colonne en fonction de laconcentration des nitrites mesurée à sa sortie, V = 2mL/min, pH du milieu 8.5II.1.6. Analyse de nitrite et de nitrate dans des échantillons réels :Les analyses ont été effectuées pour des échantillons de charcuterie, d’eau de puit etde l’eau de robinet. Pour éviter le colmatage de la colonne de cadmium, l’eau à analyserdoit être exempte de matière en suspension. Pour cela, on la passe sur papier filtre de trèsbonne qualité puis à travers une membrane filtrante de porosité égale à 0.45µm. Après sonpassage dans la colonne, le réactif de diazotation est ajouté à l’échantillon et le taux denitrite est mesuré par spectrophotométrie à une longueur d’onde ? égale à 538nm.Avant d’être filtrés, les échantillons de la mortadelle nécessitent un traitement selonla méthode décrite dans la référence [35]. Ce traitement consiste à introduire 5g de viandebroyée dans un flacon contenant 40mL d’eau chaude (80°C). Après homogénéisation, latotalité de la solution est transférée dans un deuxième flacon de capacité 500mLpuisramenée au volume de 300ml avec de l’eau chaude et ensuite chauffée au bain mariependant 2 heures tout en agitant de temps en temps. Après refroidissement à la températureambiante, on complète le volume à 500mL avec de l’eau distillée. Le mélange est ensuitefiltré sur papier filtre puis sur microfiltre (0.45µm). Avant l’analyse spectrophotométrique,le réactif de diazotation est ajouté à la solution (légèrement colorée).- 105 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….Nous déterminons d’abord la teneur des nitrites avant le passage de l’échantillon àtravers la colonne. Etant donné qu’il a été montré au paragraphe II.1.4 que celle-ci n’estpas affectée par les réactifs de la réaction de réduction, la quantité des nitrates est alorscalculée en soustrayant la quantité initiale des nitrites de la valeur (nitrites + nitrates)déterminée spectromètriquement après réduction.Le tableau 1 montre les quantités des nitrates et des nitrites obtenues en analysanttrois échantillons différents.Tableau 1 : Résultats des analyses par la méthode spectrophotométrique de troiséchantillons différents :Eau de puit (mg/L) Eau de distribution (mg/L) Mortadelle (mg/kg)Nitrite 0.024± 0.006 0.023±0.005 47±9.2Nitrate 122±6.6 1.5±0.17 94±13Pour les produits carnés on a trouvé 47 mg NaNO 2 /kg de nitrite. Cette teneur estinférieure à 100 mg/kg de nitrite qui représente la valeur limite légale. En effet, les dosesd’utilisation des nitrites et nitrates et les conditions d’emploi sont réglementées. Les limitesmaximales résiduelles des nitrites / nitrates sont fixées au Maroc par la circulaire conjointeN° 1/97 du ministère de l’agriculture et du ministère de la santé publique, relative àl’utilisation des additifs alimentaires (tableau 2).L’eau de puit et l’eau de robinet respectent les normes imposées pour l’eaupotable (0.1mg/L en nitrite). Au niveau de l’eau de puit, on observe une forte teneur ennitrates égale à 122 mg/L. Cette valeur est non conforme aux normes en vigueur qui fixent50 mg/L. Cela est du à la contamination de la nappe phréatique par les engrais utilisésmassivement dans la région de Mohammedia- Benslimane.- 106 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….Tableau 2 : Les limites maximales résiduelles des nitrites et des nitrates dans la charcuterieN° CEE Nom Denrées alimentaires Dose indicatived’incorporationmg/kgQuantitérésiduellemg/kgE 249 Nitrite de potassium (1) Produits de charcuterie et de 150 (2) 50 (3)E 250 Nitrite de sodium (1) salaison non cuits, séchésAutres produits de salaison et 150 (2) 100 (3)de charcuterieE 251 Nitrate de sodium Produits de charcuterie et de 300 250 (4)E 252 Nitrate de potassium salaison(1)lorsqu’il est étiqueté « pour usage alimentaire », le nitrite peut uniquement être vendu enmélange avec du sel.(2) Exprimé en NaNO 2 .(3) Quantité résiduelle au point de vente au consommateur, exprimée en NaNO 2 .(4) Exprimé en NaNO 3 .II.2. Détermination des nitrites et nitrates par voie électrochimiqueII.2.1. Principe de la méthodeDans la seconde partie du travail, le nitrate est mesuré après sa conversion en nitritedans une colonne de cadmium/ cuivre. Le nitrite résultant est déterminé en utilisant latechnique proposée [32] qui est basée sur sa réaction chimique avec le 2,3-diaminonaphthalène (DAN) en milieu acide (schéma ci-dessous). Cette méthode est décritedans le chapitre précédent.- 107 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….L’électroactivité du 2,3-diaminonaphthalène a été exploitée, le DAN présente unpic d’oxydation vers +0.7V par rapport à l’électrode de Ag/AgCl, alors que le2,3-Naphthotriazole (NTA) n’est pas électroactif.Le taux de diminution du signal du DAN est calculé selon l’expression suivante :I (%)I− II1 2= x 1001Ce taux de diminution est proportionnel à la concentration des nitrites dosés.Dans les conditions optimisées de la méthode proposée (pH= 1.1, temps d’incubation =30minutes et concentration du DAN utilisée), la variation du pourcentage de diminution dusignal du DAN I (%) en fonction de la concentration des nitrites a été étudiée.II.2.2. Procédure expérimentaleDes volumes de 4.5mL de la solution contenant le soluté, sont récupérés à la sortiede la colonne de réduction des nitrates. On leur rajoute 50µL de l’acide sulfurique0.4mol/L et 500µL du DAN acidifié. Ces solutions sont par la suite incubées pendant 30minutes à température ambiante. Le pourcentage de diminution du signal du 2,3-diaminonaphthalène est déterminé pour chaque standard ou échantillon à partir descourants d’oxydation du DAN libre. Ces courants sont enregistrés en mode DPV surl’électrode à pâte de carbone.La réduction des nitrates sur colonne de cadmium est réalisée avec un rendementtrès proche de 100%. Par conséquent, les caractéristiques analytiques de la méthodeélectrochimique développée en vue de l’analyse des nitrates réduits sont les mêmes quecelles du chapitre 4.Dans le chapitre précédent, l’étude des interférences a montré que quelques métauxlourds (cuivre et zinc) interfèrent dans la mesure des nitrites. Pour y remédier, nous avonsajouté l’EDTA (à une concentration égale à 200µmol/l) comme agent masquant avantl’addition du DAN. Dans le cas des nitrates, l’EDTA est additionné aux échantillons au- 108 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….cours de l’étape de la réduction. Les interférences des métaux présents se trouvent ainsiréduites.II.3. Comparaison entre les résultats obtenus par spectrophotométrie et les résultatsobtenus par voie électrochimiqueLes performances analytiques de la méthode ont été évaluées par une détermination-de NO 3 dans des échantillons d’eau de robinet, d’eau de puit et de produits carnés (tableau3). Nous avons analysé quelques échantillons d’eau et de produits carnés par les deuxméthodes présentées plus haut, à savoir la méthode de Griess et la méthode voltamétriquebasée sur la réaction des nitrites avec le DAN. Les analyses des échantillons par laméthode électrochimique ont été réalisées avec et sans ajouts dosés, et ceci dans le butd’évaluer le taux de récupération de cette méthode. Ce paramètre a été vérifié en ajoutantaux échantillons réels d’eau 0.25mg/L de nitrate et aux échantillons de mortadelle25.5mg/kg de NaNO 3 . La concentration du DAN utilisée est de 12µmol/L. Les taux derecouvrement obtenus varient entre 99 et 110% avec une moyenne égale à 105.7±4.2. Ilsont été satisfaisants.Tableau 3 : Détermination des nitrates dans des échantillons réels, comparaison entre laméthode électrochimique et la méthode spectrophotométriqueNitrate selonla nouvelleméthode (A)Nitrate selon laméthode deGriess (B)Erreur entre les deuxmesures100 x (A-B)/AM 17.2 7.6 -5.5%M 2 9.3 7.1 23.6 %ER 1 4.5 4.3 4.4 %ER 2 1.37 1.40 -2.2 %EP 284.10 313.40 -10.3 %M 1 et M 2 sont des échantillons de la mortadelle, leurs concentrations sont exprimées enmg/kg, elles sont proches de la limite de détection de la méthode spectrophotométrique- 109 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….d’où l’écart observé entre les deux méthodes. ER 1 et ER 2 représentent l’eau de robinet etEP l’eau de puit, leurs teneurs en nitrates sont exprimées en mg/L. Les valeurs présentéessont les concentrations réelles multipliées par les facteurs de dilution.Les résultats montrent qu’il y a une concordance entre les deux méthodes.Cependant, pour l’échantillon M 2 , un grand écart est observé entre ces résultats. Ceci estprobablement du à sa coloration légèrement plus foncée que celle de l’échantillon M 1 .- 110 -

Chapitre VDétermination électrochimique des nitrates……….III. ConclusionLa méthode colorimétrique est une méthode sensible, reproductible, soninconvénient est qu’elle ne peut pas être utilisée pour l’analyse des nitrites, nitrates dansdes échantillons colorés.Pour l’analyse du nitrate, le passage de l’échantillon turbide à travers la colonne decadmium nécessite un traitement préalable et une filtration poussée pour éviter lecolmatage de la colonne. Pour les échantillons colorés, il n’y a pas de moyen simple pouréliminer la coloration mais il faut que le produit coloré n’absorbe pas dans la mêmelongueur d’onde que l’élément à doser.La méthode électrochimique proposée pour la détermination des nitrates/nitritesprésente de nombreux avantages. Elle est :vvvvvreproductible et sélective.très simple, une fois l’échantillon traverse la colonne, il est récupéré, mélangé avecle DAN acidifié puis dosé électrochimiquement. Cette solution, protégée contre lalumière, est stable pendant une période qui dépasse 3 heures.sensible même pour les échantillons turbides ou colorés.l’instrumentation portative utilisée permet d’effectuer les mesures sur le terrain.économique, la méthode n’exige pas beaucoup de réactifs. En outre, l’appareillageutilisé n’est pas coûteux.- 111 -

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Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ion ammonium dansl’eau de distribution- 114 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….IntroductionUne partie considérable de toutes les analyses de l’eau se concentre sur unproblème, celui de la potabilité. Pour arriver à cette décision, on a besoin de l’analysed’une grande quantité de paramètres chimiques ainsi que de paramètres bactériologiquesdéfinis. Afin de déterminer quelles sont les impuretés de l’eau qui sont provoquées par lamatière fécale et les produits de putréfaction, il existe toujours une détermination qu’onutilise traditionnellement comme méthode indicatrice et qui, en cas de besoin est même lecritère unique, c’est la teneur en ammonium. Bien qu’ en lui même cet ion n’est pasrelativement très toxique, une faible quantité dans l’eau peut indiquer des états d’hygiènedouteuse, se manifestant par des teneurs élevés en bactéries fécales, en germes pathogènes.Certaines bactéries prolifèrent en transformant l’ammonium en nitrites puis en nitrates.L’azote ammoniacal est généralement mesuré par la méthode colorimétrique [1,2]. Cetteméthode ne peut pas être appliquée sur le terrain alors que les techniques d’analyse sur sitesont actuellement très attractives. Des méthodes chimiques et électrochimiques dedétermination de l’ammoniac sont utilisées [3-9]. Toutes les deux demandent un grandnombre de réactifs chimiques et une longue période d’expérimentation. Par conséquent, lecoût, le temps et la complexité de l’analyse sont les barrières majeures pour une évaluationadéquate de taux de pollution lorsqu’il s’agit d’un grand nombre d’échantillon. C’estpourquoi, il est nécessaire de chercher une méthode alternative d’analyse de l’ammoniacqui doit être rapide, simple et efficace. Dans ce sens, L’électrode sélective à l’ionammonium est commercialisée depuis des années. Les prototypes proposés avecmembrane en PVC présentent des gammes dynamiques linéaires larges, des limites dedétection de l’ordre de 0.9ppm. Cependant ces électrodes soufrent d’interférencesnotamment en présence de l’ion potassium. Elles sont également fragiles et relativementcoûteuses. Dans les laboratoires d’analyse de routine, il y a un grand besoin d’analyserapide de plusieurs éléments ou de plusieurs échantillons. Ces analyses sont effectuéespour déterminer les concentrations approximatives des éléments. Elles sont dites parconséquent « semi quantitatives » car elles ne sont pas supposées produire la précisionultime. Elles doivent seulement fournir des résultats d’une précision suffisante dans untemps d’analyse très court et avec une méthode de travail très simple et pratique.- 115 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….Dans la présente étude, nous développons une nouvelle méthode ampérométriquepour la détermination de l’ion ammonium dans l’eau de robinet. C’est une méthoded’analyse rapide « screening » qui permet de donner une bonne précision, pourvu que lacourbe de calibration soit bien ajustée. Nous avons choisi une matrice qui n’est pascomplexe : l’eau de robinet. La surveillance de la qualité de cette eau est d’une grandeimportance principalement lorsqu’il s’agit de l’utilisation de cette eau dans la chaîne deproduction. La méthode élaborée permet de donner une idée sur la potabilité de cette eau,d’indiquer s’il y a présence ou non de l’ion NH + 4 , de décider de la nécessité de procéder àdes analyses approfondies des échantillons (lors de la détermination de très faibles teneursen ion ammonium) et en cas de besoin de prendre une décision rapide.La technique développée est basée sur la réduction électrochimique du complexe Cu(II)ammoniacal à l’électrode à pâte de carbone. Pour aborder cette étude, nous utilisons latechnique de voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV) et l’ampérométrie àl’électrode à pâte de carbone.I. réactifs et échantillonsLes solutions tampons carbonate (pH 8- 11) sont préparées à partir de Na 2 CO 3 etNaHCO 3 . Les solutions tampons Borax sont préparées à partir de Na 2 B 4 O 7 ajustées avec lasoude.Les standards d’ammonium sont préparés à partir du chlorure d’ammonium et les solutionsde Cu 2+ à partir du sulfate de cuivre. Tous les réactifs utilisés sont de qualité analytique.L’eau de robinet du laboratoire représente les échantillons analysés.II. Résultats et discussionsII. 1. Etude sur électrode à pâte de carbone modifiéeAu début de cette étude, les mesures sont effectuées avec une électrode de travail àpâte de carbone modifiée avec du cuivre (II). La modification de la surface carbonées’effectue en immergeant cette électrode dans une solution acide de sulfate de cuivre 0.5mol/L et en appliquant pendant 3 minutes un cyclage de potentiels entre +0.1V et -0.6V- 116 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….par rapport à l’électrode Ag/AgCl avec une vitesse de balayage de 50mV/s. Lesvoltamogrammes cycliques résultants sont tracés en milieu acide sulfurique 0.5mol/L.Cette électrode modifiée est par la suite testée dans différents milieux tampons(acétate à pH 4, phosphate pH 9 et carbonate variant de pH 10 à 11). En présence dedifférentes concentrations de NH + 4 , nous avons remarqué que l’électrode modifiée nerépond pratiquement pas aux changements de concentration de cet ion quelque soit lavaleur de pH. Par conséquent, nous avons décidé de mettre l’ion Cu 2+ en solution et defavoriser la formation du complexe cupro-ammoniacal qui est électroactif.Nous effectuons par la suite nos mesures en adoptant l’ampérométrie ou la voltamétrieimpulsionnelle différentielle (DPV) comme techniques de mesure. Dans ce cas, la réponsedu détecteur est influencée par différents paramètres tels que la concentration du cuivre, lepH de la solution, la nature du tampon et le potentiel appliqué.II. 2. Comportement du système électrochimique forméNous avons tracé des voltamogrammes cycliques de l’ion Cu 2+ en présence de l’ionammonium en milieu basique, à différentes vitesses de balayage (figure 1). Nousremarquons que sur l’électrode à pâte de carbone, le système étudié est lent. Ceci semanifeste par un écart entre les pics anodiques et cathodiques (∆Ep) très supérieur à (58/n)mV, valeur caractéristique des systèmes rapides.Figure 1 : Voltamogrammes cycliques à l’électrode à pâte de carbone de Cu 2+ 200µmol/L,tampon carbonate 50mmol/L pH 10, [NH 4 + ]=1mmol/L, vitesses de balayages : 50, 100,200, 300mV/s.- 117 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….Nous représentons par la suite dans la figure 2, les courants de pic de réduction enregistrésen fonction de la vitesse de balayage.54Courant en µA32100 50 100 150 200 250 300v en mV/sFigure 2: Variation du courant de pic en fonction de la vitesse de balayage ;[Cu 2+ ] = 200µmol/L, tampon carbonate à 50mmol/L, pH 10, [NH 4 + ]=1mmol/L,La courbe résultante est linéaire avec un coefficient de détermination valant 0.994.Par conséquent, la réaction de réduction du système étudié n’est pas contrôlée par ladiffusion.La courbe représentée par la suite, sur la figure 3 montre le tracé enregistré envoltamétrie impulsionnelle différentielle sur l’électrode à pâte de carbone pour dessolutions contenant le cuivre à 200µmol/L et l’ion ammonium à des concentrations allantde 1mmol/L à 4mmol/L.Nous avons constaté un déplacement des pics vers les potentiels positifs après ajoutde l’ion ammonium. Ceci peut être interprété par une formation probable d’un complexe.- 118 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….0.20.0Courant en µA-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0-1.2-1.4-1.6-1.8-2.0Cu 2+ 200µMNH + 41mM+NH 42mMNH + 44mM0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4potentiel en VFigure 3 : Tracé voltamétrique (DPV) à l’électrode à pâte de carbone, solution tamponcarbonate pH 10.Il est connu qu’en milieu basique la forme NH 3 prédomine par rapport à la formeprotonée NH + 4 et que le complexe qui se forme lors de la réaction entre Cu 2+ et NH + 4 enmilieu basique est le [Cu(NH 3 ) n ] 2+ , la valeur de n dépend de la quantité d’ammoniumajoutée [10].Pour déterminer la valeur de n, c'est-à-dire lequel des complexes est formé, nousprocédons au protocole suivant :Les constantes d’équilibre de formation successives des complexes [Cu(NH 3 ) n ] 2+ sontdonnées respectivement :Cu 2+ + NH 3 Cu(NH 3 ) 2+ K 1 = [Cu(NH 3 ) 2+ ]/ [Cu 2+ ] [NH 3 ] = 1.3 10 4Cu(NH 3 ) 2+ + NH 3 Cu(NH 3 ) 22+Cu(NH 3 ) 2 2+ + NH 3 Cu(NH 3 ) 32+Cu(NH 3 ) 3 2+ + NH 3 Cu(NH 3 ) 42+K 2 = 3.2 10 3K 3 = 8.0 10 2K 4 = 1.3 10 2- 119 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….On note d’abord ßo, ß 1, ß 2, ß 3, ß 4 les rapports entre les concentrations des ions Cu 2+ ,Cu(NH 3 ) 2+ , Cu(NH 3 ) 2 2+ , Cu(NH 3 ) 3 2+ et Cu(NH 3 ) 4 2+ et la concentration initiale de l’ionCu 2+ notée C M :ßo = [Cu 2+ ] / C M ;ß 1 = [Cu(NH 3 ) 2+ ] / C M ;ß 2 = [Cu(NH 3 ) 2+ 2 ] / C M ;ß 3 = [Cu(NH 3 ) 2+ 3 ] / C M ;ß 4 = [Cu(NH 3 ) 2+ 4 ] / C M ;En ne tenant pas compte des espèces hydrolysées, on note :C M = [Cu 2+ ]+ [Cu(NH 3 ) 2+ ]+ [Cu(NH 3 ) 2+ 2 ]+ [Cu(NH 3 ) 2+ 3 ]+ [Cu(NH 3 ) 2+ 4 ]= 2 10 -4 mol/Lsuivants :En utilisant les expressions des constantes d’équilibre, nous obtenons les rapportsK = ß / ßo [NH 3 ]K = ß / ß [NH 3 ]K = ß 3 / ß [NH 3 ]K = ß / ß [NH 3 ]Nous en déduisons les expressions de ßo, ß 1 , ß 2 , ß 3, et ß 4 en fonction de [NH 3 ] et desconstantes d’équilibre K 1 , K 2 , K 3 et K 4 .ß = ß K 1 [NH 3 ], ß = ß [NH 3 ] 2 K 1 K 2 ; ß = ß [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 ; ß = ß [NH 3 ] 4 K 1 K 2 K 3 K 4 .Or C M = [Cu 2+ ] + [Cu(NH 3 ) 2+ ] + [Cu(NH 3 ) 2+ 2 ] + [Cu(NH 3 ) 2+ 3 ] + [Cu(NH 3 ) 2+ 4 ].et on a:ß 0 + ß 1 + ß 2 + ß 3 + ß 4 = 1d’où :ß + ß [NH 3 ] K 1 + ß [NH 3 ] 2 K 1 K 2 + ß [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 + ß [NH 3 ] 4 K 1 K 2 K 3 K 4 .Donc :ß = 1 / ( + [NH 3 ] K 1 + [NH 3 ] 2 K 1 K 2 + [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 + [NH 3 ] 4 K 1 K 2 K 3 K 4 )ß 1 = [NH 3 ] K 1 / (1 + [NH 3 ] K 1 + [NH 3 ] 2 K 1 K 2 + [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 + [NH 3 ] 4 K 1 K 2 K 3 K 4 )- 120 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….ß 2 = [NH 3 ] K 1 K 2 / (1 + [NH 3 ] K 1 + [NH 3 ] 2 K 1 K 2 + [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 + [NH 3 ] 4 K 1 K 2 K 3 K 4 )ß 3 = [NH 3 ] K 1 K 2 K 3 / (1 + [NH 3 ] K 1 + [NH 3 ] 2 K 1 K 2 + [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 + [NH 3 ] 4 K 1 K 2 K 3 K 4 )ß 4 = [NH 3 ] K 1 K 2 K 3 K 4 / (1 + [NH 3 ] K 1 + [NH 3 ] 2 K 1 K 2 + [NH 3 ] 3 K 1 K 2 K 3 + [NH 3 ] 4K 1 K 2 K 3 K 4 )Les valeurs de ß 0 , ß 1 , ß 2 , ß 3 , et ß 4 sont déterminées pour différentes valeurs deconcentration en ion ammonium.• Pour une teneur en ammonium de l’ordre de 10µmol/L :ß 0 = 0.882 ; ß 1 = 0.1147 ; ß 2 = 3.67 10 -3 ; ß 3 = 29.35 10 -6 ; ß 4 = 3.82 10 -8 .On en déduit les teneurs en ions Cu 2+ , Cu(NH 3 ) 2+ , Cu(NH 3 ) 2+ 2 , Cu(NH 3 ) 2+ 2+3 , Cu(NH 3 ) 4 :[Cu 2+ ] = ß 0 C M = 176.4µmol/L = 88.2% du Cu 2+ total.[Cu(NH 3 ) 2+ ] = ß 1 C M = 22.9µmol/L.[Cu(NH 3 ) 2+ 2 ] = ß 2 C M = 0.73µmol/L[Cu(NH 3 ) 2+ 3 ] = ß 3 C M = 5.9nmol/L[Cu(NH 3 ) 2+ 4 ] = ß 4 C M = 7.6pmol/L.Parmi les quatre formes de complexes, celui qui prédomine est le Cu(NH 3 ) 2+ avec unpourcentage égal à 96.88%.• Pour une teneur en ammonium de l’ordre de 100µmol/L :Les pourcentages de formation des ions Cu(NH 3 ) 2+ , Cu(NH 3 ) 2 2+ , Cu(NH 3 ) 3 2+ , Cu(NH 3 ) 42+sont respectivement égaux à 74.1, 23.7, 1.2 et 0.24%.On peut conclure que pour l’intervalle de concentrations choisi, la forme ducomplexe dominant est le Cu(NH 3 ) 2+ et que les réactions qui se produisent lors du dosagede l’ion NH 4 + sont :Cu 2+ + NH 3 Cu(NH 3 ) 2+ suivi de la réaction électrochimique suivante :Cu(NH 3 ) 2+ + 1 e - Cu(NH 3 ) + ouCu(NH 3 ) 2+ + 2 e - Cu + NH 3- 121 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….ammoniumII.3. Optimisation des paramètres qui interviennent dans la détermination de l’ionII. 3.1. Choix de la solution tamponPour des solutions standards d’ammonium de concentrations comprises entre10µmol/L et 100µmol/L et pour une teneur en cuivre (II) égale à 200µmol/L, deuxsolutions tampon de pH 10 sont testées : le tampon Borax et le tampon carbonate. Lepotentiel imposé est de -150mV/Ag/AgCl. La courbe représentant le courant de réductionde Cu(NH 3 ) 2+ , pour les deux solutions tampons en fonction de la concentration del’ammonium est illustrée dans la figure 4. Les courants représentés sont les moyennescalculées à partir de 8 courbes ampérométriques pour un temps t égal à 10 secondes.1.8Courant /µA1.61.41.21.00.80.6(1)(2)0.40.20.00 20 40 60 80 100 120[ammonium] / µMFigure 4 : Courant de réduction en fonction de la concentration de l’ammonium,électrolyte : (1) tampon carbonate 50mmol/L et (2) tampon borax 50mmol/L, le pH est 10et le potentiel imposé est de -150mV/Ag/AgCl.- 122 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….Les équations des deux courbes de calibration sont :I = (0.205± 0.038) + (0.0078 ±0.0012 C) avec R 2 = 0.995 pour le borax etI = (0.435 ±0.032) + (0.0120 ± 0.0009 C) avec R 2 = 0.997 pour le carbonateLe tampon carbonate apporte un gain de point de vue sensibilité et reproductibilité.Il présente en plus l’avantage d’être plus soluble que le tampon Borax.II.3. 2. Etude de l’influence du pHLe paramètre pH est très important dans la réaction. En effet, la présence de NH 4+ou NH 3 en solution dépend du pH. L’espèce NH 3 forme des complexes avec l’ion Cu 2+ sile pH du milieu est supérieur à 9.26.Nous présentons sur la figure 5 les voltamogrammes cycliques à l’électrode EPC ducomplexe cuivre-ammoniac dans des milieux de pH différents. Le pH varie de 8 à 11, lesmeilleures réponses en terme de forme et de hauteur de pic de réduction sont données parles trois courbes voltamétriques B, C et D relatives au pH 10, 9 et 8. Nous avons écarté lesvaleurs de pH à partir de 11. Nous avons par la suite restreint la zone de pH étudiée, ellevarie de 9.7 à 10.3 (zone de prédominance de la forme NH 3 ). En effet, en dehors de cetintervalle, il est difficile de mesurer le courant de réduction du complexe du fait que savaleur change continuellement. Nous avons représenté les réponses en ampérométrie dedifférentes concentrations en ammonium pour ces différents pH, sur l’électrode à pâte decarbone maintenue à -150mV /Ag/AgCl. Le tampon utilisé est le carbonate 50mmol/L. Lavaleur 9.7 donne des courants plus élevés que les deux autres valeurs de pH. Nous avonsaussi calculé la déviation relative standard, pour 8 électrodes à pâte de carbone, dans lestrois milieux (pH 9.7, 10.0 et 10.3), de 30 µmol/L d’ammonium. Nous avons trouvé que ceparamètre vaut respectivement 12.5, 8.7 et 20% si le pH du milieu électrolytique est de9.7, 10 et 10.3. Nous avons ainsi retenu le tampon carbonate pH 10 pour le reste de l’étudeen cours.- 123 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….i / A0.03x10-0.03x10-0.05x10-0.08x10-40-4-4-4i/A-4-0.10x10-0.400 -0.300 -0.200 -0.100 0 0.100 0.200 0.300 0.400E / V(A)-40.05x10-40.03x100-4-0.03x10-4-0.05x10-4-0.08x10-4-0.10x10i / A-4-0.13x10-0.400-0.300-0.200-0.100 0 0.100 0.200 0.300 0.400E / V(B)0.05x10-40.08x10-40.03x10-40.05x10-4-0.03x10-0.05x100-4-4i / A(C)0.03x10-0.03x10-0.05x10-40-4-4i / A(D)-0.08x10-4-0.08x10-4-4-0.10x10-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4E / V-4-0.10x10-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4E / VFigure 5 : Voltamogrammes cycliques, à l’électrode à pâte de carbone dans une solutiontampon carbonate 50mmol/L, de Cu 2+ 200 µmol/L ( ) et de Cu 2+ +200µmol/L + NH 41mmol/L ( ). (A) pH 11, (B) pH 10, (C) pH 9 et (D) pH 8. L’électrode de référence estune électrode Ag/AgCl (NaCl 3mol/L).- 124 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….II. 3.3. Effet de la force ioniqueSi on enregistre les variation des courants de réduction en fonction de laconcentration de NH + 4 , à un potentiel de -150mV/ Ag/AgCl et un pH de 10 pourdifférentes concentrations du tampon carbonate. Nous constations (figure 6) qu’une teneurde 50mmol/l permet d’avoir la meilleure sensibilité et une bonne linéarité.1.61.4(1)Courant / µA1.21.00.80.60.40.2(2)(3)0.00 20 40 60 80 100[Ammonium] / µMFigure 6 : Courbes de calibration pour différentes concentrations de la solution tamponcarbonate pH 10 : (1) 50mmol/L, (2) 100mmol/L et (3) 25 mmol/L; Eapp= -150mV/Ag/AgCl ; [Cu 2+ ]= 200µmol/L.II.3.4. Influence de la concentration du cuivreDans les mêmes conditions optimisées précédemment, nous avons représenté lescourants de réduction du complexe cuivre- ammoniac formé en fonction de laconcentration en ammonium pour différentes concentrations en cuivre (figure 7). Nousconstatons que ces courants de réduction augmentent au fur et à mesure que laconcentration en cuivre augmente. Pour des concentrations en cuivre supérieures à200µmol/L, un précipité se forme en solution avant l’ajout de NH + 4 . La teneur 200µmol/L- 125 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….est retenue pour la suite du travail afin d’assurer une bonne sensibilité et d’éviter laformation du précipité au sein de la solution à doser.Courant / µA1.81.61.41.21.00.80.60.40.2(3)(2)(1)0.00 20 40 60 80 100[Ammonium] / µMFigure 7 : Courant de réduction en fonction de la concentration de l’ammonium. Potentielappliqué : -150mV/ Ag/AgCl, tampon carbonate 50mmol/L pH 10. La concentration encuivre est de (1) 100µmol/L, (2) 150µmol/L et (3) 200µmol/L.II.3.5. Choix du potentiel appliquéUne étude ampérométrique a été aussi réalisée dans la gamme de potentiel compriseentre -200 et -75mV par rapport à l’électrode Ag/AgCl (voir figure 8).L’intervalle de potentiel variant entre -150 et -125 mV représente la gamme oùnous avons enregistré une bonne réponse de réduction du complexe cuivre- ammoniac entermes de stabilité et de sensibilité. Nous avons ainsi choisi la valeur -150mV pour réaliserla détermination de NH + 4 en présence des ions Cu 2+ .- 126 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….1.61.41.2[NH 4 + ] 25µM[NH 4 + ] 80µM[Cu 2+ ] 200µMCourant en µA1.00.80.60.40.20.0-200 -175 -150 -125 -100 -75Potentiel appliqué en mVFigure 7 : Hydrovoltamogramme enregistré à l’électrode à pâte de carbone pour dessolutions contenant : l’ion ammonium 25µmol/L et 80µmol/L dans un tampon carbonate50mmol/L pH= 10. [Cu 2+ ] = 200µmol/L.L’intervalle de potentiel variant entre -150 et -125 mV représente la gamme oùnous avons enregistré une bonne réponse de réduction du complexe cuivre- ammoniac entermes de stabilité et de sensibilité. Nous avons ainsi choisi la valeur -150mV pour réaliserla détermination de NH + 4 en présence des ions Cu 2+ .II.3.6. Caractéristiques analytiques de la méthode proposéeLa méthode développée est linéaire dans la gamme de concentration qui s’étend de10 à 100µmol/L de NH + 4 . L’équation de régression est la suivante :I = 0.435 + 0.012 C avec I est la valeur absolue du courant de réduction du complexecuivre – ammoniac formé, exprimé en µA et C est la concentration de l’ammonium enµmol/L. le coefficient de détermination vaut 0.997. La déviation relative standard de lapente est de 7.4% pour n = 12 courbes de calibration.La limite de détection est déterminée dans les conditions optimisées. Elle est égaleà 8µmol/L ce qui correspond au courant minimal mesuré (ordonnée à l’origine + 3SD) égalà 0.435 + 3 x 0.032= 0.536.- 127 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….III. Application : analyse des échantillons réelsPour l’analyse des échantillons nous aurons à préparer 10 fois la concentration dutampon désirée et nous effectuerons des dilutions avec l’eau à analyser qui est dans notrecas, l’eau du réseau de distribution.Nous avons ainsi jugé nécessaire de tester les performances de la méthodedéveloppée dans l’eau de robinet. Nous avons enregistré la courbe de calibration dans lesconditions optimisées auparavant, nous ajoutons ensuite des quantités d’ammonium à cetteeau et nous portons la réponse en courant sur la courbe. Les résultats sont rassemblés dansle tableau 1.Tableau 1 : Erreur relative en % calculée pour des quantités d’ammonium ajoutées à l’eaude robinet.Quantité ajoutée en µmol/L Quantité trouvée en µmol/L Erreur relative en %10 11.5 15.0020 25.02 20.0630 27.2 -10.2940 36.8 -8.6960 53.2 -12.7880 76.25 -4.9285 90.21 6.12Nous avons constaté à partir de ce tableau que pour des faibles quantités ajoutées enammonium, l’erreur relative est positive. On peut dire que la valeur trouvée dans cetintervalle est toujours supérieure à la valeur ajoutée. On doit par conséquent sélectionnerces échantillons et procéder à des investigations approfondies si cela est nécessaire. Pourles teneurs supérieures à 20µmol/l, l’erreur relative est souvent négative. Ces échantillonsprésentent des concentrations qui dépassent la norme fixée pour l’eau de robinet (0.5mg/lce qui est équivalent à 27.7µmol/l de NH + 4 ). Par conséquent, des mesures d’urgences’imposent pour réduire cette pollution.- 128 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….IV. ConclusionLe but de ce travail était de faire une étude préliminaire afin de mettre au point uneméthode performante pour la détection électrochimique de l’ion ammonium dans une eaude consommation. Nous avons donc élaboré une méthode originale basée sur la réaction decomplexation de cet ion avec le cuivre en milieu basique. Ainsi, les performancesanalytiques de la technique ont été étudiées après avoir optimisé les paramètres quiinterviennent lors de la réaction de complexation.Cette méthode est développée pour être employée sur le terrain, avec ses moyensréduits et sa simplicité de mise en œuvre. La conservation des réactifs pré- optimisés se faità température ambiante, le nombre de réactifs est réduit au strict nécessaire. Ainsi sur siteet en quelques minutes, une estimation approximative globale de la concentration de l’ionammonium est fournie.- 129 -

Chapitre VINouvelle méthode de dosage de l’ionammonium….Réferences[1]. M. Berthelot, Repert. Chem. Applique 1, 1859, 284.[2]. M. Van Son, R. C. Schothorst, G. Den Boef, Anal. Chim. Acta 153, 1983, 271.[3]. U. Bartels, Chemie Labor Biotech. 42, 1991, 377.[4]. M. E. Meyerhoff, Anal. Chem. 52, 1980, 1534.[5]. M. E. Meyerhoff, R. H. Robins, Anal. Chem. 52, 1980, 2383.[6]. L. Campanella, M. P. Sammartino, M. Tomassetti, Analyst 115, 1990, 827.[7]. A. K. Abass, J. P. Hart, D. C. cowell, A. Chappell, Anal. Chim. Acta 373, 1998, 1.[8]. Y. Ikariyama, W. R. Heinemann, Anal. Chem. 58, 1986, 1803.[9]. M. Trojanowicz, T. Krawczynski Vel Krawczyl, M. Zmorzynska, L. Campanella,Electroanalysis, 9, 1997, 1062.[10]. J. G. Dick, Analytical Chemistry, Part 4: Complexation equilibria. Internationalstudent Edition, 1973, p 161.- 130 -

Conclusion généraleCONCLUSION GENERALE- 131 -

Conclusion généraleAu cours de ce travail, nous avons développé des méthodes analytiques innovantesreposant sur des réactions de complexation de l’élément à doser pour l’analyse des ionsphosphates, nitrites/ nitrates et ammonium.Ces méthodes répondent bien aux critères d’une technique d’analyse performante :‣ Des limites de détection comparables à celles trouvées dans la littérature parfoisplus faibles permettant ainsi de réaliser des analyses dans des milieux complexessans traitements préalables des échantillons‣ Mise en œuvre simple‣ Coût faible‣ Rapidité (surtout en analyse BIA, nous arrivons à analyser 120 échantillons parheure dans le cas du dosage du nitrite)‣ Bonne sélectivité.‣ Analyse sur site : Avec les équipements modernes miniaturisés dont nousdisposons (Palm Sens), ces techniques fonctionnant à température ambiante sontprêtes pour leur utilisation sur le terrain permettant ainsi des analyses de contrôleet de surveillance.‣ Reproductibilité : les déviations relatives standard calculées au cours des analysesfaites ne dépassent généralement pas 5%.Les valeurs de concentrations obtenues dans les échantillons choisis sont comparables àcelles trouvées par des méthodes spectrophotométriques de référence.La technique BIA a apporté beaucoup d’améliorations de point de vue sensibilité,simplicité, rapidité avec une très faible consommation de produits..Nous pouvons envisager des orientations ultérieures de ce travail :Pour améliorer encore la sensibilité des méthodes développées pour l’analyse desions PO 3- -4 , NO 2 et NH + 4 et pour pouvoir faire des applications dans des milieux pluscomplexes tels que les fluides biologiques et les produits alimentaires, nous adopterons lastratégie destinée à modifier l’électrode à pâte de carbone. Notre choix porte sur cetteélectrode parce qu’elle offre la possibilité d’incorporer l’agent modifiant au sein de la pâte.- 132 -

Conclusion généraleDans ce sens, nous envisageons de développer des techniques de dosage des ionsnitrites et nitrates en utilisant des électrodes à pâte de carbone modifiée. Nos recherchessont en cours sur le choix d’agents modifiants adéquats. A titre d’exemple, le chélate deCu(I) néocuproïne incorporé à la pâte de carbone forme des paires d’ions avec les ionsnitrites et nitrates.Pour l’analyse de l’ammonium, des essais sont en cours. Le monoxyde de cuivreCu 2 O mélangé à la pâte de carbone avec des proportions étudiées, donne des résultatsencourageants.- 133 -

ANNEXEListe des travaux et articlesPublications1- Investigation of amperometric detection of phosphate. Application in seawater andcyanobacterial biofilm samples, Talanta, 63, 567-574, 2004.2- Lead determination by anodic stripping voltammetry using a p- phenylenediaminemodified carbon paste electrode, Electroanalysis , 17, n° 8, 685-693, 2005.3- Electrochemical Detection of nitrite based on reaction with 2,3-Diaminonaphthalène, Analytical Letters, 38, 1943- 1955, 2005.4- Nitrates et nitrites: Polluants qui menacent la santé et l’environnement, LesTechnologies de Laboratoire, n° 1, 10- 14, 2006.Communications orales:1- Workshop on Electrochemistry and Interfacial Chemistry in Environmental Clean-upand Green Chemical Processes; Coimbra, Portugal, 6 – 7 Avril 2001 (L5).2- 4 th Mediterranean basin Conference on Analytical Chemistry, Portoroz, Slovenia. 15 –20 septembre 2002 (O49).3- 3 ème Rencontre Nationale d’Electrochimie, Kénitra, Maroc. Le 02 et le 03 décembre2004 (CO28).4- 3 ème Rencontre Nationale d’Electrochimie, Kénitra, Maroc. Le 02 et le 03 décembre2004 (CO24).Communications par affiches :1- La deuxième rencontre Nationale sur l’Electrochimie, Casablanca. 17 et 18 octobre2002.2- Biosensors for Food Safety and Environmental Monitoring, Marrakech. 9 – 11 octobre2003.

3- The first international symposium on the management of liquid and solid residues(MALISORE), Mohammedia, 26 et 27 avril 2004.4- The 8th International Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry, Rome, Italie,8- 10 Juillet 2004.5- Second International Workshop, Biosensors for Food Safety and EnvironmentalMonitoring, Agadir, 10- 12 Novembre 2005.6- 4 ème Rencontre Nationale d’Electrochimie, Tétouan, 2- 3 Juin 2006.

ANNEE : 2006 NUMERO D’ORDRE 2322DOCTORAT D’ETATTitre de Thèse : Etude et développement de nouvelles méthodes électrochimiques pour ladétermination des ions : orthophosphate, nitrite, nitrate et ammonium.NOM PRENOM : IDRISSI LailaDISCIPLINE : ChimieSPECIALITE : Chimie AnalytiqueRESUMECe travail porte sur le développement de nouvelles méthodes électrochimiques dedétermination des ions NO 2 - , NO 3 - , PO 4 3- et NH 4 + . Ces méthodes reposent sur des réactionschimiques de complexation et sur une analyse électrochimique indirecte de l’élément à doser.Les ions concernés sont souvent soit non électroactifs soit présentent une réponse en courantsituée à des potentiels élevés où les réponses des espèces interférentes apparaissent. Par unchoix judicieux de l’électrode de travail, de l’électrolyte support, du pH et par l’optimisationdes paramètres des réactions chimiques et l’utilisation d’une instrumentation portative, il nousa été possible de réaliser des déterminations sensibles, sélectives et applicables sur le terraindes ions en question.La première partie de ce travail a été consacrée à la détection ampérométrique desorthophosphates. Le complexe phosphomolybdique formé par addition du molybdated’ammonium et du phosphate en milieu acide est réduit électrochimiquement. Une limite dedétection égale à 0.2µmol/L est atteinte.Dans la deuxième partie, l’ion nitrite est mesuré en se basant sur sa réaction en milieuacide avec le 2,3-diaminonaphthalène (DAN) et sur l’oxydation électrochimique de cedernier. Le pourcentage de diminution du signal du DAN est proportionnel à la concentrationde l’ion nitrite. Les résultats ont montré une fréquence d’analyse de l’ordre de 120échantillons en adoptant la technique d’analyse par injection directe en milieu batch (BIA).Cette même méthode proposée pour l’analyse des nitrites a été légèrement modifiéepour être coupler avec une colonne de cadmium / cuivre. Cette dernière sert pour réduirechimiquement les nitrates en nitrites. Les conditions de la réaction de réduction ont étéoptimisées ce qui nous a permis de dépasser 95% en rendement de conversion NO 3 - /NO 2 - etde détecter 0.5µmol/L de nitrate.Un détecteur ampérométrique a été par la suite développé dans le but de ladétermination de l’ion ammonium. Ce détecteur est basé sur la réaction de NH 4 + et des ionsCu 2+ en milieu basique. Les résultats préliminaires de cette étude sont présentés et discutés.MOTS-CLEFS : Techniques électrochimiques, orthophosphate, nitrate, nitrite, ammonium,électrode à pâte de carbone, BIA.