LES RECEPTEURS IONOTROPIQUES - CRN2M

Master de Neuroscience.Parcours moléculaire et cellulaire.LES RECEPTEURSIONOTROPIQUESFabien TELL Année 2009-2010 1

terminales sont extracellulaire (Nicotinique, GABA, Glycine, 5-HT), la superfamille des récepteursau glutamate et la superfamille des récepteurs à l'ATP. (voir annexe I).Dans, nous commencerons par voir brièvement la structure protéique des différentes famillespuis nous focaliserons sur les propriétés fonctionnelles de certains récepteurs, notamment lesrécepteurs pour la glutamate et les récepteurs pour la glycine ou le GABA.II.Structure générale des récepteurs ionotropiques.2.1Structure générale.Les récepteurs ionotropiques sont des assemblages de plusieurs protéines appelées sousunités.Pour chaque famille de récepteurs, les sous-unités qui les composent partagent une structurecommune et sont au nombre de 3 à 5. On parle donc de trimère, tétramère ou pentamère. Pourchaque famille de récepteurs, les sous-unités peuvent être identiques (homomères) ou différentes(heteromères).Fabien TELL Année 2009-2010 3

2.2 L'exemple du récepteur à la nicotine : l'archétype de la famille cys-loop.Le récepteur nicotinique est le récepteur canal qui est activé par l'acétylcholine au niveau dela jonction neuromusculaire chez les mammifères mais aussi au niveau des synapses centrales. Lafixation de l'ACH provoque son ouverture et une entrée d'ions positifs (cations) dont l'effet estdépolarisant. Sa caractérisation physiologique et biochimique ont d'abord été réalisées au niveau dela jonction neuromusculaire et au niveau de l'électroplaque des poissons électriques (gymnote,torpille) ou la densité de récepteurs est extrêmement importante.Chaque électroplaque comporte des terminaisons nerveuses reliées à des fibres musculairesmodifiées et fonctionne comme un condensateur électrique. Les électroplaques, s'associent ensuiteen parallèle pour constituer les organes électriques. Une raie posséderait 10000 électroplaques parorgane électrique, il y en aurait 18000 pour une torpille et 420000 pour le gymnote (anguilleélectrique des eaux douces d'Amérique du Sud). Ainsi de petites différences de potentiel produitespar l'influx nerveux entre les deux faces d'une électroplaque s'ajoutent (de l'ordre de 120 à 150millivolts à chaque fois), ce qui permet d'aboutir à une décharge globale très importante de plusieursdizaines de Volts.2.2.1 Caractéristique du récepteur cholinergique.En situation de potentiel imposé, la stimulation d'un nerf ou l'application d'acetylcholineprovoque l'activation des canaux cholinergiques et l'apparition d'un courant ionique. Selon lepotentiel que l'on impose à la cellule musculaire, on observe soit un courant entrant soit un courantsortant. Le potentiel pour lequel le courant cholinergique s'annule est le potentiel d'inversion.Vm= +40 mVVm= -120 mVVm = 0 mVFabien TELL Année 2009-2010 4

Si on trace la relation courant-potentiel10050Courant (pA)0-50-100-150-200-150 -100 -50 0 50 100Potentiel (m V)Le potentiel d'inversion pour le sodium est de + 50 mV et celui du potassium est de -80 mV. Lecanal cholinergique est donc perméable à la fois au deux ions car son potentiel d'inversion se situeentre ces deux potentiels.L'application prolongée d'ACH sur son récepteur conduit à sa fermeture et à la perte ducourant cholinergique. On parle de désensibilisation. Le canal est dans un état fermé non conducteurmais il ne peut pas être activé de nouveau par une nouvelle application d'ACH. Il faudra attendre uncertain temps pour qu'il y ait récupération.La vitesse de désensibilisation et la durée de récupération suite à une désensibilisation sont desparamètres qui permettent de caractériser les propriétés des récepteurs ionotropiques. Au niveau dela jonction neuromusculaire les effets de la désensibilisation sont utilisés en chirurgie. L'applicationprolongée d'un analogue de l'ACH, la succinylcholine désensibilise les récepteurs cholinergiques etprovoque la relaxation musculaire. Autre exemple, certaines myasthénies sont provoquées par undéficit en nombre de récepteurs cholinergiques au niveau de la jonction neuromusculaire. Letraitement consiste à limiter la dégradation de l'ACH en bloquant ces enzymes de dégradation pourpallier le faible nombre de récepteurs. Cependant, un traitement trop poussé peut entraîner une suractivationdes récepteurs restants et donc leur désensibilisation ce qui est l'inverse de l'effetrecherché.2.2.2. Pharmacologie du récepteur nicotinique.Divers agonistes sont capables de se lier au récepteur cholinergique de type nicotinique.L'agoniste naturel est l'acétylcholine mais il existe des agonistes synthétiques comme le carbachol,la suberylcholine ou encore le tetraméhyl ammonium. L'affinité des ces différents agonistes permetde définir le profil pharmacologique du récepteur. Par exemple au niveau de la jonctionFabien TELL Année 2009-2010 5

neuromusculaire la suberylcholine est plus affine que l'ACH, elle-même supérieure au carbachol,supérieur au TMA.NicotineSuberylcholineACH CarbacholTMALa différence de profil pharmacologique d'affinité permet der distinguer différents types derécepteurs. Cette distinction est encore plus marquée si on utilise des antagonistes. Par exemple, lecurare est un antagoniste compétitif au niveau de la jonction neuromusculaire mais il est inefficaceau niveau central. Inversement l'hexaméthonium est un antagoniste compétitif au niveau centralmais pas au niveau périphérique. Ces différences de profil pharmacologique suggèrent que lescompositions moléculaires des récepteurs cholinergiques nicotiniques sont différentes.2.2.5 Caractérisation biochimique du récepteur cholinergiqueLa purification du récepteur cholinergique a été effectué à partir de l'organe électrique deraie. Pour cela à partir d'un homogénat de tissu, les récepteurs cholinergiques sont marqués grâce àleur liaison très forte à une toxine l'alpha-bungarotoxine. Cette toxine est au préalable marquéeradioactivement ce qui permet de suivre les récepteurs au cours de leur purification parfractionnement (en fonction du PM) et sur colonnes d'affinité (par liaison sur un agonistenicotinique). La protéine ainsi isolée à un poids moléculaire d'environ 250 000 Da 2 . L'utilisation dedétergents a permis de montrer que cette protéine se dissociait en quatre sous-unités différentes.2 Un dalton est égal à 1,64 10 -24 g soit la masse d'un atome d'hydrogène. On parle souvent de Kilodalton (Kda).Fabien TELL Année 2009-2010 6

Les différentes sous-unités sont assez proches en terme de structure moléculaire. En particulier si onétudie leur profil d'hydrophobicité, on constate qu'elles possèdent toutes quatre segments composésmajoritairement d'acides aminés fortement hydrophobes. Cela suggère que ces segments ont unelocalisation membranaire à l'intérieur de la bicouche lipidique. Les segments M3 et M4 étantséparés par une boucle intracellulaire. Le premier site est le peptide signal pour l'adressage à lamembrane.Parmi ces sous-unités seule la sous-unité alpha présente une affinité pour l'ACH. Le site de liaisonse situe sur la partie N terminale extra-cellulaire.Parmi les segments transmembranaires le segments M2 possède une partie relativementhydrophyle conservée entre les différentes sous-unités. Cela suggère que l'assemblage des 5 sousunitésen rosette pourrait permettre de former un pore ionique rempli d'eau dont les parois sontformés par les 5 domaines trans-membranaires M2.Enfin les études en microscopie électronique sur les récepteurs de plaque électrique de poissonFabien TELL Année 2009-2010 7

torpille ont permis de confirmer cette structure en rosette composée de 5 sous-unités.2.3 Le récepteur nicotinique neuronalLa découverte et la caractérisation des récepteurs nicotiniques musculaires a ouvert la voie à lacaractérisation des autres récepteurs ionotropiques. Dans un premier temps en postulant que lesrécepteurs qui lie l'acetylcholine au niveau du cerveau doivent ressembler aux récepteursmusculaires, il a été possible par clonage de mettre en évidence des nombreuses sous-unités prochesstructurellement des sous-unités musculaires. Ces sous-unités ont été divisée en deux classes : lessous-unités alpha qui ressemblent à celle du muscle et numérotées de 2 à 9 (la première α-1 étant lamusculaire) et 3 sous-unités de type β présentant des analogies avec la sous-unité β du muscle etnumérotées de 2 à 4. Un canal ionotropique nicotinique est donc formé au niveau neuronal de 2sous-unités α et de 3 sous-unités β. Il va donc être possible de trouver des canaux nicotiniques trèsdiverses en fonction de leur composition en différentes sous-unités.2.3.1. Caractéristiques des différentes combinaisonsLa combinatoire des diverses sous-unités prévoit plus de 1000 formes possibles pour unrécepteur nicotinique. En fait, les travaux de neuroanatomie associée à des marquagesimmunohistochimique montrent que la diversité est beaucoup moins grandes. On compte en fait uneFabien TELL Année 2009-2010 8

dizaine de canaux possibles existant réellement. La plupart sont composés de deux sous-unités α etde 3 sous-unités β. Cependant, il est possible d'obtenir un canal fonctionnel avec seulement 5 sousunitésα 7. En fonction des combinaisons, les canaux ont des propriétés différentes tant au niveaubiophysique qu'au niveau pharmacologique.En particulier, ces canaux ont une perméabilité au calcium bien plus importante que les canauxmusculaires. Ils sont en général de 1 à 1,5 fois plus perméable au calcium qu'au sodium. Pour lecanal homomérique α7 la perméabilité au calcium est même 20 fois plus grande que celle ausodium. La résultante de cela étant un potentiel d'inversion plus positif que celui des récepteursmusculaires (E CA2+ = -150 mV). Par ailleurs leur temps d'ouverture et leur conductance variefortement en fonction des assemblages. Enfin seule la sous-unité α7 est capable de lier l'αbungarotoxine.Ces particularités vont conditionne leurs rôles physiologiques.La distribution des différentes combinaisons apparaît très hétérogène au niveau du SNC.2.3.2. Rôles physiologiques des canaux nicotiniques neuronaux.Fabien TELL Année 2009-2010 9

Malgré l'abondance des canaux nicotiniques au niveau du cerveau, il est apparu qu'il existaittrès peu de réponses synaptiques, au niveau central, imputables aux récepteurs nicotiniques. Parailleurs, leur forte perméabilité au calcium laissait penser qu'ils pouvaient jouer un rôle au niveaupré-synaptique pour contrôler la libération des neurotransmetteurs.La première démonstration fût apportée au niveau de la synapse glutamatergique entre lesneurones de l'habénula et les neurones du noyau interpédonculé. Au niveau de cette synapse,l'aplication de nicotine augemente la taille de la réponse synaptique excitatrice due au glutamate.Inversement l'ajout d' α-bungarotoxine diminue la transmission synaptique. En effet, l'activationpré-synaptique du récepteur permet d'augmenter la concentration en calcium au niveau de laterminaison et d'augmenter ainsi la libération.Sans nicotineAvec nicotineL'acétylcholine serait donc un modulateur de l'excitabilité au niveau central. Cet effet a étédémontré aussi bien au niveau des synapses inhibitrices et excitatrices. Par exemple, la forteprésence des récepteurs nicotiniques au niveau des zones impliquées dans le comportementémotionnel du cerveau comme les aires limbiques serait à mettre en rapport avec l'effet de lanicotine et sa dépendance.En fit d nombreuses études ont montré que les récepteurs nicotiniques pré-synaptiquesétaient capables de controller la libération de nombreux neurotransmetteurs au niveau du SNCFabien TELL Année 2009-2010 10

L'étude de souris modèle pour lesquelles certaines sous-unités de récepteurs nicotiniques apermis de mettre en évidence le rôle de ces récepteurs ou plutôt de leur absence dans certainespathologies ou comportements.Ces résultats permettent d'envisager la création d'agents pharmacologiques sélectives pourtelles ou telles combinaisons qui pourraient être efficace d'un point de vue thérapeutique.Fabien TELL Année 2009-2010 11

2.4. Les récepteurs GABA et Glycine sont des canaux anioniques (Cl-)2.4.1 Structure de récepteur GABALa démarche suivie pour caractériser le récepteur GABA est la même que celle suivie pourle récepteur nicotinique. On dispose ne effet des ligands spécifiques des ces récepteurs qui sont lesbenzodiazépines. A partir de la purification de cette protéine, il a donc été possible de mettre enévidence différentes sous-unités puis d'en déterminer partiellement la composition en acides aminés.Ceci a permis de synthétiser des sondes d'ADN spécifiques et ainsi de cloner les différents gènescodant pour les différentes sous-unités.Ces travaux ont permis de mettre en évidence que le récepteur GABA de type A (GABA A )possédait 5 sous-unités. On retrouve pour chaque sous-unité une organisation en quatre domainestransmembranaires M1-M4, le segment M2 constituant les parois du pore ionique par lequel lechlore se déplace . Pour ce récepteur, il existe 4 types de sous-unités classées sous les noms de α, β,γ, δ. Ces sous-unités ont au moins 50 % d'homologie. Dans chaque groupe il y a plusieurs variantesou isoformes : δ1-6, β1-4, γ1-4 et δ.D'une manière générale, un récepteur GABA A est composé de deux sous-unités α, deuxsous-unités β et une sous-unité γ ou δ.2.4.2 Physiologie du récepteur GABA ALe canal GABA A est un canal anionique c'est-à-dire laissant passer le chlore. Dans lesconditions physiologiques le chlore est plus concentré à l'extérieur des cellules qu'à l'intérieur, il vadonc rentrer dans la cellule et la rentre plus négative. Les canaux GABA sont responsables despotentiels postsynaptiques inhibiteurs (PPSI) dans de nombreuses synapses du cerveau.Son potentiel d'inversion est généralement autourαβde -60 mV.Fabien TELL Année 2009-2010 12

D'une manière générale, tous les canaux GABA possèdent deux sites de liaisons pour le GABA quisont localisés à l'interface des sous-unités α et β.Pore ioniqueEn fonction de la combinaison en sous-unités le récepteur GABA va présenter des différencesphysiologiques et surtout pharmacologiques.2.4.2.1. Site des benzodiazépinesLa liaison des BZD sur les récepteurs GABA est sans effet. Par contre la réponse au GABAva être accrue en présence de diazépam (Valium). Ceci confère une grande sécurité à l'utilisation desces drogues car elle n'agissent que si le récepteur est activé. Au niveau moléculaire le site qui va lierles BZD se situe entre la sous-unité α et la sous unité γ. Cependant en fonction du sous type de sousunitéα , la sensibilité aux BZD va être différente. Par exemple si la sous-unité α1 est présente lerécepteur GABA est très sensible au Zolpidem par contre il y est peu ou pas sensible si c'est la sousunitéα2-3 ou α5. Il existe également une sous-unité, récemment découverte appelée ε, qui associéeaux sous-unités α et β rend le récepteur GABA insensible aux BZD. Par exemple, il a été montrérécemment que les récepteurs GABA localisés dans les régions qui contrôlent le réflexe cardiomodérateuret vaso-dé presseur sont majoritairement formés avec la sous-unité ε. Effectivement, lescourants Gabaergiques enregistrés au niveau des neurones du NTS (une région d'intégration desafférences cardiovasculaire) ne sont pas sensibles aux BZD alors qu'ils sont bloqués par lesFabien TELL Année 2009-2010 13

arbituriques.CDZ: chlordiazepoxide; PentobarbitalEn corollaire, l'injection de BZD dans le NTS n'affecte pas la bradycardie provoquée par uneaugmentation de pression en périphérie par augmentation artificielle de la pression de perfusion.2.4.2.2 Site des barbituriquesLes barbituriques sont utilisés depuis 1912 contre les crises d'épilepsie avec le phénobarbitaltoujours utilisé aujourd'hui. Les barbituriques ont les mêmes effets que les BZD mais agissent surun site différent. A noter que si généralement les récepteurs GABA sont sensibles aux barbituriques,il existe des différences de sensibilité dues aux différentes compositions en sous-unités.2.4.2.3Autres sitesLe récepteur GABAa est également modulé de manière positive par l'éthanol ce qui expliquelargement son effet sédatif. Les stéroïdes sont également capables d'amplifier l'effet du GABA enaccroissant sa liaison sur son récepteur. Le site stéroïde est un site spécifique qui pourrait être unecible pour des stéroïdes endogènes. L'alphaxalone, un anesthésique d'induction, a été développé surce principe. C'est un stéroïde ((3 alpha,5 alpha)-3-hydroxyprégnane-11,20-dione ) dont l'actionsédative agit en activant ou en modulant sélectivement les récepteurs pour le GABA.Fabien TELL Année 2009-2010 14

2.4.4 Le récepteur pour la Glycine.Le récepteur Glycine a la même structure que les récepteurs précédents. C'est un pentamèreet chacune des 5 sous-unités(2 α et 2 β et une ε ou δ) possèdent 4 segments trans-membranaires. Cetassemblage forme un canal perméable au chlore dont la localisation est principalement synaptique.C'est le neurotransmetteurs inhibiteurs du cerveau postérieur (bulbe rachidien + moelle épinière).Son antagoniste principal est la strychnine. Ces agonistes endogènes pourraient être outre la glycine,la taurine ou la β-alanine.Au cours de la maturation la sous-unité foetale α2 est progressivement remplacée par unesous-unitéα1. De même la sous-unité ε est remplacée par la sous-unité δ. Il s'ensuit une forteréduction de la durée des évènements synaptiques inhibiteurs au niveau de la moelle épinière. Ladurée d'ouverture de canaux Glycine foetaux est en effet plus longue que celle des canaux adulte.D'un point de vue pathologique, on sait que des mutations de la sous-unité α1 sont à l'origined'un phénotype spasmodique récessif chez la souris et de l'hyperkplexie chez l'homme, maladiehéréditaire dominante pour laquelle il y a un tonus et de réflexes musculaires exagérés par un défautd'inhibition. Au niveau du récepteur pour la Glycine, on, observe une très forte baisse d'affinité pourla Glycine (plus de 100 fois) ce qui empêche ou réduit fortement l'activation du récepteur.2.4.5 Adressage des récepteurs.Une des propriétés importantes pour la physiologie des récepteurs ionotropiques va être leurlocalisation sub-cellulaire. On a vu par exemple que les récepteurs nicotiniques centraux étaientlocalisée principalement au niveau des terminaisons pre-synaptiques et contrôlaient ainsi lalibération des neurotransmetteurs. La notion d'adressage des récepteurs est donc particulièrementimportante dans la mesure ou une fois synthétisé dans le Golgi les protéines qui vont former lesrécepteurs ionotropiques ne vont pas se distribuer au hasard dans les cellules. Il existe unphénomène précis d'adressage des protéines qui va permettre le ciblage des récepteurs ionotropiquesdans des régions spécifiques des cellules nerveuses.Parmi les protéines responsables de l'agrégation des récepteurs GABA et glycine, lagepherine semble jouer un rôle majeur. La gepherine est un trimere qui est capable de lier la sous-Fabien TELL Année 2009-2010 15

unité bêta des récepteurs glycine. En fait toutes les récepteurs glycine synaptiques sont associés avecla gephyrin. Pour les récepteurs GaBA, l'image est plus complexe. Si l'on inactive la gephyrin (KO),l'agrégation des récepteurs GABA est perturbé à certaines synapses. Si on affecte les recepteursGABA contenant la sous-unité gamma2 ou alpha-2, la gephyrin disparait des synapses quiexprimaient ce type de recepteurs GABA et s'exprime en dehors des synapses. Par ailleurs, lesrecepteurs GABA qui comportent la sous-unité alpha-4 ou alpha-5 ne s'associent pas à la gephyrinet sont localisés en dehors de synapses. Ainsi en fonction de la composition moléculaire desrécepteurs GABA, l'interaction avec la gephyrin sera altérée et la localisation sera synaptique ouextra-synaptique.D'un point de vue fonctionnel, la présence de récepteurs extra-synaptiques favorisent leur activationcontinue ou tonique par le GABA extracellulaire et sont responsables d'une inhibition permanenteen opposition avec l'inhibition phasique que l'on observe lors des courants synaptiques inhibiteurs.Par ailleurs en fonction de la présence de certaines sous-unités, l'interaction des récepteurs GABAavec la gephyrin est labile ce qui fait qu'il peut y avoir en permanence ou suit à un signalphysiologique un passage des récepteurs du compartiment synaptique au compartimentextrasynaptique et vive-versa. Cela permet de modifier rapidement l'efficacité des synapsesinhibitrices.Fabien TELL Année 2009-2010 16

III.Les récepteurs pour le glutamate.3.1.Structure générale.Comme pour les autres canaux, les récepteurs liant le Glutamate sont formées des plusieurssous-unités. Le profil d'hydropathie (a) de chaque sous-unité est similaire et indique la présence d'unpeptide signal N-terminal hydrophobe nécessaire à l'adressage suivi d'une partie hydrophile puis detrois segments hydrophobes suivis d'un large boucle hydrophile et enfin un dernier segmenthydrophobes. La structure serait donc très proche de celle de la sous-unité α du canal nicotinique(b).En fait d'autres expériences ont montré que ce modèle ne pouvait s'appliquer pour ces sousunités.En effet les sites de phosphorylation situés sur la boucle 2-3 et la partie C-terminale nepeuvent être extracellulaire. De même des sites de glycosylation ont été observés sur la boucle 3-4et ils ne peuvent être qu'extracellulaire. Enfin, le segment trans-membranaire T2 n'est pascomplètement trans-membranaire (c).Cette famille de récepteurs possèdent donc une structure avec 3 segments trans-membranairevrais (T1, T3, T4) et les parties N et C terminale à l'extérieur de la cellule.Fabien TELL Année 2009-2010 17

3.2 Diversité des récepteurs ionotropiques pour le glutamate.Les récepteurs ionotropiques pour le glutamate ont été séparé en plusieurs groupes enfonction de leur affinité pour leur agoniste préférentiel. Ainsi on distingue les récepteurs AMPA 3 ,kaïnate et NMDA qui sont respectivement activés sélectivement par l'AMPA, le kaïnate ou leNMDA 4 .Récepteurs AMPA Kaïnate NMDAAntagonistescompétitifsAntagonistes noncompétitifsBloquant du canalCNQXNBQXGYKI(benzodiazépine)CNQXNBQXAPV ou D-AP5CPP7-ChlorokynurenateMK-801Ces récepteurs sont tous capables de lier le glutamate, sont tous perméables aux cations (Na+, K+)mais leur affinité pour le glutamate, leur durée d'ouverture et leur perméabilité pour le calciumpermet de les différencier.Ces récepteurs sont formés de l'association de 4 sous-unités. Chaque sous-famille présenteune diversité importante en sous-unités. Si l'on observe l'arbre d'homologie protéique on a:3 Acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 isolaxone propionique.4 Acide N-methyl-D-aspartiqueFabien TELL Année 2009-2010 18

3.2.1. Les récepteurs AMPALes récepteurs AMPA sont essentiellement des récepteurs responsables des potentiels postsynaptiques excitateurs. Ils sont donc généralement localisés au niveau de la densité post-synaptiquedes synapses excitatrices. Leur activation par le glutamate produit un courant cationique portégénéralement par le Na+ et le K+. Ce courant étant plus perméable au Na+, il possède un potentield'inversion au alentour de 0 mV et est donc dépolarisant.Fabien TELL Année 2009-2010 19

3.2.1.1 Structure moléculaireD'un point de vue moléculaire les 4 sous-unités qui composent le canal AMPA sont issuesde 4 gènes différents et sont nommées GluR1, GluR2, GluR3 et GluR4. Leur structure estcommune.Elles possèdent toutes un site d'épissage alternatif dit « flip-flop » au niveau de la boucle 3-4ainsi qu'un site d'édition (Q/R) au niveau du canal dans le segment TM2. Le glutamate se fixe entreles parties S1-S2. Au total un récepteur AMPA fixe 4 molécules de Glu.3.2.1.2 Physiologie des différentes combinaisons.3.2.1.2.1 Mécanisme et conséquences de l'éditionLa multiplicité des sous-unités (4) , leur variante d'épissage (2) ainsi que la possibilité d'unsite d'édition de chaque sous-unité offre un nombre de combinaisons possibles très important. Enfait l'édition ne se produit pas sur les sous-unités GLUR1, GluR3 et Glur4. Par contre elle se produitsur toutes les sous-unités GluR2.L'édition est un mécanisme post-transcriptionnel qui s'effectue au niveau du noyau sur l'ARNmessager non mature c'est à dire avant élimination des séquences introniques. L'action d'uneenzyme, l'adénosine dé-aminase, permet de dé-aminer l'adénosine d'un codon CAG le transformanten codon CIG. Cette transformation entraîne au niveau traductionnel le remplacement d'uneglutamine par une arginine.Fabien TELL Année 2009-2010 20

D'un point de vue fonctionnel, la présence d'une sous-unité éditée (Glur2) au sein d'unrécepteur AMPA bloque toute perméabilité calcique du canal. Par ailleurs en fonction du nombre desous-unités Glur2 présentes dans le tétramères, le canal AMPA sera plus ou moins sensible àl'action des polyamines (spermine, spermidine, putrescine...). Par exemple si 3 sous-unités ou plussont GLUR2, le canal sera calcium imperméable et polyamine insensible. Par contre si il y a uneseule sous-unité GluR2, le canal sera toujours imperméable au calcium mais sensible au polyamine.Enfin l'absence complète de sous-unités GluR2 rends le canal à la fois calcium perméable etpolyamine sensible.Action intracellulaire de la spermineFabien TELL Année 2009-2010 21

Action extracellulaire de la spermineLes polyamines bloquent le canal AMPA pour de valeurs de potentiel positives lorsqu'ellessont en intracellulaire. Elles ont aussi une action par la voie extracellulaire ou elles bloquent lescourants AMPA au potentiel de repos. D'un point de vue physiologique, les polyamines sontlibérées dans certaines conditions. En cas de crise d'épilepsie ou d'ischémie, elles sont libérées par laglie et les neurones. Leur rôle inhibiteur sur les canaux AMPA calcium-perméable pourrait réduireles flux calciques, protégeant ainsi les neurones d'une surcharge calcique.3.21.2.2.Phénomènes de désensibilisation et épissage alternatif.L'épissage d'un gène se produit pendant la maturation de l'ARN messager. Selon les exonsqui sont retenus on obtiendra deux protéines différentes pour un même gène ou une protéine avecdes parties différentes.Fabien TELL Année 2009-2010 22

3.2.1.2.3 Importance physiologique de la diversité des récepteurs AMPA dans le système auditif.L'énorme diversité potentielle des récepteurs AMPA due à la combinatoire des sous-unitéspose la question d'une part de l'existence réelle de ces différents possibles et d'autre part de leurséventuels rôles dans les phénomènes d'intégration synaptique. En effet, la présence ou non d'uneperméabilité calcique, la sensibilité au polyamines, les cinétiques d'activation de dé-activation et dedésensibilisation vont pouvoir modifier non seulement la durée des événements synaptiques maisaussi leur conséquence possible sur la métabolisme cellulaire via l'entrée de calcium.Par exemple, la durée d'un événement synaptique peut être contrôlée par plusieursmécanismes.Si le récepteur est rapidement désensibilisé, la sommation temporelle de deux événementssynaptiques ne pourra se faire que si ils sont quasi-coïncident. Un tel système permettra unediscrimination des hautes fréquences. A l'inverse si le récepteur est faiblement ou lentementdésensibilisé, la durée du temps de décroissance va être plus grande ce qui facilitera la sommationde deux événements synaptiques on synchrones mais réduira la discrimination de hautes fréquences.Au niveau du système auditif, il existe des cellules spécialisées dans la détection temporelledes sons (c'est à dire la discrimination de fréquence) et d'autres dans l'intégration de messagessensoriels provenant de différentes sources. Schématiquement on a:Fabien TELL Année 2009-2010 24

Les neurones qui reçoivent des informations directement du nerf auditif et vestibulaire doiventpouvoir discriminer des hautes fréquences. Les neurones impliqués dans l'intégration de différentessources (neurones de cartwheel) ont un rôle plus intégrateur.Si on mesure le tau de décroissance pour les courants excitateurs glutamatergiques, on observe:Les neurones de cartwheel ont des courants synaptiques plus lents. Si on s'intéresse à leurspropriétés de désensibilisation.Fabien TELL Année 2009-2010 25

Ces neurones désensibilisent très rapidement et possèdent donc des récepteurs riches en sous-unitésGluR1ou 4 flop.Ce groupe de cellule possèdent plutôt des récepteurs AMPA riche en Glur2. Ceci est confirmé enétudiant l'effet des polyamines intracellulaire sur la dépendance au potentiel des courants AMPA.On note ici une forte rectification donc pas de GluR2.Fabien TELL Année 2009-2010 26

Pour les cellules de Cartwheel , on note une relation linéaire qui indique la présence majoritaire dessous-unités GluR2.En conclusion, les cellules ne possédant pas de sous-unités Glur2 et des variants flop desautres sous-unités sont particulièrement adaptées à la discrimination des hautes fréquences (100µS). Les autres cellules jouent un rôle plus important dans la sommation de différentes sourcesd'information.3.2.2 Les récepteurs NMDA.Les récepteurs NMDA sont des canaux ioniques similaires aux précédents. Ils en diffèrentcependant par plusieurs caractéristiques: Ils sont fortement perméables au calcium, ils présententune forte sensibilité au potentiel, ils ne s'ouvrent que lorsqu'il y a une co-liaison de glutamate et deglycine sur de sites différents et ils présentent en outre de nombreux sites de régulation intra ouextracellulaire.3.2.2.1. Physiologie générale du récepteur NMDA.D'une manière générale, les récepteurs NMDA sont localisés au niveau des synapsesexcitatrices avec les récepteurs AMPA. Ils sont donc activés lors de la libération de glutamate parl'élément pré-synaptique. Un réponse post-synaptique excitatrice comporte dons une doublecomposante: celle due à l'activation des récepteurs AMPA et celle due à l'activation des récepteursNMDA.α. Le récepteur NMDA est bloqué par la magnésium au potentiel de reposFabien TELL Année 2009-2010 27

Une approche pharmacologique permet de distinguer les différentes composantes.Si on étudie, les réponses synaptiques àun potentiel suffisamment dépolarisé, on observeune double composante: une rapide bloquée parle CNQX (antagoniste AMPA) et une lente bloquéepar l'APV (antagoniste NMDA).L'application de NMDA dans un milieu contenant du Mgà un potentiel négatif ne donne pas un courant important.Sans Mg2+, le courant est débloqué.L'application exogène de NMDA permet également de caractériser la relation du courantNMDA avec le potentiel membranaire.Fabien TELL Année 2009-2010 28

On retrouve ici une relation quasi-linéaire en l'absence de magnésium ce qui indique que laconductance ou l'ouverture du canal NMDA est globalement insensible au potentiel. Cependant, sion rajoute du magnésium dans le milieu extracellulaire (conditions physiologiques), on observe uneforte réduction du courant NMDA pour des potentiels négatifs. Le canal NMDA devient doncpotentiel dépendant. Au niveau moléculaire, on observe ceci:β. L'activation du récepteur NMDA nécessite un co-agoniste comme la glycine ou la D-Fabien TELL Année 2009-2010 29

On distingue 5 types de sous-unités pour le récepteur NMDA: la sous-unité NR1 et quatresous-unités NR2 numérotées de A à B. Le récepteur NMDA fonctionnel est formé obligatoirementde deux sous-unités NR1 et de deux autres sous-unités prises parmi les sous-unités NR2.La sous unité NR1 est issue d'un seul gène mais peut présenter des variantes d'épissage auniveau de la partie N ou C terminale. Au total, on peut obtenir plus d'une dizaine d'isoformesdifférents. Ces variantes d'épissage modifient en particulier la sensibilité des récepteurs NMDA auPh ou leur interaction avec des protéines d'ancrage (maintien du récepteurs à la synapse) oud'adressage (transport du récepteur).Les sous-unités NR2 sont issues de 4 gènes différents et présentent toutes des variantesd'épissage sauf la sous-unité NR2A.En théorie, le nombre de combinaisons possibles est très important si on associe 2 sousunitésNR1 avec 2 sous-unités NR2. En fait, il semble que selon les régions du cerveau, le niveau dematuration ou la localisation cellulaire, on trouve des récepteurs NMDA formés de deux sous-unitésNR1 obligatoires et de deux sous-unités NR2 du même groupe. Néanmoins, les hétero-multiméresNR1-NR2A-NR2B ou NR2D sont également observés.Régionalisation des sous-unités NR2.Fabien TELL Année 2009-2010 31

Par exemple, ici en A est représentée la distribution de la sous-unité NR2A et en B NR2B.On observe que NR2A est bien exprimée dans le cervelet (CB) et est quasi-absente dans le striatum(S) alors que c'est l'inverse pour NR2B.Concernant les sous-unités NR2C et NR2D leur expression est encore plus localisée.En A, on observe que la sous-unité NR2C est uniquement exprimée dans le cervelet tandis que lasous-unité NR2D est observée uniquement dans le bulbe olfactif (G) et dans quelques noyaux dudiencéphale (P,P, paratenial and paraventricular-anterior nuclei; AV, anteroventral nucleus; ML,mediodorsal lateral nucleus: P. I. paraventricular-posterior and inter-mediodorsal nuclei; MC,medial geniculate; PC, periaqueductal gray).Fabien TELL Année 2009-2010 32

3.2.2.3. Propriétés biophysiques et pharmacologiques des différents assemblages de sous-unités.La sous-unité obligatoire NR1:Tous les récepteurs NMDA possèdent deux sous-unités NR1. Ces sous unités lient leglutamate. Il faut donc deux molécules de Glu pour activer pleinement un récepteur NMDA. Parailleurs le site de liaison de la glycine est localisé également sur la partie extracellulaire de la sousunitéNR1. On trouve aussi un site sensible au pH c'est à dire capable de lier les protons H+. Laliaison des protons a pour conséquence d'inhiber le fonctionnement du récepteur NMDA. On penseainsi qu'en cas d'hypoxie et d'acidose l'inhibition des courants NMDA serait une réponse deprotection pur limiter les entrées calciques. Cependant, certains variantes d'épissage de la sousunitésNR1 sont insensibles au pH et présente au contraire une sensibilité du même site (avec uneséquence différente) aux polyamines dont la liaison faciliterait au contraire le fonctionnement desrécepteurs NMDA. Sachant que les polyamines sont massivement libérées dans des conditionsd'ischémie-hypoxie, on aurait donc, dans une perspective fonctionnelle, une plus forte activation durécepteur NMDA ce qui n'est pas la réponse adaptée que l'on attend si on est finaliste. Il convientdonc de se méfier de toutes extrapolations rapides sur le rôle physiologique de la régulation dessous-unités, régulations souvent observées sur des modèles in vitro et pas toujours confirmées surun véritable organisme vivant.Les sous-unités NR2La plupart des récepteurs NMDA natifs peut être séparé en deux classes en fonction de leurconductance et de leur sensibilité au magnésium. On distingue ainsi les récepteurs à fortesconductances (50/40 pS) formés par l'assemblage des sous-unités NR1 et NR2A ou B et lesrécepteurs à plus faible conductance (40/20 pS) formés par l'assemblage des sous-unités NR1 etNR2C ou D. Ces derniers sont moins sensibles au blocage par le Magnésium (Voir Table I).Fabien TELL Année 2009-2010 33

On distingue aussi des récepteurs à dé-activation 5 rapide c'est à dire qui se fermeront plusrapidement et des récepteurs à dé-activation lente voire très lente. La présence de ces récepteurs auniveau synaptique vont influencer fortement la durée des composantes NMDA des PPSE. Parexemple, dans de nombreux neurones on observe au cours de la maturation des synapses unraccourcissement de la durée de la composante NMDA des PPSEs. Ceci est du à un remplacementdes sous-unités NR2B par les sous-unités NR2A.Ce changement de sous-unités s'accompagne également d'un changement de sensibilité de laréponse NMDA à un antagoniste spécifique des sous-unités NR2B qui est l'infenprodil. Cettesubstance est généralement utilisée comme un vasodilatateur périphérique et central en bloquent lesrécepteurs α-adrénergiques. Cependant depuis peu, il a été mis en évidence un effet de l'ifenprodilsur la sous-unité NR2B. Cette sous-unité possède en effet un site spécifique régulateur qui peut lierdes polyamines comme la spermine. Ce site lorsqu'il est activé augmente l'efficacité de cette sousunité.Ce site est bloqué de manière spécifique par l'ifenprodil.De ce fait, l'ifenprodil est testé comme médicament dans le traitement de la maladie de Parkinson.En effet, la perte du contrôle dopaminergique des neurones du striatum est associée avec uneexacerbation de l'activation de ses neurones par des synapses riches en sous-unités NR2B. Leblocage de ces récepteurs pourrait réduire l'activité des neurones striataux et ainsi réduire lessymptômes parkinsoniens.Par ailleurs, il apparaît que en fonction de la composition en sous-unités, le récepteur NMDA auraune localisation différente. Par exemple, les sous-unités NR2A et NR2B permettent l'adressage desrécepteurs NMDA à la synapse alors que les sous-unités NR2C ou D ne le permettent pas. Par voiede conséquence certains récepteurs NMDA auront vocation à répondre à la libération detransmetteurs au niveau synaptique tandis que d'autres, localisés en dehors des synapses, seront plusimpliqués pour « sentir » le niveau de glutamate ambiant dans le liquide interstitiel ou serontlocalisés au niveau des terminaisons axonales pour contrôler la libération de neurotransmetteurs.5 La dé-activation est le temps mis par le canal pour se fermer lorsque l'agoniste (le glutamate ou la NMDA) n'est pluslié au récepteur. Ne pas confondre avec la désensibilisation qui est l'inactivation du canal en présence continue del'agoniste.Fabien TELL Année 2009-2010 34

Table I. Physiologie du récepteur NMDA en fonction de ses sous-unitésConductanceunitaire (pS)Temps de déactivation(ms)Concentration deGlutamate pourl'effet semimaximum(µm)Concentration deMg2+ pour lademi-inhibition(µm)Perméabilitérelative auCa2+/Na+Concentrationd'ifenprodil pourla demi-inhibition(µm)Potentialisationpar chélation duZn (TPEN 1 µm)en %AdressagesynaptiqueNR1/NR2A NR1/NR2B NR1/NR2C NR1/NR2D50 50 20-40 20-40120 400 380 48002,8 1,2 0,9 0,42,4 2,1 14,2 10,211 17 8 ND161 0,47 ND >10300 7 ND NDOUI OUI NON NONNotez que dans les récepteurs natifs peuvent être formés de combinaisonsde différentes sous-unités NR2. Les propriétés sont alors intermédiairessauf pour l'adressage ou la présence de sous-unités NR2D empêchel'adressage synaptique.Fabien TELL Année 2009-2010 35

3.2.3. Les récepteurs KaïnateLes récepteurs Kaïnate sont relativement abondants dans le SNC. Néanmoins leurs rôlesphysiologiques sont mal connus. Le développement récent d'outils pharmacologiques spécifiques apermis cependant de préciser leur rôle dans le fonctionnement des synapses.3.2.3.1 Structure du récepteur KaïnateLes récepteurs Kainate sont codés à partir de cinq gènes différents dont les produits formentdeux familles de sous-unités. Le premier groupe est constitué par les sous-unités GLUR5, GLUR6,GluR7. Ces sous-unités présentent 80 % d'homologies entre elles et seulement 40 % avec les sousunitésAMPA. La encore, des variantes d'épissages dans les parties N ou C terminale augmentent ladiversité de ces sous-unités. Comme pour les sous-unités AMPA, il existe un mécanisme d'éditionau niveau du deuxième segment transmembranaire ou un arginine remplace une glutamine. Un autresite d'édition est également présent au niveau du premier site trans-membranaire. L'assemblage deces sous-unités permet de former des quadrimères dont l'affinité pour le kaïnate est de l'ordre de 70nM.Il existe eux autres sous-unités appelées KA1 et KA2 qui sont non éditées et n'ont pas devariantes d'épissages connues. Elles présentent un très forte affinité pour le Kaïnate d'environ 5 nM.Elles foremnt donc une famille distinctes de la première. Cependant des associations entre GLUR5-7 et KA1-2 sont possibles.3.2.3.2 Propriétés des différents assemblages.Mis à part leur forte affinité pour la kaïnate, les récepteurs Kaïnate présentent de nombreusessimilitudes avec celle des récepteurs AMPA :• Ce sont des récepteurs ionotropiques perméables aux cations sodium, calcium et potassium.• L'édition (Q/R) de la sous-unité GLUR6 rend le canal imperméable au calcium et insensible auxpolyamines.Fabien TELL Année 2009-2010 36

En haut en gauche, c'est un exemple d'une relation I/V des réponses au Kainate d'unrécepteur GLUR6 composé de sous-unité GLUR6 non- éditées à droite.En bas à gauche effet de le spermine intracellulaire sur la réponse d'un récepteur composé desous-unité GLUR6 non- éditées en fonction du potentiel.Une des différences avec les récepteurs AMPA est que la réponse au Kaïnate est trèsrapidement désensibilisée du moins pour les compositions de sous-unités GLUR5-6. Par contrel'association des sous-unités GluR avec des sous-unités KA1-2 donnent naissance à des canaux quideviennent sensible à la fois à l'AMPA et au Kaïnate et qui ne présentent pas de désensibilisation àl'AMPA.Fabien TELL Année 2009-2010 37

3.2.3.3 Rôles physiologiques des récepteurs kaïnate.L'utilisation d'outils pharmacologiques spécifiques a permis de déterminer le rôle desrécepteurs kaïnates. Compte tenu de leur perméabilité au calcium, ces récepteurs pouvaient jouer unrôle dans la libération des neurotransmetteurs. Effectivement, il fût montré que l'activation desrécepteurs Kaïnate était capable de modifier la libération de neurotransmetteurs mais en provoquantune augmentation de la libération de transmetteur. Cet effet fût observé à la fois au niveau desynapses excitatrices qui par ce moyen regulerait de manière positive leur propre libération maisaussi sur des synapses inhibitrices ce qui indique la possibilité d'une régulation trans-synaptique.Dans les deux cas les récepteurs Kaïnate sont localisés sur la terminaison pré-synaptique.En plus de cette localisation, il a été observé au niveau de certaine synapses des réponsessynaptiques dues à l'activation des récepteurs Kainate. Dans ce cas, ils sont localisés au niveau postsynaptique.Les PPSE Kaïnate étant beaucoup plus lent que les PPSE AMPA, ils pourraient faciliterla sommation synaptique au niveau des synapses qui les possèdent.3.2.4. Les récepteurs purinergiques.3.2.4.1Structure générale.Les premiers récepteurs ont été mis en évidence dans les années 1980. La découverte d'unantagoniste spécifique comme la suramine en 1992 a permis le clonage ultérieur de sept sous-unitésappelées P2X1-7. Leur séquence a permis de déterminer la structure de ces sous-unités. Ellescomportent deux domaines trans-membranaires. Les deux extrémités N et C -terminales sont ducôté cytoplasmique et les deux segments transmembranaires sont joints par une large boucleextracellulaire qui sert de site de liaison à l'ATP.Fabien TELL Année 2009-2010 38

Le récepteur complet serait formé de l'assemblage de trois sous-unités P2X soit de mêmetype (homo mères) soit hétéromériques. Lorsque l'on étudie la pharmacologie des différentes sousunitésen assemblage homomériques, on observe qu'elles différent par leur sensibilité à l'ATP et àdifférents agonistes et antagonistes. Par exemple, la sous-unité P2X1 présente une affinité de l'ordrede 1 µM pour l'ATP et de 30 µM; pour l'ADP alors que la sous-unité P2X7 ne répond que pour desconcentration 100 fois supérieure pour l'ATP et 10 fois supérieure pour l'ADP. De la même maniéreles P2X1 sont très bien bloqués par la suramine (1 µM) alors que les P2X7 sont très peu sensible(500 µM). D'un popint de vue physiologique, cela veut dire qu'il y a des récepteurs qui vont réagir àun niveau faible d'ATP (le niveau physiologique) alors que d'autres ne vont s'activer que dans lescas de libération massive d'ATP par exemple en cas de lésions cellulaires.3.2.4.2. Propriétés des différents assemblagesLes récepteurs P2X sont des canaux cationiques de type excitateurs. Ils sont perméables aucalcium. En plus de leur différences pharmacologiques, les différents assemblages vont égalementprésenter des différences en terme de cinétiques d'ouverture et surtout de vitesse dedésensibilisation.Les récepteurs composés de sous-unités P2X1 sont très rapidement désensibilisés alors que ce n'estpas le cas des récepteurs composés de sous-unités P2X2. L'assemblage de deux produit un récepteurau comportement intermédiaire.3.2.4.3 Rôles des récepteurs P2X.L'étude de la localisation des récepteurs purinergiques montre que les sous-unités P2X1-6sont localisées au niveau des neurones alors que les P2X7 sont plutôt au niveau des cellules glialesmais aussi des cellules sanguines comme les lymphocytes, la microglie (macrophages résidents) etles macrophages. Le rôle de ces sous-unités P2X7 pourraient être donc d'activer les systèmes deréponses à l'inflammation ou à l'agression immune ou ischémique.Au niveau des neurones, les récepteurs P2X peuvent participer à la réponse synaptique dessynapses inhibitrices GABA et des synapses excitatrices Glutamate.Fabien TELL Année 2009-2010 39

ANNEXE ILes récepteurs ionotropiquesPrincipales familles des récepteurs ionotropiques et leurs caractéristiquesmoléculaires. La famille des récepteurs ionotropiques pour lesneuropeptides ( canal sodique activé par le FMRFamide) n'est pasreprésentée.Fabien TELL Année 2009-2010 40