les allergenes - association franco-vietnamienne de pneumologie

Michèle RAFFARDAllergologue - Institut Pasteur - mraffard@free.frCertificat d’Immuno-Allergologie Clinique (CIAC)Association Franco Vietnamienne de Pneumologie (AFVP)Hôpital Universitaire de HCMV 3-7 novembre 2009LES ALLERGÈNESSTRUCTURE ET FONCTION

Allergènes Antigènes protéiques naturels Stimulant une hypersensibilité Mécanisme immunologique Réagissant avec des anticorps• IgE• Pneumallergènes : acariens, poils d’animaux, pollens• Trophallergènes : aliments HaptènesProduits chimiques réagissant avec des lymphocytesEczéma de contact : nickel MédicamentsA revised Nomenclature for Allergy An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task forceJohansson SGO, Bousquet J, B. Wutrich et alAllergy 2001;56:812-24 M RAFFARD HCMV24 Traduction 2009in RFAIC 2004;44:218-2303230

IgE et allergènes Chez les patients allergiques, lesallergènes entraînent la fabricationd’IgE spécifiques Pneumallergènes et asthme Acariens Poils d’animaux Moisissures Blattes PollensLa production de quantité anormales d’IgEen réponse à des allergènesenvironnementaux communs est le pluspuissant facteur prédisposant audéveloppement d’un asthme (GINA) M RAFFARD HCMV 20094

Les pneumallergènes Voies respiratoires Pneumallergènes Pollens = 50% dans les pays tempérés Graminées Arbres Herbes Acariens = 30% Animaux = 15% Blattes Moisissures Allergènes professionnels inhalésM RAFFARD HCMV 20095

Les trophallergènes Alimentaires ou trophallergènes Laitages et œufs Poissons, crustacés et coquillages Fruits à coques (arachide) Farines de céréales Fruits et légumes Épices Viandes Allergies croisées alimentairesM RAFFARD HCMV 20096

Autres allergènes Hyménoptères Venins de guêpe et frelon Venins d’abeille Venins de fourmis rouges (fire ant) Latex : au carrefour des sensibilisations Pneumallergène Allergène professionnel inhalé Anaphylaxie au cours d’actes chirurgicaux Allergies croisées alimentaires Fruits, légumes Allergies de contact : HSRM RAFFARD HCMV 20097

Les allergènes Origine naturelle complexe Mélange de glyco-protéines PM de 3 à 80 kDa Différents sites allergéniques Propriétés différentes Fonctions différentes Production d’immunoglobulines de type IgEchez les atopiquesM RAFFARD HCMV 20098

Acariensde la poussière de maison

Allergènes Allergènes connus Allergènes majeurs purifiés ou clonés = 60 % Propriétés identifiées 33% enzymatiques 25% de protéines de liaisons Fonctions biologiques inconnues = 40%M RAFFARD HCMV 200910

Sites antigéniques Epitope = site antigénique spécifique Structure moléculaire Spécificité de la réponse immunitaire lymphocytes T lymphocytes BM RAFFARD HCMV 200911

EpitopesÉpitope T séquentiels fixation sur CPA (Cellule Présentatrice d’Allergène) lymphocyte TÉpitope B conformationnel site de fixation d’IgEM RAFFARD HCMV 200912

M RAFFARD HCMV 200913

Nomenclature des allergènes Dénomination bien codifiée Nom scientifique en latin et en italique(convention internationale) Dermatophagoides pteronyssinus Allergène 3ères lettres du genre: Derespace 1 ère lettre de l’espèce : p n°1 pour l’allergène majeurDer p 1Blo t 1 = Blomia tropicalisBlo t 5 = Blomia tropicalisFel d1 = Felis domesticus Isoallergènes : Bla g1.0101 …Blo t 5M RAFFARD HCMV 2009Fel d115

Allergène majeur du chatFel d 1 : dimère d’hétérodimères= tétramèreCONGRESCNA2008HBREITENERKaiser et al. J Mol Biol 2007;37:716-27M RAFFARD HCMV 2009 16

Nomenclature des allergènes Allergènes majeurs reconnus par > 50% des allergiques (n°1) D Pter : Der p 1 Chat : Felis domesticus = Fel d 1 Autres allergènes numérotation par ordre chronologique Der p 2, Der f 2 Dénomination Comité international Union Internationale des Sociétés d’Allergologie etd’Immunologie et de l’OMSwww.allergen.orgwww.allergome.orgM RAFFARD HCMV 200917

Allergènes deDermatophagoides pteronyssinuswww.allergen.orgM RAFFARD HCMV 200918 Der p 1 Der p 2 Der p 3 Der p 4 Der p 5 Der p 7 Der p 8 Der p 9 Der p 10 Der p 11 Der p 14 Der p 20 Der p 21 Der p 23

Der p 2 se lie à des lipides CONGRESCNA2008HBREITENERSmith AM et al JACI 2001;107:977-84Derewenda et al. J Mol Biol 2002;318:189-9797M RAFFARD HCMV 2009 19

Fonction des allergènes du chatFel d 1Fel d 2Fel d 3Fel d 4Fel d 5wFel d 6wM RAFFARD HCMV 200920

Structure des allergènesM RAFFARD HCMV 200921

Structure des allergènes Classifier les allergènes Décrire des homologies de séquences protéiques Comprendre leur activité biochimique Expliquer les réactions croiséesM RAFFARD HCMV 200922

Pas de structure communeCONGRESCNA2008HBREITENERM RAFFARD HCMV 2009 23

Structure des allergènes StructurePrimaire Séquences d’acides aminés arrangés en chaînes polypeptidiques Conformation spatiale, tridimensionnelleLiaisons spécifiques ponts disulfures liaison ionique liaison hydrogène liaison hydrophobeStructure secondaire tertiaire quaternaireM RAFFARD HCMV 200924

AllergènesCONGRESCNA2008HBREITENERM RAFFARD HCMV 200925

Structure moléculaireprimaire Chaînes polypeptidiques : 3 conformations principales1. Hélice αstructure en bâtonnetsstabilisée par des liaisons hydrogènesentre le groupe NH et CO de la chaîne polypeptidique principale2. Feuillets plissés βBrins β3. Hélices à 3 brinsChaînes polypeptidiques étiréesmême sens = feuillets β parallèlessens opposé = feuillets β antiparallèles Séquence d’amino-acides séquence tridimensionnelleM RAFFARD HCMV 200926

Structure tridimensionnelle de laribonucléase Wlodawer 1986Hélices αFeuillets βLiaisons disulfuresAtomes de SoufreM RAFFARD HCMV 200927

ChienCONGRESCNA2008HBREITENERM RAFFARD HCMV 2009 28

ChatCONGRESCNA2008HBREITENERM RAFFARD HCMV 2009 29

Classification en famillesstructuralesCompréhension du potentiel allergéniqued’une protéine4 familles structurales1. feuillets β antiparallèles2. feuillets β antiparallèles associé à une hélice α3. feuillets β antiparallèles associé à X hélices α4. feuillets β antiparallèles associé à XX hélice αStructures cristallographiquesM RAFFARD HCMV 200930

Phléole Phl p 2 X Phl p 3Cristallographie aux rayons XRésonnance magnétiquenucléaireCONGRESCNA2008HBREITENERM RAFFARD HCMV 2009 31

Homologie Homologies de séquences protéiques Supérieures à 25% → Organisations spatiales similaires → Fonctions similairesM RAFFARD HCMV 200932

Blomia tropicalisBlo t 5 X Blo t 21CONGRESCNA2008HBREITENERNaik et al Structure 2008;16:125-36M RAFFARD HCMV 2009 33

Structure des allergènesStructure d’allergènes analogues à des familles deprotéines1. Cystéines protéases : enzymes2. Lipocalines : protéines fixant un ligand3. Profilines4. AlbuminesFamilles étudiées d’après B. David in Traité d’Allergologie Flammarion 2003M RAFFARD HCMV 200934

1.Famille des cystéinesprotéases 130 cystéines protéases (banques de données) Origines diverses Super famille de la papaïne = 80 Plantes Papaye (Carica papaya) papaïne, caricaïne,chymopapaïne Kiwi (Actinida chinensis) actinidine Acariens Dermatophagoides pteronyssinus : Der p 1 Dermatophagoides farinae : Der f 1 Insectes MammifèresM RAFFARD HCMV 200935

Der p 1 cystéine protéase (Musu 1997)Liaisons disulfuresAtomes de SoufreHélices αFeuillets βM RAFFARD HCMV 200936

2. Famille des lipocalines Plus de 90 séquences de lipocaïnes répertoriées Molécules sécrétées, extra-cellulaires Mammifères : chien, cheval, bovin Rongeurs : rat, souris Insectes : blatte germanique Masse molaire comprise entre 15 et 30 kDa. Structure 8 feuillets β antiparallèles une cavité hydrophobe transport de petites molécules lipidiquesM RAFFARD HCMV 200937

Bœuf2. Lipocalines CONGRESChatChienSourisChevalRatCNA2008HBREITENERPomès A et al Protein Peptide Lett. 200è;14:960-9M RAFFARD HCMV 2009 38

2.Fel d4,lipocaline du chat CONGRESCNA2008HBREITENERSmith et al CBA 2004;34(11):1732-3M RAFFARD HCMV 2009 39

3. Famille des profilines Protéines ubiquitaires du cytosquelettelient l’actine variabilité des séquences primaires structure tertiaire similaire Origine Pollens des plantes Réactions croisées entre plantes de familledifférentesM RAFFARD HCMV 200940

3. Profiline et allergiescroisées Allergènes Bouleau : Bet v 2 Armoise : Art v 2 Latex : Hev b 8 < 20% de sensibilisation croisée Toutes les profilines ne sont pas des allergènesProfilin consitute a novel family of fonctionnal plant pan-allergens.Valenta. J Exp Med 1992M RAFFARD HCMV 200941

4. Albumines Mammifères Chien = Can f 3 Cheval = Equ c 3 Chat = Fel d 2 Bovin = Bos d 6 Déterminants communs à plusieurs espècesde mammifères Réactions croisées possiblesM RAFFARD HCMV 200942

Fonctionsbiologiques/homologies5 catégories majeurs d’allergènes1. Protéines à activités enzymatiques2. Protéines fixant un ligand3. Protéines de la contraction musculaire4. Profilines5. DiversM RAFFARD HCMV 200945

1. Activités enzymatiquesActivité principalement hydrolytique1. EstérasesPhospholipases2. ProtéasesCystéine protéasesSérine protéasesAspartique protéinases3. Autres enzymesM RAFFARD HCMV 200946

1.1. Estérases Phospholipases des venins d’hyménoptères PLA2 venin d’abeille Apis mellifera Api m 1M RAFFARD HCMV 200947

1.2. Protéases Cystéines protéases Dermatophagoides pteronyssinus, Der p 1allergène majeur enzyme du tube digestif de l’acarienpossibilité de dégrader les squames humaines dont ilse nourrit Activité protéolytique Augmentation de la perméabilité de la muqueusetrachéale humaine Facilitation de la pénétration des allergènesM RAFFARD HCMV 200948

1.2. Autres Protéases Sérines protéinases Insectes Moisissures Divers Aspergillus, pénicillium Acariens Aspartiques protéinases Fécès d’insectes : blatte : Bla g 1 Moisissure Aspergillus fumigatus : Asp f 10M RAFFARD HCMV 200949

2. Protéines fixant un ligandCalycines LipocalinesPréposées au transport de petites molécules hydrophobesLiaison avec des molécules associées Odeur GoûtRétinol des rongeurs Sécrétions nasales Buccales Urines Autres calycines Chat = Fel d 1M RAFFARD HCMV 200950

Bœuf2. Lipocalines CONGRESChatChienSourisChevalRatCNA2008HBREITENERPomès A et al Protein Peptide Lett. 200è;14:960-9M RAFFARD HCMV 2009 51

3. Tropomyosines Protéine du muscle largement distribuée dansles espèces animales Rôle fonctionnel dans la contraction musculaire Actine Myosine Tropomyosines allergisantes Invertébrés Induction de réactions croisées Exemple Crevette Pen i 1 X Der p 10 X Per a 7 Crustacées X acariens X coquillages X insectesM RAFFARD HCMV 200952

Homologie des allergènesavec les protéines humainesCONGRESCNA2008HBREITENERM RAFFARD HCMV 2009 53

Fonction desallergènes deDermatophagoidespteronyssinus Der p 1 cystéine protéase Der p 2 NCP2 family Der p 3 trypsine Der p 4 alpha amylase Der p 5 Der p 6 chymotrypsine Der p 7 Der p 8 gluthation S-transférase Der p 9 collagolytic sérine protéase Der p 10 tropomyosine Der p 11 paramyosin Der p 14 apolipophorin Der p 20 arginine kinase Der p 21 Der p23M RAFFARD HCMV 200954

Fonction des allergènes du chatFel d1 : utéroglobulineFel d 2 : albumineFel d 3 : cystatineFel d 4 : lipocalineFel d 5w : immunoglobuline AFel d 6w : immunoglobuline MM RAFFARD HCMV 200955

4. Profilines Régulation des fonctions de l’actine Réassemblage du cytosquelette Liaison Phosphoinositides Protéines riches en proline Profilines végétales Réactions croisées Pollens d’arbres Fruits et légumes de familles botaniques différentesM RAFFARD HCMV 200956

Préparation des allergènesM RAFFARD HCMV 200957

Allergènes standardisésM RAFFARD HCMV 200958

Récoltes des allergènes Matières premières naturelles Élevage d’acariens Élevage de blattes Culture de moisissures Récolte de poils d ’animaux Pollens de plantes cultivées séparément ou dansdes serres Traitées, stérilisées, standardiséesM RAFFARD HCMV 2009 59

Matières premières Spécifiques Provenance fiable Non contaminées Produits biologiques Complexes Hétérogènes Instables Mélanges de substances Protéines Sucres EnzymesM RAFFARD HCMV 2009 60

Elevage d’acariens Conditions strictes Température : 20 à 30° Humidité : 70 à 90% ⇒ dans des étuves Milieu de culture spécifique Stallergènes breveté Apport nutritif adapté sansprotéines animales Évite toute contamination Virus ou prionM RAFFARD HCMV 200961

Recueil des acariens Culture de 120 à 150 jours Acariens vivants et morts Particules fécales Dépouilles de mues + œufs Conservation à – 45°C Durée minimale de 48h Lyophilisation Stérilisation : rayon gamma Conservation entre 2° à 8°CM RAFFARD HCMV 200962

Extraction des allergènes Broyage Mise en solution Filtration Dégraissage Purification Stérilisation par ultra-filtration Lyophilisation Conservation à 4°, en chambre froideM RAFFARD HCMV 2009 63

Standardisation : Objectifs Extraits allergéniques spécifiques Composition qualitative suffisante Composition quantitative constante Reproductibilité lot à lot Efficacité et sécurité pour le patient Activité allergénique Unités en poids-volume abandonnéesM RAFFARD HCMV 2009 64

StandardisationIn vitro Sélection de la matièrepremière Extrait expérimental Caractérisation in vitro Méthodes immunologiquesIEFSDS-PAGECRIEQuantification de l ’allergènesmajeurRAST-Inhibition⇒ Extrait de référence interneIn vivo Allergène à étudier 30 sujets sensibilisés àl’allergène Prick-test avec l’allergènePapule : diamètre de 7 mm(moyenne géométrique)Phosphate de codéinetémoin positif > 4 mm⇒Indice de Réactivité = IR⇒ Activité allergénique Unités = 100 IRM RAFFARD HCMV 2009 65

Un même extrait allergéniqueTESTS Aqueux Prick-tests + glycérol 3 ans conservation IDR Lyophilisat (3/5 ans) Dilution extemporanée Test de provocation Dilution extemporanée sansconservateurTRAITEMENT Injectable Aqueux Adsorbé Hydroxyded ’aluminium Phosphate de calcium Sublingual AqueuxM RAFFARD HCMV 2009 66

Les allergènes recombinantsM RAFFARD HCMV 200967

Biotechnologie Génie génétique Clonage des gènes des allergènes majeurs Allergènes recombinants Structure identifiée Cristallographie Résonance magnétique nucléaire Techniques de modélisationM RAFFARD HCMV 200968

Clonage des allergènesPauli G. CNA Paris 2008 1988 : clonage de Der p1 (acarien)Chua, Thomas. J Exp Med 1989 :clonage de Bet v 1 (bouleau)Breiteneder. Embo J 1991 : clonage de la profiline (panallergène)Valenta. Science 1993 : clonage de Phl p 5 (graminée)Vrtala. J Immunol 1993 : clonage de Sin a 1 (moutarde)RodriguezM RAFFARD HCMV 2009 69

Allergènes recombinants Technologie de l’ADN recombinant Permet une production standardisée Parfaite caractérisation immunochimique Production à grande échelle Plus de 400 allergènes disponibles dans lesbanques de donnéeswww.allergen.orgwww.allergome.orgM RAFFARD HCMV 200970

Allergènes recombinants Clonage des gènes codant les protéinesallergéniques Produit des protéines recombinantes Systèmes d’expression à partir : Bactéries (Escherichia coli) Levures Virus Cellules d’insectes PlantesM RAFFARD HCMV 200971

Allergènes recombinants Agent allergénique Préparation d’une séquence d’ADN codant pour l’allergène Obtention d’ARNm (messager) Reflet des gènes de l’agent allergénique Transcription Production d’un nouvel allergèneM RAFFARD HCMV 200972

Allergènes recombinants Intérêt dans le diagnostic biologiqueAmélioration des extraitsMesures quantitatives des IgE spécifiques Connaissance des structures des allergènesProtéine pureStructure tridimensionnelleClonage de séquences codantes Études des épitopes T et B Études des réactions croiséesValenta JACI 2007M RAFFARD HCMV 200973

Allergènes recombinants Acariens Dermatophagoides pteronyssinus Der p 2 rDer p 2 = r pour reconbinant Der p 1 nDer p 1 = n pour natif Latex 8 allergènes clonés Identification des sensibilisations Spina bifida allergiques = rHev b 1 et rHev b 3 31 sérums allergiques rHev b 5 rHev b 6.01M RAFFARD HCMV 200974

Allergènes recombinantsdisponibles www.phadia.fr AcarienDermatophagoidespteronyssinus nDer p 1 rDer p 2 rDer p 10 (tropomyosine) MoisissuresAlternaria alternata rAlt a 1Aspergillus fumigatus rAsp f 1 rAsp f 2 rAsp f 3 rAsp f 4 rAsp f 6 Pollens très nombreux AnimauxChat, Felis domesticus rFel d 1 nFel d 2 (albumine sérique)Chien, Canis familiaris rCan f 1 rCan f 2 rCan f 3 (albumine sérique)Porc, Sus scrofora nSus s PSAS (albumine sérique)Vache, Bos spp. nBos d 6 (albumine sérique) Latex, Hevea brasiliensis rHev b 1, 3, 5, 6.01, 6.02, 9,11, 8 (profiline)M RAFFARD HCMV 2009 75

Der p 1 cystéine protéase : nDer p 1 Der p 2 NCP2 family : rDer p2 Der p 3 trypsine Der p 4 alpha amylase Der p 5 Der p 6 chymotrypsine Der p 7 Der p 8 gluthation S-transférase Der p 9 collagolytic sérine protéase Der p 10 tropomyosine : rDer p10 Der p 11 paramyosin Der p 14 apolipophorin Der p 20 arginine kinase Der p 21 Der p23 76Allergènesrecombinantsde DermatophagoidespteronyssinusM RAFFARD HCMV 2009

Allergènes recombinants du chatFel d1 : utéroglobuline : rFel d 1Fel d 2 : albumine : nFel d 2Fel d 3 : cystatineFel d 4 : lipocalineFel d 5w : immunoglobuline AFel d 6w : immunoglobulineMM RAFFARD HCMV 200977

Allergènes recombinantsconclusion Préparations pour le diagnostic Dosage d’IgE spécifiques r ou n Qualités pharmaceutiques constantes Diagnostic plus précis Aide à la désensibilisation Désensibilisation adaptée au profil du patient Allergènes majeursM RAFFARD HCMV 2009 78

Le futur Pauli G. CNA 2008 Perspectives thérapeutiques Modulations de la réponse allergénique Diminution de la réactivité Au profit de l’immunogénécité Peptides synthétiques (fragment d’épitopes B) Cocktail d’allergènes recombinants Der p1, Der p2, Der p7, Der p8, Der p 10 Molécule recombinante hybride Phl p1, Phl p2, Phl p5, Phl p 6 Mises au point encore nécessaires Coût +++M RAFFARD HCMV 200979

Conclusion Allergènes et IgE Glycoprotéines complexes De mieux en mieux identifiées Importance des allergènes recombinants Extraits allergéniques Standardisés Diagnostic TraitementM RAFFARD HCMV 200980

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