DVD Expérimentons sur les enzymes - Pierron

Partie 3 : Pepsine / albumineSéquence 5 : " la pepsine agit sur l’albumine ".On verse une solution d’albumine dans deux tubes à essais. On ajoute dans un tube quelquesgouttes de pepsine et dans l’autre l’équivalent en eau distillée. Les deux tubes sont placésdans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.Le trouble observé dans les tubes au départ, provoqué par la présence d’albumine, disparaîtdans le tube contenant la pepsine. Cet enzyme a donc eu une action aboutissant à ladisparition de l’albumine.Durée : 1 minute et 30 secondesSéquence 6 : " l’action de la pepsine dépend du pH ".Dans trois tubes à essais contenant de l’albumine, on ajoute un acide, de l’eau distillée ou unebase afin d’obtenir 3 pH très différents : un acide à 1,63, un neutre à 6,65 et un basique à9,86. La pepsine est alors ajoutée dans les 3 tubes. Les trois tubes sont placés dans un bainmarieà 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.On constate que le trouble lié à la présence d’albumine disparaît seulement à pH acide. LepH a donc une action importante sur l’activité de l’enzyme.Durée : 1 minute et 40 secondesPartie 4 : Protéase / caséineSéquence 7 : " la caséine est hydrolysée en acidesaminées par la protéase ".On réalise une chromatographie avec des solutions d’acides aminés, une protéine entière, lacaséine, et celle-ci hydrolysée par une protéase. Chaque solution est déposée goutte à gouttesur le support à chromatographie. Un sèche cheveux permet de faciliter l’évaporation dessolvants. La plaque est placée dans une enceinte contenant le solvant de chromatographie. Cedernier entraîne les molécules différemment en fonction de leur taille. Une révélation de laplaque avec de la nihydrine permet de visualiser les acides aminés.On constate que la protéine entière n’est pas visible. Elle n’a que très peu migré. Les 3acides aminés servent de témoins et permettent d’affirmer la présence de leucine et deglycine dans la caséine par comparaison avec les acides aminés ayant migré suite àl’hydrolysât de la protéine.Durée : 1 minute et 40 secondes212893

Partie 5 : Pancréatine / huileSéquence 8 : " la pancréatine agit sur l’huile ".On verse dans deux tubes à essai de l’huile d'olive neutralisée avec quelques gouttesd’émulsifiant. On ajoute de la teinture de tournesol comme indicateur de pH, puis de lapancréatine dans un tube et de l’eau distillée dans l’autre. On attend quelques heures dans unbain-marie à 37°C.On constate un changement de couleur de bleu à rouge dans le tube contenant la pancréatine.Il s’agit d’une acidification du pH résultat de l’activité de l’enzyme ayant hydrolysée lestriglycérides en acide gras et glycérol.Durée : 1 minute et 20 secondesPartie 6 : Synthétase / glucoseSéquence 9 : une synthèse enzymatique.On filtre une macération dans de l’eau de pomme de terre râpée. On teste le filtrat avec del’eau iodée pour montrer qu’il ne contient pas d’amidon. On verse dans un tube à essai dufiltrat avec du glucose-1-phosphate. Le tube est placé au bain-marie à 37 degrés Celsius. Lecontenu du tube est testé avec de l’eau iodée au cours du temps.On constate l’apparition progressive d’une couleur bleu foncé permettant d’affirmer que del’amidon est synthétisée.Durée : 1 minute et 40 secondesPartie 7 : Peroxydase / gaïacolSéquence 10 : " une cinétique enzymatique".On verse un substrat, le gaïacol, et de l’eau oxygénée dans une cuve colorimétrique. Onajoute la peroxydase qui va oxyder le substrat et provoquer l’apparition progressive d’unecouleur sombre mesurable par le colorimètre. Une chaîne d’expérimentation assistée parordinateur va permettre de suivre l’évolution de la réaction en fonction du temps.La courbe obtenue permet d'apprécier la cinétique de la réaction. L'obtention d'un plateaucaractérise la transformation totale du substrat par l'enzyme.Durée : 1 minute212894

Suggestions de manipulations et activitésPour atteindre des objectifs méthodologiques :- S’INFORMER● S’informer sur des images pour réaliser une expérience● S’informer sur des images pour observer des résultats- RÉALISER● Réaliser une manipulation ou une expérience- COMMUNIQUER● Schématiser le protocole d’une expérience● Construire un tableau de résultats (voir les tableaux dans les séquences 4 et 6)● Rédiger un compte rendu d’une expérience- RAISONNER● Ces deux premières séquences pourraient servir pour introduire un sujet sur l'actionenzymatique tant chez les végétaux que chez les animaux. Il s’agit de poser le problèmescientifique : comment la graine en germination (ou le pancréas) agit sur l’amidon (oul’huile) ?● Les autres exemples peuvent servir à développer la démarche expérimentale. Donnons unexemple à partir de la séquence 3 :■ Problème scientifique : comment l’amidon est transformé en glucose par la salive ?■ Hypothèse : dans la salive, une amylase transforme l’amidon en glucose.■ Protocole : voir la séquence■ Résultat : voir la séquence■ Observation complémentaire : voir mesure du glucose■ Conclusion : hypothèse validée.Pour réaliser les manipulations et les expériences :Séquence 1 : action d'une graine en germination surl'amidon.Couler dans une boîte de Pétri un mélange de gélose et d'amidon. Laisser refroidir.Séparer les cotylédons d'une graine de haricot mise à germer depuis deux jours. Imprégner lasurface de la gélose d'eau iodée (coloration bleue) et déposer le cotylédon , la plantule aucontact de la gélose. L'observation peut se faire à température ambiante entre 50 et 90minutes.212895

Séquence 2 : action du pancréas sur du papier imbibéd’huile et de tournesol.Humecter une rondelle de papier filtre avec de la teinture de tournesol. Laisser sécher. Letournesol est bleu en milieu basique ou neutre, rouge en milieu acide.Placer la rondelle dans une boîte de Pétri. Imprégner la rondelle d'huile d'olive neutre (voirséquence 8).Poser au centre un fragment de pancréas frais. Mettre le couvercle et placer dans l'étuve à37°C pendant quelques heures.Séquence 3 : " l’amylase transforme l’amidon en glucose ".L'amylase est achetée en pharmacie sous la dénomination de "maxilase". Il suffit de fairedissoudre le comprimé dans de l'eau distillée (attention s’il existe un enrobage de sucre).Utiliser de l'empois d'amidon à 10 g/L. Mettre 5 mL d'empois d'amidon dans deux tubes àessais, puis ajouter à l'un 1 mL de solution d'amylase et à l'autre 1mL d'eau distillée. Placerau bain-marie à 37°C et tester toutes les minutes un extrait de chaque tube à l'eau iodée.L'utilisation du glucomètre permet d'évaluer la teneur en glucose entre 0,1 et 6g/L. Endessous de la valeur minimale, l'indication "low" apparaît sur l'écran digital.Séquence 4 : " l’action de l’amylase dépend de latempérature ".Préparer 3 bains-marie à trois températures différentes 0°C, 37°C, 80°C. Y placer trois tubescontenant 5 mL d'empois d'amidon. Faire de même avec l'amylase. Effectuer les mélangeslorsque les différents produits sont à température adéquate. Au bout de 5 minutes, faire unprélèvement de chaque tube et le tester sur une plaque à l'eau iodée.Séquence 5 : " la pepsine agit sur l’albumine ".Mettre 10mL d' une suspension d'albumine acidifié à l'acide chlorhydrique (pH = 1) dansdeux tubes à essais. Ajouter dans l'un 1 mL de pepsine diluée à 5g/L et dans l'autre 1mLd'eau distillée. Placer les tubes au bain-marie à 37°C. Lecture des résultats 40 à 50 minutesplus tard.Séquence 6 : " l’action de la pepsine dépend du pH ".Mettre 10 mL d'une suspension d'albumine dans trois tubes à essais. Verser quelques gouttesd'acide chlorhydrique dans le premier (pH = 1), neutraliser le second (pH = 7), ajouter de lasoude au troisième (pH = 13). Ajouter 1mL de pepsine diluée à 5g/L dans chacun des tubes.Les placer au bain-marie à 37°C. Lire les résultats entre 40 et 50 minutes.212896

Séquence 7 : " la caséine est hydrolysée en acidesaminées par la protéase ".On utilise une technique de chromatographie sur couche mince (CCM). On utilise uneplaque cellulose sur support polyester (temps d'élution plus courts et tâches plus compactes).On dispose de cinq verres de montre dans lesquels on dépose respectivement 1mL de solutionde caséine, 1 mL de solution de leucine, 1 mL de solution de glycine, 1 mL de solutiond’arginine, 1 mL d’une solution de caséine hydrolysée. Prendre une pipette capillaire parverre de montre et déposer, sécher chaque goutte pour faire trois dépôts successifs. Placer laplaque dans la chambre à chromatographie garnie du solvant adéquat. Laisser migrer 60minutes. Révéler à la nihydrine : attention, opération à faire par un adulte sous la hotte dulaboratoire.Séquence 8 : " la pancréatine agit sur l’huile ".Chauffer 100 mL d'huile d'olive à 50°C à l'aide d'un agitateur chauffant. Préparer unesolution de carbonate disodique : verser, goutte à goutte le carbonate puis laisser refroidir.Après 24h, jeter la phase aqueuse, ajouter de l'eau distillée, mélanger et laisser décanter.Vérifiez le pH et recommencer les opérations jusqu'à obtention d'une huile neutralisée.Filtrer.Verser dans deux tubes à essais 5 mL de cette huile neutre, une goutte de liquide à vaisselle(acquisition d'une émulsion stable), deux à trois gouttes de tournesol (indicateur de pH). Dansl'un ajouter 1 mL de pancréatine, dans l'autre 1 mL d'eau distillée.Placer les tubes au bain-marie à 37° C. Après deux heures, on peut observer le virage dutournesol au rouge sous l'action de l'hydrolyse des triglycérides.Séquence 9 : " une synthèse enzymatique ".Râper une pomme de terre sur un cristallisoir entouré de glaçons, ajouter 50 mL d 'eaudistillée froide. Après quelques minutes de macération, filtrer le mélange en veillant àrecueillir le filtrat dans un récipient entouré de glaçons. Effectuer un prélèvement et le testerà l'eau iodée pour mettre en évidence l'absence d'amidon.Verser dans un tube à essai 2 mL du substrat et 2 mL d'une solution de glucose - 1phosphate.Placer le tube au bain-marie à 37 °C.Effectuer un prélèvement toutes les deux minutes et le tester à l'eau iodée.Au bout de quelques minutes, la coloration bleue de l'amidon apparaît : il y a eu synthèse àpartir du glucose-1-phosphate et d'une enzyme présente dans le filtrat.212897

Séquence 10 : " une cinétique enzymatique ".Cette séquence introduit l'utilisation d'une chaîne d’Ex.A.O. pour évaluer une cinétiqueenzymatique :- le capteur est constitué par un colorimètre qui compare en permanence la densité optiquedans deux cuves (une contenant de l'eau et l'autre un mélange substrat-enzyme ;- les informations sont transmises à l'interface, traitées par l'unité centrale et affichées surl'écran.Râper radis ou rave sur un cristallisoir, ajouter 50 mL d'eau distillée. Laisser macérer unedizaine de minutes puis filtrer : la solution obtenue contient une peroxydase.Verser dans un tube à essai 1 mL de gaïacol (substrat), 1 mL d'eau oxygénée diluée au 1/100,1mL de solution tampon phosphate (pH : 6,2).Ajouter 0,5 mL d'enzyme : en quelques secondes, la solution incolore vire au rouge-brun paroxydation du gaïacol en gaïcoquinone.Récapitulatif des testsRéactions hydrolases synthétase oxydaseSubstrats Glucides Protides Lipides Glucose-1-P GaïacolIntroduction : mise Graine Pancréasen évidence globale sur amidon sur huileMise en évidencePommeAmylase Pepsine Lipasein vitrode terreAction température AmylaseAction pHPepsineExAOPeroxydaseChromatographieCaséine21289PIERRON Education: 2, rue Gutenberg - B.P. 80609 - 57206 SARREGUEMINES CEDEXTél. : 03 87 95 14 77 - Fax : 03 87 98 45 91E-mail France : education-france@pierron.fr - E-mail Export : education-export@pierron.comInternet : http://www.pierron.com8