Nettoyage des instruments chirurgicaux réutilisables:

forumPublication originale (en allemand) dans Zentralsterilisation: Zentr Steril 2004; 12 (1): 171-180Reproduction avec l’aimable autorisation de la maison d’édition mhp Verlag, WiesbadenNettoyage des instrumentschirurgicaux réutilisables:contrôle des résultats avec Pro-tect®par R. Fushimi*, R. Hanamura, M. Takashina, S. Noguchi, S. Nakata, M. Monden* Centre chirurgical, Hôpital universitaire Osaka, 2-15 Yamadaoka, Suita, OsakaMots clés:• Mesure des résultats de nettoyage• Test de frottis• Protéine• Noir d’amide 10 B• Réaction de BiuretL’on trouve souvent du sang ou de petitsbouts de tissus sur les instruments chirurgicauxutilisés. Or pour éviter les infections etpour éviter tout problème lors de l’utilisationde ces instruments, ces souillures doiventêtre éliminées par nettoyage. Dans leservice de pré-désinfection et nettoyaged’une stérilisation centrale moderne, l’on arecours à des laveurs-désinfecteurs ainsiqu’à des nettoyeurs à ultrasons. Les résultatsde nettoyage obtenus avec ces appareilssont testés par exemple visuellement(contrôle visuel de la présence ou non desouillures) ou au moyen de colorants réagissantaux protéines. Ces deux types decontrôle dépendent toutefois largement dujugement subjectif de la personne chargéedes tests; de plus, dans le cas de la méthodede coloration, l’instrument doit faire l’objetd’un nouveau nettoyage, afin d’éliminer l’indicateurcolorant. Il est en outre impossiblede déterminer quantitativement lessouillures résiduelles. Par conséquent, sil’on souhaite introduire des méthodes denettoyage des instruments plus précises, ceslimitations sont loin d’être satisfaisantes.Nous avons analysé le système Pro-tect, quise compose d’un bâtonnet de ouate à frotterl’instrument et d’un réactif permettantde mesurer la concentration des protéines.Au moyen de séries de dilution de protéines,nous avons déterminé la corrélationentre l’intervalle de réaction et l’intensitéde la couleur de la réaction et nous avonscomparé la sensibilité de la mesure Pro-tectavec celle de la méthode de coloration desprotéines. Il en résulte que Pro-tect permetde prouver la présence de protéines même àune quantité aussi faible que 25 µg environ,le tout au moyen d’un test par frottistrès simple sur l’instrument. Nous sommesdonc d’avis que la mesure de la qualité dunettoyage des instruments au moyen dePro-tect s’avère utile non seulement pourcontrôler le processus de nettoyage, maisaussi pour évaluer les performances desdétergents et des laveurs-désinfecteurs.IntroductionL’on trouve souvent du sang ou de petitsbouts de tissus sur les instruments chirurgicauxutilisés. Or pour éviter les infectionset pour éviter tout problème lors de l’utilisationde ces instruments, ces souilluresdoivent être éliminées par nettoyage. Dansles services hospitaliers de nettoyage desinstruments – p. ex. dans les stérilisationscentrales –, l’on a recours à des détergentsenzymatiques puissants utilisés dans leslaveurs-désinfecteurs ainsi qu’à des nettoyeursà ultrasons. Il est toutefois particulièrementdifficile d’éliminer les souillurestenaces des instruments. Selon divers rap-ports, des tests bactériologiques effectuéssur 50 instruments (dont de grands crochets,des blue chips et des ciseaux Metzenbaum)nettoyés normalement après lesinterventions chirurgicales ont abouti auxrésultats suivants: présence de micro-organismesdans une concentration de 100 ufcsur 14% des instruments, 11 à 100 ufc sur14% supplémentaires et absence de toutmicro-organisme dans 30% des cas seulement(1). Certes, un test microbiologiqueest un excellent moyen pour prouver la présencede souillures bactériennes sur desinstruments nettoyés; il n’empêche quepour un collaborateur de la stérilisationcentrale, ce type de test est relativementcomplexe à effectuer.En d’autres termes: on a besoin d’un processusqui indique de manière simple,rapide et précise la quantité de souilluresrésiduelles sur les instruments après le traitementde ceux-ci. Actuellement, les résultatsdu nettoyage des instruments sont testéssoit visuellement, soit au moyen decolorants réagissant aux protéines, soit aumoyen d’un indicateur contenant de l’adénosinetriphosphate (ATP ; présent engrande quantité dans le sang). Les deuxpremiers types de contrôle dépendent toutefoislargement du jugement subjectif dela personne chargée des tests; de plus,dans le cas de la méthode de coloration,l’instrument doit faire l’objet d’un nouveaunettoyage, afin d’éliminer le colorant.Enfin, il est impossible de déterminer quan-11

titativement les souillures résiduelles.Quant à la mesure de la concentration d’ATPrésiduel au moyen d’un indicateur, celle-ciest plus précise et fournit en outre des indicationsquantitatives. Par contre, ellenécessite l’utilisation d’un réactif ainsi qued’un appareil spécial de mesure de la luminescence;elle n’est par conséquent pas trèsrépandue. Dans ce contexte, la nécessitéapparaît clairement de disposer d’uneméthode simple, permettant de mesurerquantitativement les résultats du nettoyagedes instruments.Nous avons donc analysé le système Protect– qui se compose d’un bâtonnet deouate à frotter l’instrument et d’un réactifpermettant de mesurer la concentration desprotéines –, afin de déterminer si ce produitest capable de mesurer les résultats du nettoyagedes instruments.Nos tests ont montré que Pro-tect permetde prouver la présence de protéines jusqu’àune quantité aussi faible que 25 µg environ,le tout au moyen d’un test de frottistrès simple sur l’instrument. Ce résultatnous semble tout à fait remarquable et c’estla raison pour laquelle nous présentons ciaprèsun rapport portant sur l’efficacité dePro-tect; nous nous fondons sur des donnéesde performances élémentaires, notammentsur les courbes standard obtenues surla base de solutions protéiniques diluéesainsi que sur une comparaison de la sensibilitédes mesures Pro-tect et de la méthodede coloration des protéines.Matériaux et méthodesKit de test de nettoyage par frottisLe produit que nous avons testé s’appellePro-tect® (Biotrace International plc. Bridgend,Grande-Bretagne); il s’agit d’un kitde test de nettoyage par frottis (fig. 1). Cekit comprend un bâtonnet de ouate à frottersur la surface de l’instrument ainsi qu’unpetit tube synthétique contenant un réactifde Biuret (750 µl) (fig. 2, 3) servant àmesurer la concentration protéinique. Aprèsavoir été passé sur l’instrument, le bâtonnetest introduit dans le tube synthétique parl’ouverture du haut. Ce faisant, le bâtonnettransperce une membrane protectrice à l’intérieurdu tube et entre en réaction avec leréactif de Biuret, qui vire de couleur, enfonction de la quantité de protéines présentes.Fig. 1: Apparence du kit de test Pro-tect® (Biotrace Co., Ltd.)Processus de mesure pour déterminer lescourbes d’absorption du réactif de BiuretPro-tect et de l’échantillonLe réactif Pro-tect de 5 kits a été pipeté etintroduit dans une cuvette en verre de 1 x 1cm. La plage de mesure d’un spectrophotomètreUV-lumière visible Shimadzu 1240(Shimadzu Co., Ltd., Kyoto, Japon) a étéréglée entre 400 et 700 nm, et la densitéoptique du réactif (contrôle) a été mesurée àdes intervalles de 20 nm. Ensuite, 100 µl deplasma (obtenus par centrifugation de sanghéparinisé à 3000/min pendant 5 minutes)ont été ajoutés au réactif puis, 30 minutesaprès le mélange, la densité optique del’échantillon a été mesurée selon la mêmeméthode que pour le réactif de contrôle.Evolution dans le temps de la densitéoptique du réactif de Biuret Pro-tectLe réactif Pro-tect de 5 kits a été pipeté etintroduit dans une cuvette en verre de 1 x 1cm. 20 µl de plasma (obtenus par centrifugationde sang héparinisé à 3000/min pendant5 minutes) ont été ajoutés au réactif etintroduit dans la cuvette (échantillon A); ladensité optique de cet échantillon a ensuiteété mesurée à 560 nm toutes les 10 minutesaprès le mélange, pendant 60 minutes. 20 µlde plasma, dilué quatre fois dans une solutionsaline physiologique, ont ensuite étéintroduits dans une autre cuvette, danslaquelle on a ajouté le réactif de 5 autreskits de test Pro-tect (échantillon B). La densitéoptique a, dans ce cas également, étémesurée selon la même méthode.Courbe standard Pro-tectDu Chem Trak Puratinum (Medical AnalysisSystem, Inc., Californie, USA) a été diluédans une solution saline physiologique desorte à obtenir une concentration protéiniquetotale respectivement de 5, 10, 25,50, 100 et 300 µg/100 µl; chaque solutiondiluée a ensuite été absorbée par 5 bâtonnetsPro-tect. Puis ceux-ci ont été introduitsdans les petits tubes synthétiquesprévus à cet effet, pour déclencher la réaction.Après 30 minutes, le réactif avecl’échantillon de chacun des 5 tubes demême concentration a été pipeté dans unecuvette et la densité optique de chaqueéchantillon a été mesurée à 560 nm.Comparaison de la sensibilité de mesureentre la méthode de coloration des protéineset la méthode Pro-tect100 µl de Chem Trak Puratinum, dilué à desconcentrations protéiniques de 5, 25, 50 et100 µg/100 µl, ont été déposés sur 3 plaquettesen acier inoxydable (15 x 50 mm),qui ont séché pendant 3 heures à températureambiante. Chacune des plaquettes enacier inoxydable a ensuite été immergéependant 5 minutes dans une solution denoir d’amide 10 B (fig. 4, 5) (Clean ChemicalCo., Ltd., Osaka, Japon), un colorant quise fixe aux protéines, puis rincée pendant 1minutes sous l’eau courante avant d’êtreremise à sécher à température ambiante.100 µl de solutions protéiniques concentréesà 5, 25, 50 et 100 µg/100 µl ont étépipetés sur 5 bâtonnets Pro-tect. Une foisles solutions absorbées, les bâtonnets ontété introduits dans les petits tubes synthétiquesprévus à cet effet, pour déclencher laréaction. Après 30 minutes, le réactif avecl’échantillon de chacun des 5 tubes demême concentration a été pipeté dans unecuvette et la densité optique de chaqueéchantillon a été mesurée à 560 nm.12

forumMéthode de coloration des protéines,méthode Pro-tect et mesure de concentrationd’ATP avec, comme échantillon,du sang déposé sur des plaquettes enacier inoxydableDu sang complet héparinisé a été dilué respectivement10, 40, 100 et 400 fois dansune solution saline physiologique. 20 µl dechaque dilution ainsi que 20 µl de sangcomplet ont été appliqués sur 3 plaquettesen acier inoxydable (15 x 50 mm). Pourchaque dilution, une première plaquette aété mise à sécher pendant 3 heures à températureambiante, puis immergée pendant5 minutes dans du noir d’amide 10 B, puisrincée pendant 1 minutes sous l’eau courante.Une deuxième plaquette a été frottéeavec un bâtonnet Pro-tect, qui a ensuiteété introduit dans le petit tube synthétiqueprévu à cet effet, pour déclencher la réaction.La dernière des plaquettes a été frottéeavec un bâtonnet de ouate afin demesurer la concentration d’ATP ; l’ATP sur lebâtonnet a été extrait dans 1 ml d’eaudéminéralisée. La concentration d’ATP dansla solution ainsi obtenue a été mesuréeselon le processus de la bioluminescence(fig. 6, 7). Le réactif et l’appareil de mesurede la concentration d’ATP provenaient tousdeux de Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.,Tokyo, Japon.Fig. 2: Courbesd’absorption pour leréactif de BiuretPro-tect® et pourl’échantillon.Densité optiqueDensité optique3,53,02,52,01,51,00,50,04001,501,251,000,750,50500 600 700Longueur d’onde (nm)●: Contrôle (réactif de Biuret)■: Echantillon (réactif après la réaction)RésultatsLa figure 2 montre la courbe d’absorptionpour le réactif de Biuret Pro-tect et pourl’échantillon. Dans la fourchette compriseentre 500 nm et 700 nm, la densité optiquedu contrôle du réactif de Biuret était quasinulle, celle de l’échantillon en revancheétait de 3194 à 520 nm, de 2475 à 560 nmet de 2479 à 580 nm. Etant donné que ladensité optique a à peine oscillé à une longueurd’onde de 560 nm, nous avons décidéde prendre 560 nm comme valeur de référencepour la mesure de la densité optiquede nos expériences.La figure 3 montre l’augmentation de la densitéoptique, au fil du temps, du réactif deBiuret Pro-tect après la réaction. 30 minutesaprès le début de la réaction, l’échantillon Afaisait état d’une absorption de 0,946; 60minutes après le début de la réaction, l’absorptionétait de 1,212; 30 minutes après ledébut de la réaction, l’échantillon B indiquaitune absorption de 0,438; 60 minutesaprès le début de la réaction, l’absorptionétait de 0,575. Sur la base de ces résultats,Fig. 3: Evolutiontemporelle de laréaction avec leréactif de BiuretPro-tect®.Fig. 4: Courbestandard Pro-tect®.Densité optique0,250,000 10 20 30 40Temps en minutes■: Echantillon A●: Echantillon B2,52,01,51,00,50,00 10 20 30 40Concentration protéinique (µ g)50 5013

nous avons décidé, pour déterminer laconcentration protéinique avec Pro-tect, demesurer la densité optique 30 minutes àcompter du moment où le bâtonnet avaitété introduit dans le tube.Figure 4: courbe standard pour le réactifPro-tect, après la réaction avec les bâtonnetsimbibés des solutions de 5, 10, 25, 50,100 et 300 µg de protéines par 100 µl. Lacourbe standard avait la forme d’un bol àl’envers. L’absorption était de 0,274 pour 10µg de protéines, de 0,690 pour 50 µg deprotéines, de 1,230 pour 100 µg de protéineset de 2,220 pour 300 µg de protéines.La figure 5 présente les résultats de la colorationau noir d’amide 10 B de plaquettesen acier inoxydable sur lesquelles avaientété déposés 100 µl d’une solution concentréeà 5, 25, 50 et 100 µg de protéines par100 µl. Si nous n’avons pas pu constater denette coloration bleue pour la plaquetteavec 5 µg de protéines, la coloration étaitpar contre marquée à partir de 25 µg deprotéines et plus. La figure 6 montre lerésultat 30 minutes après avoir frotté lessolutions de même concentration avec lesbâtonnets et après la réaction avec le réactifPro-tect. La densité optique du réactifaprès la réaction était de 0,154 pour 5 µgde protéines, de 0,452 pour 25 µg de protéineset de 0,630 pour 50 µg de protéines.La figure 7 montre ces mêmes échantillonsaprès avoir déposé 20 µl de sang sur lesConcentration protéinique (µg)Contrôle (0) 5 25 50 100Fig. 5: Sensibilité de mise en évidence de la méthode de coloration fixant les protéines.Concentrationprotéinique (µg)Contrôle (0) 5 25 50 100Réactif après la réaction(des 5 sets)Densité optique(de 5 6 0 nm)0.154 0.452 0.630 1.230RéactionFig. 6: Sensibilité de mise en évidence de la méthode Pro-tect®.14

forumMéthodeDilutionAucune 10 × 40 × 100 × 400 ×Méthode de colorationfixant les protéinesConcentration d’ATP(mol/ml)8080 × 10 –11369 × 10 –11 24.5 × 10 –11 8.33 × 10 –11 2.21 × 10 –11MéthodePro-tect®Réactif aprèsla réactionConcentrationprotéinique(µg)100 ouplus50 ~ 100 25 ~ 50 5 ~ 25 0 ~ 5Fig. 7: Résultats des mesures effectuées avec la méthode de coloration fixant les protéines, avec la méthode Pro-tect® et avec la mesure de laconcentration de l’adénosine triphosphate (ATP) avec du sang sur des plaquettes en acier inoxydable.plaquettes en acier inoxydable, leur apparenceaprès coloration au noir d’amide 10 B,les concentrations d’ATP des bâtonnets quiavaient été passés sur les plaquettes enacier, des photos du réactif Pro-tect aprèsla réaction ainsi que les concentrations protéiniquesdéterminées sur la base des résultatsde la figure 6. Lors d’une dilution de400 fois du sang, la coloration bleue était àpeine discernable, mais dès une dilution de100, une légère coloration bleue étaitvisible. A l’inverse, avec Pro-tect, nousavons pu constater à l’œil nu que pour lesang dilué d’un facteur de 10, la quantitéde protéines devait se situer entre 50 et100 µg et que pour le sang dilué 100 fois,elle devait être comprise entre 5 et 25 µg.Les mesures de concentration d’ATP ont,quant à elles, permis d’enregistrer desvaleurs quantitatives (2,21 x 10-11mol/ml), même pour le sang dilué 400 fois.DiscussionSi l’on veut garantir une stérilisation irréprochable,il est indispensable de nettoyer aupréalable les instruments chirurgicaux, afinde les débarrasser de souillures résiduellestenaces telles que le sang. Or pour contrôlerles résultats de ce nettoyage, l’on doit pouvoirdéterminer la quantité de protéines etd’autres souillures résiduelles sur les instrumentsnettoyés. Toutefois, les méthodes quiont cours actuellement – comme l’inspectionvisuelle après le nettoyage pour voir s’il resteencore des substances sur les instruments oule processus de coloration des protéines, quiimplique également un contrôle visuel –, cesméthodes dépendent largement du jugementsubjectif de la personne chargée du contrôleet elles ne permettent pas de fournir desdonnées quantifiables.Le produit Pro-tect, dont le test fait l’objetdu présent rapport, fonctionne de manièretrès simple. Il suffit en effet de frotter lasurface de l’instrument à tester avec unbâtonnet de ouate et d’introduire ensuitecelui-ci dans le petit tube en plastique livréà cet effet et contenant un réactif deBiuret. Les processus difficiles à mettre enœuvre ou exigeant des réactifs ou des appareilsspéciaux ne réussiront pas à s’imposerdans les services de stérilisation centrale,déjà très sollicités. Dans cette optique, Protectpeut être considéré comme un bon processusde mesure des résultats du nettoyagedes instruments.La sensibilité de mesure de Pro-tect estrelativement bonne. Comme le montre eneffet l’illustration 6, la personne chargée dutest peut, à l’œil nu, déterminer de manièrefiable la présence de protéines dès 25 µgdéjà. Certes, la méthode de coloration aunoir d’amide 10 B permet également dedétecter 25 µg de protéines, mais elleimplique de renettoyer l’instrument testéafin d’éliminer la solution colorante.Lorsque nous avons prélevé au moyen desbâtonnets Pro-tect le sang dilué sur les plaquettesen acier inoxydable et que nousavons effectué les mesures conformémentaux photos, qui montrent les réactions parcoloration pour 100 µl de solution respectivementà 5, 25, 50 et 100 µg de protéines(fig. 6), Pro-tect nous a permis de déterminerdes valeurs semi-quantitatives de protéinesdans des fourchettes de 5–25 µg ou de 50-100 µg (fig. 7). Certes, le noir d’amide 10 Bpermet également d’obtenir des valeurs semiquantitativeslorsque l’on procède à une élutionde la coloration bleue dans une solutionbasique, mais l’obtention de l’élution exigebeaucoup de temps et de travail, et la solutiond’extraction risque, dans certains cas,d’endommager l’instrument. Par conséquent,15

Pro-tect est supérieur à la méthode de colorationau noir d’amide 10 B, de nos jours largementrépandue pour tester les résultats desnettoyages. Il faut toutefois égalementreconnaître que les résultats obtenus avecPro-tect sont moins détaillés que ceux obtenuspar la mesure de la concentration d’ATP.A noter qu’avec le réactif de Biuret du kit Protect,la réaction se poursuit dans le temps;ainsi, même 60 minutes après le début de laréaction, la densité optique n’est pas encorestabilisée (fig. 3). Ce phénomène s’expliqueprobablement par les progrès effectués sur leréactif et grâce auxquels celui-ci réagit déjàen présence d’infimes quantités de protéines.Avec Pro-tect, il est par conséquent nécessairede déterminer la mesure à un instantprécis après le début de la réaction. Pournotre part, nous pensons que cet instant peutêtre fixé à 30 minutes après le début de laréaction. De plus, étant donné que la quantitéde protéines présentes sur le bâtonnetdépend de la taille de la surface sur laquelleon a frotté le bâtonnet, il faut égalementdéterminer cette dernière. Nous pensonsqu’une surface de 1 x 1 cm sur l’instrumentest suffisante, ce qui n’empêche toutefois pasde procéder à une mesure en frottant toute lasurface de l’instrument. En outre, l’on peuttout à fait imaginer ne contrôler les résultatsdu nettoyage qu’à un endroit précis de l’instrument,p. ex. à l’articulation d’une pince,un endroit dont on sait qu’il est particulièrementdifficile à nettoyer.Puisqu’il permet d’effectuer, de manièresimple et fiable, des mesures semi-quantitatives,Pro-tect constitue donc un procédéprivilégié pour évaluer les résultats du nettoyaged’instruments chirurgicaux et s’avèreégalement très utile pour tous ceux quirecherchent des processus de nettoyageplus efficaces.Références1. Rutala WA, Gergen MF, Jones JF, et al:Levels of microbial contamination onsurgical instruments. Am J Infect Control1998; 26: 143–145.2. Kingsley GR : The direct Biuret methodfor the determination of serum proteinsas applied to photoelectric and visualcolorimetry. J Lab Clin Med 1942; 27:840–845.3. Gornall AG, Bardawill CJ, David MM:Determination of serum proteins bymeans of the Biuret reaction. J BiolChem 1949;177:751–766.4. Heinzel W, Vogt A, Kaller E, et al: A newmethod for the quantitative determinationof antibody and antigen protein,with a sensitivity to five micrograms. JLab Clin Pathol 1946; 66: 334–343.5. Schaffner W, Weissmann C : A rapid, sensitive,and specific method for thedetermination of protein in dilute solution.Anal Biochem 1973; 56: 502–514.6) Beutler E, Baluda M: Simplified determinationof blood Adenosine Triphosphateusing the Firefly system. Blood1964; 23: 688–697.7) Venkateswaran K, Hattori N, La DucM.T., et al: ATP as a biomarker of viablemicroorganisms in clean-room facilities.J of Microbiological Methods2003; 52: 367–377.Technische STERILISATIONSassistentin/-assistentFachkunde I: 17. - 29. Jan. / 18. - 30. April 2005(2 Kurse)Fachkunde II: 13. - 25. September 2004Fachkunde III: 08. - 19. Nov. 2004 u.14. – 25. Febr. 2005EO und FA - STERILISATORENRAUMDESINFEKTION mit Formaldehyd27. – 29. Sept. 2004 Vollkurs27. – 28. Sept. 2004 AuffrischungskursEffektive MITARBEITERFÜHRUNG09. – 10. Dez. 2004 SeminarKONFLIKT-MANAGEMENT21. – 22. Okt. 2004 SeminarRhetorik und Präsentation - DIE FREIE REDE07. – 08. Okt. 2004 SeminarFÜHREN und MODERIEREN von Team- undGruppenbesprechungen09. – 10. Juni 2005 SeminarErfolgreiche VERHANDLUNGSFÜHRUNG30. Sept. – 01. Okt. 2004 SeminarFortbildung im Gesundheits- undKrankenhauswesen 04/05• KrankenhausmanagementFachkundekurse Sterilisation / Desinfektion• Führungstraining, Kommunikation, TeamarbeitKonfliktmanagement, Mitarbeiterführung,Rhetorik, Präsentation, Verhandlungsführung,• Medizin und Medizintechnikonkologische/immunolog. UntersuchungsmethodenTumortherapien, Röntgen, Strahlenschutz, LSC• Biotechnologie• Psychotherapeutische ZusatzausbildungenHypnose, Autogenes Training, Verhaltenstherapie• Gedächtnisstörungen / RehabilitationNeuropsychologische Diagnostik, Tests, Gruppentraining• KindertherapieAufmerksamkeitsstörg./Hyperaktivität, Soz. Kompetenz,Hör- und Sprachentwicklung, Kinderhypnose, Kinder-AT• Ausbildung zum Supervisor / Praxisberater• Ärztl. Weiterbildung Psychotherapie (Blockform)Universität TübingenWilhelmstraße 5 , D-72074 Tübingen07071 / 29-76439, -76872, -75010 FAX: 29-5101wit@uni-tuebingen.de, http://www.wit.uni-tuebingen.de/16