Extraction d'ADN génomique - Inra

EXTRACTION D’ADN GénomiqueKit QIAGENBIOROBOT 3000SOURCE : MYLENE BALESDENT ET SON EQUIPEREDACTEUR FINAL : ANGELIQUE GAUTIERMATERIEL ET REACTIFS NECESSAIRES :■ Azote liquide (bidon de réserve bleu sous l’évier. S’il est vide, le remplir)■ Quantités suffisantes de tampons AP1 (frigidaire), AP2, AP3, AW et AE■ Racks de tubes pour l’élution (1 rack par plaque)■ Plaques de colonnes de purification (1 par plaque)■ Cônes de 1100µl (1,5 rack par plaque)■ Tubes 14 ml pour le tampon AE (2 par plaque)Remarque : Si l’un des réactifs ou consommables QIAGEN est manquant, contacter leresponsable du magasin. (A. Gautier, poste 36 74)Par précaution, ne démarrer l’extraction qu’avec des flacons de AP1 et AP2 pleins.PRECAUTIONS A PRENDRE :■ Vérifier que la quantité de mycélium ne dépasse pas 50 mg/tube■ Vérifier que la quantité de tampons est suffisante pour l’extraction■ Vérifier que le tampon AP1 contient de la RNAse et le Reagent DX (500 µl de chaquepour un flacon de 200 ml d’AP1, ne doit pas mousser). Si vous ajoutez vous-mêmes l’undes additifs, n’oubliez pas d’indiquer sur le flacon, au marqueur, que l’ajout a été effectué.■ Vérifier que les bidons de récupération des tampons sont vides■ Vérifier que le sac de collecte des cônes est vide■ Vérifier que les tampons AP3/E et AW1 (AW2) contiennent de l’éthanol. Si vous ajoutezvous-mêmes l’un des additifs, n’oubliez pas d’indiquer sur le flacon, au marqueur, quel’ajout a été effectué.■ Si le robot n’a pas été utilisé depuis plus d’une semaine, vider le « System Liquid Bottle »et remplir avec de l’eau distilléeIMPORTANT :Il ne doit pas y avoir une trop grande quantité de matériel dans les tubes (s’il y en a trop,le robot risque de prélever du culot après centrifugation, le filtre sera bouché et lesdernières étapes de l’extraction difficilement réalisables…)1

BROYAGE ET EXTRACTION :1. Placer les billes de tungstène (plutôt le soir pour remettre à congeler, sachant qu’il fautles mettre quand tout est déjà congelés dans les tubes).Une seule bille par tube, opération effectuée de façon stérile (avec des gants, sous lahotte, en manipulant les billes avec une pince stérilisée sur flamme).Remarque : deux billes dans un tube peuvent entraîner une destruction de l’ADN.2. Préparer le robot.● Mettre en marche le bain-marie (65°C) : quand il est à bonne température, y plongerla solution de tampon AP1.● Allumer la pompe péristaltique : abaisser les cassettes jusqu’à entendre un déclic● Allumer l’ordinateur et la pompe haut-débit sous la paillasse du robot.Sur l’ordinateur : Ctrl+Alt+Del :- Nom : administrator ;- Ne pas entrer de mot de passe, cliquer sur OK ;- Choisir l’icône « QIA soft4 »- Faire une « Wash procedure » (rinçage interne du robot). Tous les tuyauxdoivent être connectés à la bouteille d’eau déminéralisée du robot.- Une fois la « Wash procedure » terminée, choisir le protocole d’extraction« DNeasy 96 » pour une plaque ou « DNeasy 2x96 » pour 2 plaques.- Cliquer sur RUN (triangle vert) pour lancer le programme.Le logiciel indique les étapes successives à effectuer, il suffit de suivre sesindications. En cliquant sur NEXT on avance à l’étape suivante.En cas de problème, on peut arrêter le robot en cliquant sur le triangle rouge etrecommencer à l’étape où on en était par clic droit : « redémarrer à partir de là ».● Placer les cônes 1100 µl en carbone sur les emplacements prévus (slots 1, 2 et 3 àdroite sur le robot)● Brancher les tuyaux aux bouteilles de tampons en s’assurant que celles-ci soientbien pleines pour ne pas risquer d’avoir des bulles d’air dans les tuyaux. Les numérosdes tuyaux sont indiqués sur une petite étiquette collée vers l’extrémité- E8 AP2- E9 AP3/E (faire attention à ce que l’éthanol ait bien été ajouté)- E2 AW1 (faire attention à ce que l’éthanol ait bien été ajouté)● Placer dans les chambres à vide les blocs de métal qui évitent les contaminationsentre tubes lors de la filtrationQuand le robot est prêt, effectuer le broyage.3. Le broyage.● Plonger la plaque d’extraction dans un bac de polystyrène contenant de l’azoteliquide (30 secondes). Attention : pas toujours obligatoire car des tubes peuventcasser.● Placer la plaque au niveau du broyeur, préalablement réglé à 1min30 à unefréquence de 30 oscillations/sec. Si une seule plaque de broyage, équilibrer le broyeuravec une plaque vide. Les boîtes sont maintenues entre une plaque noire et une plaqueblanche (plaque blanche sous le support bleu, plaque noire au dessus).● Plonger de nouveau la plaque dans l’azote liquide.2

● Broyer de nouveau en inversant le sens des plaques dans le broyeur pendant 1 min30 à une fréquence de 30 oscillations/sec. (tubes au dessus au premier broyage, placésau dessous au second).4. Centrifuger 2 min à 5600 trs/min.Remarque : Après la centrifugation, enlever les bouchons avec précaution de manière àéviter la contamination des autres tubes.5. Placer les boites sur le robot (à côté des chambres à vide).6. Choisir le volume d’élution (AE) compris entre 50 et 100 µl. Généralement, 75 µlsachant que le volume sera de 150 µl au final car il y a une double étape d’élution.Dans les chambres à vide, mettre les plaques en fer puis les plaques filtres DNeasy 96.7. Brancher le tuyau E7 AP1 (65°C).Le robot va introduire dans chaque tube 400 µl d’AP1 (solution de lyse, RNaseA) puis130µl d’AP2 (précipitation des protéines, et polysaccharides lors de l’incubation). Et, lerobot agite les plaques.8. Refermer les tubes avec des bouchons neufs et mettre les plaques pendant 1 heure à+4°C ou 10 minutes à -20°C.9. Centrifuger 10 minutes à 6000g.10. Numéroter les nouveaux tubes qui collecteront l’ADN.11. Enlever les bouchons soigneusement et replacer les plaques d’échantillons sur lerobot.12. Mettre le tampon d’élution (AE) dans le bain-marie à 65°C.13. Placer les plaques filtres dans les chambres à vide.Le robot va déposer 600 µl de tampon AP3/E sur le filtre et va prélever 400 µl desurnageant des échantillons qu’il va mélanger au tampon AP3/E (précipitation de l’ADN)dans les plaques filtres.14. Le robot fait le vide.15. Vérifier s’il reste du liquide ou pas sur les filtres (si les filtres ne sont pas secs, refairele vide).16. Le robot dépose 800 µl de tampon de lavage AW1 et fait le vide. Etape répétée deuxfois. Remarque : dans le cas où on réalise l’extraction pour 2 plaques, le robot procèdeplaque par plaque.17. Les 2 plaques sont traitées en simultané lorsque il y a une seconde plaque.18. Mettre le S-block sous la plaque et centrifuger 10 min à 6000 g.19. Enlever les blocs de métal des chambres à vide et placer les boîtes contenant lestubes vides (de collecte de l’ADN) puis la plaque filtre « DNeasy 96 plate » au-dessus(attention à ce que la plaque filtre soit bien enfoncée pour que le vide puisse se faire).20. Mettre le tampon d’élution (AE, incubé à 65°C) dans les tubes réservés à cet usage :un peu plus de 8 ml dans chacun des 4 tubes.3

21. Lancer la suite de la manip : le robot teste les quantités présentes dans chaque tube.Il distribue ensuite le tampon dans les plaques, fait le vide puis recommence l’opération.22. Récupérer la plaque avec l’ADN, reboucher les tubes avec des bouchons neufs,stockage 4°C. L’ADN est stable plusieurs jours à 4°C. A long terme, congeler à -20°C.PROCEDURES DE NETTOYAGE :1. Le système hydraulique de l’automate :A la fin de l’extraction, procéder toujours au rinçage du système, comme proposé par leprogramme. Donc, remplir au maximum le flacon de rinçage d’eau déminéralisée,reconnecter tous les tuyaux à ce flacon et lancer la procédure. Vérifier que l’eau derinçage passe bien dans chaque tuyau. Reboucher les solutions tampons avec duparafilm.On ne peut se passer de ce rinçage que si l’on enchaîne dans la même journée deuxprotocoles d’extraction identiques.2. La plate-forme de l’automate :Nettoyer la plate-forme du robot avec du papier et de l’eau distillée, en particulier surl’agitateur. Pour un bon nettoyage, de nombreux éléments du robot s’enlèvent facilementde leur emplacement. Sécher avec un papier doux.3. Les chambres à vide et les « channeling blocks » :Nettoyer les chambres à vide à l’eau déminéralisée, les sécher avec un papier doux etessuyer les supports.Nettoyer à l’eau les blocs en métal (« channeling blocks ») puis les plonger 5 minutes dansdu HCl à 0.1N et rincer à l’eau déminéralisée, les sécher avec un papier doux. Ranger lesblocs enveloppés dans du papier.Ne jamais nettoyer les chambres à vide à l’éthanol, qui attaque le plastique.4. Fermer le logiciel et éteindre l’ordinateurDéclipser les cassettes et éteindre la pompe péristaltique.Eteindre la pompe haut-débit sous la paillasse du robot.Remplir la fiche d’entretien, avec mention de la date et de l’utilisateur.5. Les billes de tungstène :- Récupérer les billes et les rincer plusieurs fois à l’eau courante puis à l’eaudéminéralisée- Bain d’acide chlorhydrique HCl 0,4N pendant 5 minutes- Rincer 4 à 5 fois à l’eau distillée- Sécher sur du papier et autoclaver dans une petite bouteille6. EN PARTANT :- Vider les poubelles, y compris les 2 récipients sous le robot.- Remplacer les consommables si nécessaire (gants, cônes jaune et bleu, …)- Remplir le cahier d’utilisation précisément- Mettre le tampon AP1 restant au frigidaireVisu ADN : Gel d’agarose à 0,6%4