Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ...

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Mise au point des methods analytiques1. IntroductionA ce jour, il n’est pas clairement établi que la bioconversion de l’acide p-coumarique en4-éthylphénol dans la cellule est la seule voie de transformation de cet acidehydroxycinnamique chez Brettanomyces sp. De même, la cinétique de cette réaction n’a, ànotre connaissance, que très peu été étudiée.La première étape pour suivre les cinétiques de la bioconversion serait alors de mettre aupoint les méthodes analytiques optimales pour suivre la consommation des substrats (pcoumariqueet 4-vinylphénol) ainsi que l'apparition des produits (4-vinylphénol et 4-éthylphénol). Jusqu’à présent, l’évaluation dans un vin de la bioconversion en question étaitbasée sur la production des 4-éthylphénols. Très peu de travaux s’intéressaient au suivi del’acide p-coumarique qui pourtant est le substrat clé de toute la chaîne de production.Les méthodes analytiques destinées à l’étude des composés phénoliques dans les vins sontnombreuses, elles ont été présentées dans la partie bibliographique. Sachant que le choixd’une méthode doit prendre en compte plusieurs facteurs tels que le coût de l’analyse, ladisponibilité du matériel ainsi que la précision et la sensibilité en fonction du temps d’étude,aucune des méthodes présentées n’était adaptée dans le contexte de notre étude. Lors de nosexpériences, le nombre d’analyses d’acide p-coumarique, de 4-vinylphénols et 4-éthylphénolsdevrait être important, avec des nombreuses répétitions. Il était donc important d'optimiser lesméthodes pour le suivi de ces constituants.La première partie de ce chapitre donne les détails de la mise au point d'une méthodeHPLC-UV pour le suivi de l'acide p-coumarique. La seconde partie présente la mise au pointd'une méthode GC-MS pour l’analyse simultanée du 4-vinylphénol et du 4-éthylphénol.2. Mise au point de la Méthode de dosage de l’acide p-coumarique2.1. Validation du pic de l'acide p-coumariqueLes conditions opératoires ainsi que l'appareillage utilisé ont été présentés en détails dansla partie « Matériels et Méthodes ». Toutefois, le choix des conditions optimales a impliquéplusieurs essais et validations statistiques.Tout d'abord, l’uniformité des pics de l’acide p-coumarique a été étudiée dans unesolution hydroalcolique (10% v/v) et dans un milieu vin synthétique contenant chacun 10mg/L d’acide p-coumarique, et enfin dans un vrai vin.71
Mise au point des methods analytiquesLe temps de rétention trouvé dans les trois milieux est 12,54 ± 0,23 min (Figures 1, 2 et3). La répétabilité du temps de rétention a été vérifiée dans cette zone tout le long des essais.D'autre part, et afin de révéler les interférences des différentes matrices sur les picschromatographiques dans la zone d’élution théorique, la spécificité a été étudiée en analysantcinq échantillons exempts d’acide p-coumarique de chaque type de matrice. Aucun desmilieux n’a montré un pic significatif dans la région des temps de rétention entre 10 et 15minutes.Figure III. 1. Chromatogramme de l’acide p-coumarique dans une matrice hydroalcoolique ( 10% v/v)72
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Il l’appelait « la Saga » dans
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3.5.2. Spectroscopie en IR : Dosage
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5.2. Etude de l’évolution de la
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F• FALCETTI M., ASSELIN C. (1996)
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