Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ...
Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ... Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ...
6.2. Facteurs biochimiques et métaboliques..................................................................... 326.2.1. La souche de Brettanomyces et les enzymes.................................................... 326.2.2. La population et la phase de croissance ........................................................... 336.2.3. La source de carbone........................................................................................ 346.2.4. Le type de vin................................................................................................... 357. Contrôle et traitements ................................................................................................. 358. Outils de suivi de la bioréaction................................................................................... 369. Difficultés analytiques rencontrés lors de l’étude de la bioconversion .................... 3810. Conclusion...................................................................................................................... 39Matériels Et Méthodes.................................................................................................. 411. Etude de la bioconversion............................................................................................. 431.1. Cultures de Brettanomyces........................................................................................ 431.1.1. La souche de Brettanomyces............................................................................ 431.1.2. Milieux de cultures utilisés pour Brettanomyces ............................................. 431.1.3. Milieu tampon phosphate-citrate (MT) ............................................................ 431.2. Cultures de Saccharomyces....................................................................................... 441.2.1. Les souches de Saccharomyces........................................................................ 441.2.2. Milieux de cultures utilisés pour Saccharomyces ............................................ 441.3. Préparation des milieux............................................................................................. 451.4. Conduite des fermentations....................................................................................... 451.5. Mise des cellules en solution tampon phosphate-citrate (MT) ................................. 451.6. Ajout de l’acide p-coumarique dans les fermentations ............................................. 461.7. Prélèvement des échantillons .................................................................................... 472. Etudes physico-chimiques de l’acide p-coumarique .................................................. 472.1. Milieux d’étude ......................................................................................................... 472.2. Matériaux adsorbants ................................................................................................ 482.3. Conduite des expériences d’adsorption..................................................................... 482.4. Ajout de l’acide p-coumarique.................................................................................. 492.5. Prise des échantillons ................................................................................................ 492.6. Etude des facteurs physico-chimiques agissant sur l’adsorption par l’applicationd’un plan d’expériences ............................................................................................ 502.6.1. Analyse du modèle linéaire.............................................................................. 502.6.2. Signification des facteurs ................................................................................. 513. Méthodes analytiques.................................................................................................... 523.1. Evaluation de la biomasse ......................................................................................... 523.1.1. Numération cellulaire....................................................................................... 523.1.2. Turbidité dans le visible : Population cellulaire............................................... 533.2. Dosage des sucres...................................................................................................... 543.2.1. Yellow Spring Instrument (YSI 2700) ............................................................. 543.2.2. Chromatographie : dosage du glucose, fructose, éthanol, glycérol.................. 543.3. Dosage de l’azote assimilable ................................................................................... 553.3.1. Dosage de l’azote ammoniacal......................................................................... 553.3.2. Dosage de l’azote α-aminé ............................................................................... 563.4. Etude de l’évolution de la couleur du vin par Spectrophotométrie........................... 563.5. Dosage de l’acide p-coumarique ............................................................................... 563.5.1. Spectrophotométrie en UV............................................................................... 57
3.5.2. Spectroscopie en IR : Dosage de l’acide p-coumarique................................... 573.5.3. Résonnance magnétique nucléaire : Dosage de l’acide p-coumarique ............ 573.5.4. Chromatographie.............................................................................................. 583.5.4.1. Préparation des échantillons..................................................................... 583.5.4.2. Système et appareillage............................................................................ 583.5.4.3. Conditions opératoires.............................................................................. 593.5.4.4. Détection et quantification ....................................................................... 593.6. Dosage du 4-vinylphénol et du 4-éthylphénol .......................................................... 593.6.1. Préparation des vials......................................................................................... 593.6.1.1. La gamme d’étalonnage ........................................................................... 593.6.1.2. Les échantillons........................................................................................ 603.6.2. Système et appareillage.................................................................................... 603.6.3. Extraction du 4-vinylphénol et du 4-éthylphénol............................................. 603.6.4. Extraction des composés et concentration ....................................................... 613.6.5. Désorption du 4-vinylphénol et du 4-éthylphénol............................................ 613.6.6. Séparation des phénols volatils ........................................................................ 623.6.7. Détection : Spectroscopie de masse (MS)........................................................ 624. Lissage des données expérimentales ............................................................................ 635. Calcul des paramètres cinétiques................................................................................. 645.1. Biomasse. .................................................................................................................. 645.2. La bioconversion....................................................................................................... 645.3. Rendements et taux de production ............................................................................ 65Résultats Et Discussions .............................................................................................. 67Troisième Chapitre : « Mise au point des méthodes analytiques ».......... 691. Introduction ................................................................................................................... 712. Mise au point de la Méthode de dosage de l’acide p-coumarique ............................ 712.1. Validation du pic de l'acide p-coumarique................................................................ 712.2. Validation de la méthode analytique......................................................................... 762.2.1. Etude de la Robustesse :................................................................................... 762.2.2. Droites d’étalonnage ........................................................................................ 762.2.3. Détermination de la limite de quantification (LOQ) et de la limite de détection(LOD) ............................................................................................................... 772.2.4. Etude de la précision et du recouvrement moyen ............................................ 772.2.5. Etude de la répétabilité et de la reproductibilité............................................... 782.2.6. Etude de la quantification dans un vrai vin...................................................... 802.2.7. Etude de la stabilité des échantillons de l’acide p-coumarique........................ 802.3. Etude des paramètres de la méthode ......................................................................... 802.3.1. Paramètres géométriques.................................................................................. 812.3.1.1. Nombre de plateaux théoriques................................................................ 812.3.1.2. Asymétrie du Pic ...................................................................................... 812.3.2. Paramètres de performance .............................................................................. 822.3.2.1. Facteur de capacité ................................................................................... 822.3.2.2. Facteur de séparation................................................................................ 822.3.2.3. La résolution............................................................................................. 83
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6.2. Facteurs biochimiques et métaboliques..................................................................... 326.2.1. La souche <strong>de</strong> <strong>Brettanomyces</strong> et les enzymes.................................................... 326.2.2. La population et la phase <strong>de</strong> croissance ........................................................... 336.2.3. La source <strong>de</strong> carbone........................................................................................ 346.2.4. Le type <strong>de</strong> vin................................................................................................... 357. Contrôle et traitements ................................................................................................. 358. Outils <strong>de</strong> suivi <strong>de</strong> la bioréaction................................................................................... 369. Difficultés analytiques rencontrés lors <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la bioconversion .................... 3810. Conclusion...................................................................................................................... 39Matériels Et Métho<strong>de</strong>s.................................................................................................. 411. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> la bioconversion............................................................................................. 431.1. Cultures <strong>de</strong> <strong>Brettanomyces</strong>........................................................................................ 431.1.1. La souche <strong>de</strong> <strong>Brettanomyces</strong>............................................................................ 431.1.2. Milieux <strong>de</strong> cultures utilisés pour <strong>Brettanomyces</strong> ............................................. 431.1.3. Milieu tampon phosphate-citrate (MT) ............................................................ 431.2. Cultures <strong>de</strong> Saccharomyces....................................................................................... 441.2.1. Les souches <strong>de</strong> Saccharomyces........................................................................ 441.2.2. Milieux <strong>de</strong> cultures utilisés pour Saccharomyces ............................................ 441.3. Pré<strong>par</strong>ation <strong>de</strong>s milieux............................................................................................. 451.4. Conduite <strong>de</strong>s fermentations....................................................................................... 451.5. Mise <strong>de</strong>s cellules en solution tampon phosphate-citrate (MT) ................................. 451.6. Ajout <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> p-<strong>coumarique</strong> dans les fermentations ............................................. 461.7. Prélèvement <strong>de</strong>s échantillons .................................................................................... 472. Etu<strong>de</strong>s physico-chimiques <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> p-<strong>coumarique</strong> .................................................. 472.1. Milieux d’étu<strong>de</strong> ......................................................................................................... 472.2. Matériaux adsorbants ................................................................................................ 482.3. Conduite <strong>de</strong>s expériences d’adsorption..................................................................... 482.4. Ajout <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> p-<strong>coumarique</strong>.................................................................................. 492.5. Prise <strong>de</strong>s échantillons ................................................................................................ 492.6. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s facteurs physico-chimiques agissant sur l’adsorption <strong>par</strong> l’applicationd’un plan d’expériences ............................................................................................ 502.6.1. Analyse du modèle linéaire.............................................................................. 502.6.2. Signification <strong>de</strong>s facteurs ................................................................................. 513. Métho<strong>de</strong>s analytiques.................................................................................................... 523.1. Evaluation <strong>de</strong> la biomasse ......................................................................................... 523.1.1. Numération cellulaire....................................................................................... 523.1.2. Turbidité dans le visible : Population cellulaire............................................... 533.2. Dosage <strong>de</strong>s sucres...................................................................................................... 543.2.1. Yellow Spring Instrument (YSI 2700) ............................................................. 543.2.2. Chromatographie : dosage du glucose, fructose, éthanol, glycérol.................. 543.3. Dosage <strong>de</strong> l’azote assimilable ................................................................................... 553.3.1. Dosage <strong>de</strong> l’azote ammoniacal......................................................................... 553.3.2. Dosage <strong>de</strong> l’azote α-aminé ............................................................................... 563.4. Etu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’évolution <strong>de</strong> la couleur du vin <strong>par</strong> Spectrophotométrie........................... 563.5. Dosage <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> p-<strong>coumarique</strong> ............................................................................... 563.5.1. Spectrophotométrie en UV............................................................................... 57
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