Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ...

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Matériels et MéthodesLa concentration en cellules par mL de milieu est donnée par la relation :C =nombre decellulesnombre de grands carreauxx Dilution x 2 x 250000Pour estimer la viabilité de la population, l’échantillon est mélangé volume à volume avecdu bleu de méthylène. La solution de bleu de méthylène a la composition suivante : 0,1 g debleu de méthylène dissous dans 1 litre de citrate de sodium 2% (poids/volume). Ce réactifcolore en bleu les cellules mortes. Le pourcentage de viabilité est défini comme suit :%V =Nombre decellulesviablesx100Nombretotal decellulesAinsi, l’échantillon (après une éventuelle dilution) est mélangé volume à volume avec lasolution de bleu de méthylène. Après homogénéisation, les cellules restent en contact avec lecolorant pendant 5 minutes. Homogénéisé de nouveau, un prélèvement est ensuite étalé surune cellule de Thoma et mis au repos pendant 2 minutes. Au microscope, les cellules nonviables apparaissent bleues foncées, alors que les cellules viables restent incolores. En effet,deux hypothèses différentes sont proposées pour expliquer le mécanisme d’action du bleu deméthylène. La première explique que le bleu de méthylène se décolore dans le cytoplasmetant que les cellules possèdent une activité enzymatique fonctionelle. La deuxième hypothèsedit que le bleu de méthylène ne peut traverser la membrane plasmique de la cellule, quelorsque celle-ci devient déficiente (Chilver et al. (1978), Bonora et Mares (1982)).Toutefois, Barbin (2006) révèle un problème de quantification des levures Brettanomycespar cette méthode. Ceci est dû au grand changement morphologique et à une colorationintermédiaire (bleu clair) que prennent les Brettanomyces. Ce phénomène n’est pas encoretrès bien élucidé. Ceci ne crée pas de limitation dans notre étude, sachant que l’étude de labioréaction a toujours été effectuée lorsque la quasi-totalité de la population était viable.3.1.2. Turbidité dans le visible : Population cellulaireCette méthode consiste à mesurer la turbidimétrie du milieu de culture à une longueurd’onde donnée. Les mesures ont été effectuées dans une cuve en verre de trajet optique 10mm à 620 nm (spectrophotomètre UV-visible double faisceau).53
Matériels et MéthodesLa corrélation entre la densité optique et la concentration cellulaire est linéaire pour desvaleurs inférieures à 0,8. Au delà de cette valeur, les échantillons sont dilués et la densitéoptique corrigée est définie comme l’absorbance lue multipliée par le facteur de dilutionutilisé pour l’échantillon. L’erreur de répétabilité déterminée sur 10 mesures d’une mêmesuspension de levures est de 1%.3.2. Dosage des sucres3.2.1. Yellow Spring Instrument (YSI 2700)Pour le suivi du glucose au cours de la fermentation, il a été dosé biochimiquement grâceà l’appareil « YSI ». Le principe de ce dosage repose sur la production de peroxyded’oxygène (H 2 O 2 ) par une glucose oxydase immobilisée sur une membrane spécifique dedextrose selon la réaction :Glucose + O 2glucose oxydaseH 2 O 2 + D Glucono - d LactoneLa quantité de glucose présente dans l’échantillon est liée à la quantité de peroxyde formé. Leperoxyde diffuse vers une anode de platine où il sera oxydé selon la réaction :H 2 O 2 O 2 + 2H + +2 e -Le signal électrique est directement intégré par l’appareil qui nous donne alors laconcentration en glucose en g/L. Une dilution peut éventuellement avoir lieu afin d’être dansla zone de linéarité de la gamme de mesure de l’appareil (0-25 g/L).3.2.2. Chromatographie : dosage du glucose, fructose, éthanol, glycérol.Le glucose, le fructose, l’éthanol et le glycérol ont été analysés par chromatographieliquide, après filtration de l’échantillon sur une membrane de 0,45 μm de diamètre des pores.La séparation a été faite par chromatographie à exclusion d’ions sur une colonne cationiqueBio-Rad Aminex HPX-87H spécifique pour la séparation des alcools, acides organiques etsucres. La colonne a été thermostatée dans un four à une température de 40ºC tout au long del’analyse.54
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N° d’ordre :………………TH
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Il l’appelait « la Saga » dans
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3.5.2. Spectroscopie en IR : Dosage
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5.2. Etude de l’évolution de la
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F• FALCETTI M., ASSELIN C. (1996)
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