Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ...
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Matériels et Métho<strong>de</strong>sLa concentration en cellules <strong>par</strong> mL <strong>de</strong> milieu est donnée <strong>par</strong> la relation :C =nombre <strong>de</strong>cellulesnombre <strong>de</strong> grands carreauxx Dilution x 2 x 250000Pour estimer la viabilité <strong>de</strong> la population, l’échantillon est mélangé volume à volume avecdu bleu <strong>de</strong> méthylène. La solution <strong>de</strong> bleu <strong>de</strong> méthylène a la composition suivante : 0,1 g <strong>de</strong>bleu <strong>de</strong> méthylène dissous dans 1 litre <strong>de</strong> citrate <strong>de</strong> sodium 2% (poids/volume). Ce réactifcolore en bleu les cellules mortes. Le pourcentage <strong>de</strong> viabilité est défini comme suit :%V =Nombre <strong>de</strong>cellulesviablesx100Nombretotal <strong>de</strong>cellulesAinsi, l’échantillon (après une éventuelle dilution) est mélangé volume à volume avec lasolution <strong>de</strong> bleu <strong>de</strong> méthylène. Après homogénéisation, les cellules restent en contact avec lecolorant pendant 5 minutes. Homogénéisé <strong>de</strong> nouveau, un prélèvement est ensuite étalé surune cellule <strong>de</strong> Thoma et mis au repos pendant 2 minutes. Au microscope, les cellules nonviables ap<strong>par</strong>aissent bleues foncées, alors que les cellules viables restent incolores. En effet,<strong>de</strong>ux hypothèses différentes sont proposées pour expliquer le mécanisme d’action du bleu <strong>de</strong>méthylène. La première explique que le bleu <strong>de</strong> méthylène se décolore dans le cytoplasmetant que les cellules possè<strong>de</strong>nt une activité enzymatique fonctionelle. La <strong>de</strong>uxième hypothèsedit que le bleu <strong>de</strong> méthylène ne peut traverser la membrane plasmique <strong>de</strong> la cellule, quelorsque celle-ci <strong>de</strong>vient déficiente (Chilver et al. (1978), Bonora et Mares (1982)).Toutefois, Barbin (2006) révèle un problème <strong>de</strong> quantification <strong>de</strong>s levures <strong>Brettanomyces</strong><strong>par</strong> cette métho<strong>de</strong>. Ceci est dû au grand changement morphologique et à une colorationintermédiaire (bleu clair) que prennent les <strong>Brettanomyces</strong>. Ce phénomène n’est pas encoretrès bien élucidé. Ceci ne crée pas <strong>de</strong> limitation dans notre étu<strong>de</strong>, sachant que l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> labioréaction a toujours été effectuée lorsque la quasi-totalité <strong>de</strong> la population était viable.3.1.2. Turbidité dans le visible : Population cellulaireCette métho<strong>de</strong> consiste à mesurer la turbidimétrie du milieu <strong>de</strong> culture à une longueurd’on<strong>de</strong> donnée. Les mesures ont été effectuées dans une cuve en verre <strong>de</strong> trajet optique 10mm à 620 nm (spectrophotomètre UV-visible double faisceau).53