Bioconversion de l'acide p-coumarique par Brettanomyces ...

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Etude cinétique de la bioconversionMilieu extracellulaireMilieu intracellulaireCinnamate décarboxylaseVinylphénol réductaseAcide p-coumarique 4-vinylphénol 4-éthylphénol253 41Vinylphénol réductase6Acide p-coumarique4-vinylphénol54-éthylphénolFigure VI. 20. Différentes étapes de la bioconversion de l’acide p-coumarique en 4-éthylphénol chezBrettanomyces bruxellensisSachant que la cinnamate décarboxylase est une enzyme constitutive endocellulaire(Chatonnet et al. 1992a, Edlin et al., 1998), la transformation de l’acide p-coumarique en 4-vinylphénol se produit à l’intérieur de la cellule. Ainsi, une disparition de cet acide du milieucorrespond à une première étape, celle de sa pénétration dans le cytoplasme. Après saconversion en 4-vinylphénol (étape 2), ce dernier est excrété dans le milieu extracellulaire(étape 3), puisque nous le retrouvons par dosage dans le surnageant. Selon Tchobanov (2007),la vinylphénol réductase est aussi une enzyme constitutive. Toutefois, personne n’a prouvéjusqu’à ce jour si cette enzyme est cytoplasmique ou membranaire. Dans le premier cas, afinque le 4-vinylphénol soit en contact avec cette enzyme, il doit franchir de nouveau la barrièrede la cellule (étape 4) où il est converti en 4-éthylphénol (étape 5), ce dernier étant à son tourexcrété dans le milieu extracellulaire (étape 6). Dans le second cas, il devra être en contactavec la levure pour être réduit. Nous pouvons distinguer alors 6 vitesses (ou 5)correspondants à 6 étapes (ou 5) successives afin de passer de l’acide p-coumarique jusqu’au4-éthylphénol. Quatre étapes correspondent à des entrées ou sorties de constituants de lacellule et deux étapes à des réactions enzymatiques.153
Etude cinétique de la bioconversionLes vitesses spécifiques calculées correspondent à la disparition du coumarique (étape 1uniquement) et à l’apparition des 4-éthylphénols qui est le résultat des 6 (ou 5) étapesprécédentes. Les valeurs maximales de ces vitesses sont observées en phase de latence pour ladisparition du coumarate mais en phase stationnaire pour l’apparition du 4-éthylphénols.Lorsque le bilan instantané est constant tout au long de la bioconversion, cela signifie qu’iln’y a pas d’accumulation d’un des trois produits dans le milieu cellulaire. Les vitessesd’entrée des constituants sont donc toujours égales à celles de sortie. Il est alors raisonnablede penser que les vitesses ainsi observées sont celles des deux réactions enzymatiques. Parcontre, lorsque le bilan diminue en cours de fermentation (figure 13 et 14), cela signifie qu’undes trois composés s’accumule dans la cellule. Dans ce cas, si la vitesse de disparition del’acide p-coumarique est toujours relative à l’étape 1, celle d’apparition du 4-éthylphénol estdifficilement exploitable car elle est la conséquence des vitesses de conversion enzymatiquemais aussi des vitesses d’entrée et de sortie des constituants.Malgré les incertitudes sur ce que représentent réellement les vitesses d’apparition des 4-éthylphénols, les cinétiques trouvées dans notre étude vont dans le même sens que les travauxde Tchobanov (2007) montrant que la vinylphénol réductase s’exprime le plus intensément enphase stationnaire chez Brettanomyces bruxellensis.Pour l’acide p-coumarique, l’exploitation des vitesses spécifiques est plus simple dans lamesure où elle traduit directement la vitesse d’entrée dans la cellule. La pénétration de l’acidep-coumarique apparaît être plus rapide lorsque la cellule est en phase de latence. Ceci pourraitêtre expliqué par l’état de la paroi de la cellule encore jeune en phase de latence, alors quel’activité enzymatique n’est pas encore maximale.En observant les bilans de conversion, nous remarquons que l’acide p-coumarique esttransformé totalement en 4-éthylphénol avec un rendement de 100% seulement lorsqu’il estajouté en début de phase stationnaire. Dans les autres cas, nous trouvons un ralentissement dela bioréaction. Dans un temps similaire, le rendement en 4-éthylphénol reste inférieur à 75%.Une accumulation de l’acide p-coumarique et/ou du 4-vinylphénol dans la cellule est alorsprobable, car l’acide p-coumarique continu à disparaitre du milieu sans toutefois se retrouveren 4-éthylphénol correspondant. Cette accumulation est maximale lors de l’ajout en phase delatence puisque l’écart entre les vitesses de disparition et d’apparition est maximal. Par lasuite, le bilan revient à sa valeur initiale traduisant la disparition de l’accumulation.Par contre, la seconde partie de la bioconversion demeure inachevée, avec une présencerésiduaire du 4-vinylphénol dans le surnageant (Figure 13 et 14).154
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5.2. Etude de l’évolution de la
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