P1 蛋白質分離與定量

Protein Isolation and Quantitative AnalysisP1 蛋 白 質 分 離 與 定 量莊 榮 輝雞 蛋 的 卵 白 中 , 含 有 胰 蛋 白 (trypsin) 的 專 一 性 抑 制 劑 – 雞 卵 粘 多 醣 蛋 白(chicken ovomucoid protein, CHOM)。 本 實 驗 以 丙 酮 沈 澱 CHOM, 離 心 取 得 蛋 白 質 並乾 燥 後 , 以 Bradford method 測 定 其 蛋 白 質 含 量 。 所 得 的 CHOM 將 用 在 下 一 個 實 驗P2, 作 為 親 和 層 析 法 的 專 一 性 配 體 , 以 便 釣 取 胰 蛋 白 ; 並 且 將 在 膠 體 電 泳 實 驗 P3檢 查 其 純 度 。 鴨 蛋 蛋 白 中 也 有 類 似 的 黏 多 糖 蛋 白 DKOM, 除 了 可 以 結 合 trypsin 之 外 ,也 可 與 chymotrypsin 結 合 , 其 抽 取 純 化 方 法 與 CHOM 相 同 。1.1 背 景 知 識本 實 驗 將 展 示 : (1) 蛋 白 質 的 丙 酮 沈 澱 法 、(2) 高 速 離 心 法 、(3) 蛋 白 質 脫 鹽 , 以 及(4) Bradford 蛋 白 質 定 量 法 ; 在 以 上 各 步 驟 操 作 同 時 , 也 要 學 習 (5) 微 量 吸 管 的 校 正與 其 正 確 操 作 方 法 , 以 便 奠 定 生 化 實 驗 精 確 定 量 的 基 石 。1.1.1 蛋 白 質 沈 澱 法在 各 種 分 離 方 法 當 中 , 沈 澱 法 最 常 用 在 前 面 的 幾 個 步 驟 , 尤 其 有 許 多 方 便 的 沈澱 方 法 , 可 以 有 效 地 把 蛋 白 質 自 粗 抽 取 液 中 分 離 出 來 。a) 硫 酸 銨 沈 澱 法 : 每 個 蛋 白 質 的 分 子 表 面 上 , 都 分 布 有 若 干 比 例 的 非 極 性 區 域 ,會 凝 集 許 多 水 分 子 以 便 溶 入 水 溶 液 中 ; 若 在 此 水 溶 液 加 入 大 量 硫 酸 銨 , 則 因 為硫 酸 銨 的 高 度 水 合 能 力 , 搶 走 聚 集 在 蛋 白 質 表 面 的 水 分 子 , 使 得 蛋 白 質 表 面 的非 極 性 區 域 暴 露 出 來 , 相 互 以 疏 水 性 引 力 結 合 , 並 成 為 聚 合 體 而 沈 澱 下 來 。b) 等 電 點 沈 澱 法 : 若 把 蛋 白 質 溶 液 的 pH 調 到 其 等 電 點 , 則 此 蛋 白 質 所 帶 的 淨 電荷 為 零 , 分 子 間 的 排 斥 力 因 而 下 降 , 得 以 互 相 吸 引 成 聚 合 體 而 沈 澱 。c) 有 機 溶 劑 沈 澱 法 : 當 蛋 白 質 水 溶 液 加 入 大 量 有 機 溶 劑 , 水 分 子 濃 度 被 稀 釋 ,蛋 白 質 的 溶 解 度 便 迅 速 下 降 , 因 而 得 以 沈 澱 下 來 。 但 因 為 有 機 溶 劑 與 水 混 合後 會 產 生 熱 , 容 易 造 成 蛋 白 質 的 變 性 , 因 此 要 在 極 低 溫 下 操 作 。 常 用 的 有 機 溶劑 有 丙 酮 或 甲 醇 , 在 沈 澱 後 也 常 用 乙 醚 來 帶 走 丙 酮 , 以 加 速 乾 燥 。生 物 化 學 實 驗 P1-1

蛋 白 質 分 離 與 定 量P1d) 另 外 , 三 氯 醋 酸 (trichloroacetic acid, TCA) 是 很 強 的 蛋 白 質 變 性 劑 , 許 多 蛋 白質 遇 到 TCA 都 會 變 性 沈 澱 , 無 法 再 恢 復 原 態 。 因 此 ,TCA 對 皮 膚 有 很 強 的 腐蝕 性 , 不 小 心 接 觸 後 要 馬 上 沖 水 。 通 常 TCA 並 不 被 用 在 純 化 蛋 白 質 的 步 驟 中 ,而 是 用 來 沈 澱 或 移 除 大 部 分 蛋 白 質 。1.1.2 高 速 離 心 法離 心 是 分 離 固 態 與 液 態 最 方 便 的 方 法 , 因 此 蛋 白 質 以 上 述 方 法 沈 澱 下 來 後 , 接著 便 可 用 高 速 離 心 法 , 把 形 成 固 態 或 半 固 態 的 蛋 白 質 分 離 出 來 。 這 樣 的 離 心 都要 在 低 溫 下 進 行 , 以 免 離 心 時 產 生 高 溫 , 也 可 保 持 蛋 白 質 免 於 變 性 。 在 生 化 實驗 室 中 , 高 速 離 心 機 是 較 危 險 的 儀 器 , 一 定 要 注 意 離 心 管 是 否 正 確 平 衡 , 離 心轉 速 是 否 設 定 正 確 。 第 一 次 操 作 任 何 離 心 機 時 , 一 定 要 有 熟 練 的 人 員 在 旁 監督 , 以 免 發 生 危 險 。1.1.3 蛋 白 質 脫 鹽脫 鹽 是 一 種 重 要 的 生 化 操 作 , 可 以 把 小 分 子 與 巨 分 子 分 離 開 來 , 是 生 化 實 驗 常用 的 步 驟 , 通 常 脫 鹽 效 果 的 好 壞 , 對 下 一 步 實 驗 有 決 定 性 的 影 響 。 有 下 面 幾 種方 法 可 以 應 用 :a) 透 析 袋 : 是 最 常 用 的 方 法 , 透 析 袋 有 各 種 大 小 不 同 的 網 目 , 可 以 分 開 分 子 量不 同 的 大 小 分 子 。 常 見 的 透 明 年 糕 紙 , 也 有 近 似 透 析 袋 的 作 用 ; 而 香 腸 的 腸 衣也 正 是 一 種 透 析 膜 , 可 以 透 出 水 分 及 小 分 子 。b) 膠 體 過 濾 法 : 可 以 依 照 分 子 量 大 小 不 同 來 進 行 分 離 , 利 用 膠 體 小 球 內 的 孔 道 ,使 小 分 子 進 入 而 被 延 滯 在 膠 球 內 , 大 分 子 則 得 以 迅 速 流 出 , 因 而 去 除 了 鹽 類 ,達 成 脫 鹽 的 效 果 。c) 超 微 薄 膜 過 濾 : 超 微 薄 膜 是 一 層 具 有 極 小 孔 俓 的 薄 膜 , 可 以 區 別 分 子 的 大 小 ,小 分 子 如 鹽 類 可 以 通 過 微 膜 , 大 分 子 則 被 留 住 , 因 而 去 除 鹽 類 ; 通 常 使 用 超 微薄 膜 過 濾 都 需 加 壓 , 以 增 加 小 分 子 通 過 的 速 率 。1.1.4 蛋 白 質 定 量蛋 白 質 定 量 是 最 基 本 的 生 化 操 作 , 方 法 也 很 多 , 但 其 原 理 都 還 是 根 基 於 蛋 白 質分 子 的 基 本 構 造 。 早 先 使 用 Biuret method, 是 根 據 蛋 白 質 骨 架 與 銅 離 子 結 合 ,利 用 所 產 生 的 還 原 力 呈 色 ; 而 Lowry method 是 以 Biuret method 為 基 礎 , 再 加上 蛋 白 質 中 Tyr 側 基 的 呈 色 , 使 得 分 析 更 為 靈 敏 。 最 近 則 使 用 染 料 CoomassieBrilliant Blue G-250 (CBG) 的 蛋 白 質 結 合 試 劑 ; 當 蛋 白 質 與 CBG 結 合 之 後 ,CBG 由 茶 色 變 成 藍 色 , 呈 色 濃 淡 與 蛋 白 質 量 成 正 比 , 稱 為 Bradford method。蛋 白 質 的 定 量 方 法 實 在 是 太 基 本 了 , 因 此 會 重 複 出 現 在 很 多 相 關 課 程 中 。P1-2 Biochemistry Laboratory

蛋 白 質 分 離 與 定 量P11.2 以 丙 酮 沈 澱 法 分 離 CHOM本 實 驗 之 操 作 分 成 兩 大 部 分 :(1) CHOM 沈 澱 分 離 及 (2) Bradford 蛋 白 質 定 量 法 ;分 在 兩 週 內 操 作 。 每 次 操 作 前 , 請 檢 查 所 有 試 劑 及 儀 器 , 確 實 瞭 解 其 使 用 原 理 及 操作 方 式 。 雖 然 本 文 的 抽 取 對 象 是 CHOM, 但 可 完 全 應 用 在 DKOM 的 純 化 。1.2.1 儀 器 設 備a) 燒 杯 (500 mL) 若 干 個 。b) 電 磁 攪 拌 器 及 攪 拌 子 。c) 冰 桶 ( 及 碎 冰 )。d) 離 心 管 、 離 心 轉 陀 及 雙 皿 天 平 。e) 高 速 冷 凍 離 心 機 。f) 透 析 用 大 燒 杯 (2 L)。g) 透 析 袋 及 透 析 夾 。h) 其 他 儀 器 : 微 量 天 平 、 酸 鹼 度 試 紙 。1.2.2 藥 品 試 劑a) 卵 白 : 雞 蛋 2 個 可 收 約 50 mL 卵 白 。b) TCA- 丙 酮 (0.5 M TCA : 丙 酮 = 1 : 2, v/v): 可 把 卵 白 中 的 雜 質 以 沈 澱 移 除 。c) 丙 酮 : 高 濃 度 的 冰 凍 丙 酮 可 以 把 CHOM 蛋 白 質 沈 澱 下 來 。1.2.3 操 作 步 驟卵 白 以 TCA 沈 澱 :1) 準 備 雞 蛋 2 個 , 取 出 卵 白 50 mL, 置 入 一 個 500 mL 燒 杯 中 。2) 加 入 50 mL TCA- 丙 酮 , 邊 加 邊 攪 拌 , 漸 漸 成 為 白 色 泡 狀 , 攪 拌 1 min。◆ 注 意 TCA 對 皮 膚 有 腐 蝕 性 。3) 離 心 10 min (6,000 g) 後 取 上 清 , 加 入 2 倍 體 積 的 冰 凍 丙 酮 , 生 成 沈 澱 ; 在 4℃下 靜 置 10 min。◆ 離 心 的 時 候 , 請 排 隊 聽 從 助 教 的 指 揮 , 以 便 順 利 上 離 心 機 。4) 儘 量 倒 去 上 清 , 沈 澱 再 次 離 心 10 min (6,000 g), 挖 出 沈 澱 溶 於 純 水 (10 mL),pH 大 約 為 4.5, 然 後 在 4℃ 下 對 1 L 純 水 透 析 。5) 每 天 換 一 次 4℃ 純 水 , 至 少 換 兩 次 。 第 一 週 實 驗 先 做 到 這 一 步 。P1-4 Biochemistry Laboratory

蛋 白 質 分 離 與 定 量P1以 丙 酮 沈 澱 出 CHOM:6) 透 析 後 若 產 生 沈 澱 , 要 離 心 10 min (6,000 g) 去 除 之 。7) 加 入 4 倍 體 積 的 冰 凍 丙 酮 , 應 該 會 產 生 大 量 沈 澱 , 可 放 在 -20℃ 冰 箱 靜 置 。8) 高 速 離 心 10 min (10,000 rpm) 後 倒 去 上 清 , 白 色 沈 澱 的 表 面 小 心 以 丙 酮 洗 過 數次 ( 可 以 再 用 少 量 乙 醚 洗 過 ), 置 排 煙 櫃 中 使 沈 澱 稍 微 乾 燥 。9) 加 入 5 mL 蒸 餾 水 輕 輕 震 盪 溶 解 , 以 一 個 新 的 15 mL 試 管 裝 起 , 標 明 CHOM 及組 別 、 日 期 , 交 給 助 教 冷 藏 保 管 , 後 面 的 實 驗 要 用 到 , 首 先 要 以 Bradford method測 量 其 蛋 白 質 濃 度 。1.3 以 Bradford 法 定 量 蛋 白 質Bradford dye-binding method 是 利 用 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) 可 與 蛋 白質 結 合 而 變 色 的 特 性 來 定 量 (Bradford, 1976); 若 試 樣 中 的 蛋 白 質 量 較 多 , 則 結 合 到蛋 白 質 而 變 色 的 CBG 也 多 , 因 而 呈 色 較 深 。 下 例 是 以 一 組 標 準 蛋 白 質 為 對 象 , 製作 一 條 蛋 白 質 量 與 吸 光 度 的 標 準 校 正 線 。1.3.1 儀 器 用 具a) ELISA 光 度 計 (Dynatech) 可 在 30 s 內 測 完 一 片 滴 定 盤 。b) 微 量 滴 定 盤 (96-well microtiter plate) 及 微 量 試 管 。1.3.2 藥 品 試 劑a) 磷 酸 緩 衝 液 (phosphate buffered saline, PBS) 10 mL。b) BSA 標 準 品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL) 2 mL。c) CHOM 樣 本 溶 液 : 由 1.2 純 化 所 得 的 CHOM 水 溶 液 ( 未 知 濃 度 )。d) Dye Reagent (Bio-Rad 500-0006) 先 以 水 稀 釋 四 倍 後 備 用 , 每 組 5 mL。◆ 以 染 料 Coomassie Brilliant Blue G-250 配 製 的 定 量 專 用 溶 液 , 勿 與 膠 體 電 泳 染 色 用的 CBR-250 混 淆 , 兩 者 各 有 其 使 用 上 的 限 制 , 不 要 混 用 。1.3.3 樣 本 溶 液 及 標 準 品樣 本 溶 液 :表 1-1 以 上 述 CHOM 樣 本 溶 液 (c) 準 備 兩 種 濃 度 :Label 樣 本 溶 液 (c) Buffer P Final Conc.X1 250 μL 0 μL ? μg/mL 混 合 均 勻X2 125 μL 125 μL ? μg/mL 混 合 均 勻生 物 化 學 實 驗 P1-5

蛋 白 質 分 離 與 定 量P1標 準 品 系 列 :表 1-2 使 用 小 試 管 準 備 一 組 BSA (b) 標 準 品 的 系 列 稀 釋 :Label BSA (b) Buffer P Final Conc.#5 250 μL 0 μL 100 μg/mL 混 合 均 勻#4 200 μL 50 μL 80 μg/mL 混 合 均 勻#3 150 μL 100 μL 60 μg/mL 混 合 均 勻#2 100 μL 150 μL 40 μg/mL 混 合 均 勻#1 50 μL 200 μL 20 μg/mL 混 合 均 勻#0 0 μL 250 μL 0 μg/mL 混 合 均 勻◆ 配 製 一 定 要 精 準 , 否 則 校 正 直 線 不 會 準 確 ; 各 種 試 劑 的 添 加 , 若 自 稀 往 濃 取 樣 ,則 可 以 不 用 換 吸 管 頭 。 請 儘 量 節 省 吸 管 頭 、 微 量 離 心 管 等 塑 膠 用 具 。一 般 樣 本 :a) 通 常 由 PBS 所 溶 解 的 樣 本 , 都 可 直 接 進 行 蛋 白 質 定 量 分 析 ; 但 若 其 中 含 有 某 干擾 因 子 ( 如 Triton), 或 樣 本 濃 度 太 濃 , 都 必 須 將 樣 本 稀 釋 後 再 測 。b) 同 一 樣 本 若 使 用 不 同 的 稀 釋 濃 度 , 則 所 測 出 來 的 最 終 蛋 白 質 濃 度 可 能 會 有 差異 , 通 常 是 以 稀 釋 度 大 者 較 為 準 確 。1.3.4 方 法 步 驟1) 每 槽 先 加 好 50 μL 標 準 品 (#0, #1 .... #5) 或 未 知 樣 本 (X1, X2), 以 二 重 複 加 入96 孔 滴 定 盤 中 , 如 圖 P1-2 所 示 。200 μL CBG Dye(d)50 μL Sample(f or g)( 混 合 均 勻 )blank for ELISA readerin duplicate1 2 3A XB XC XD XE XF XG XH X#5#4#3#2#1#0X1X2圖 P1-2 微 量 滴 定 盤 的 配 置 與 使 用 方 法2) 每 槽 再 加 入 200 μL Dye-Reagent (d), 在 全 部 樣 本 槽 加 完 前 , 不 要 中 斷 添 加 ; 同時 小 心 避 免 氣 泡 產 生 。◆ 本 步 驟 是 實 驗 成 敗 的 關 鍵 ! 加 完 後 必 須 混 合 均 勻 , 否 則 定 量 不 會 準 確 。3) 輕 拍 滴 定 盤 一 側 , 使 添 加 的 各 成 份 均 勻 混 合 , 注 意 Dye-Reagent 密 度 較 大 , 很P1-6 Biochemistry Laboratory

蛋 白 質 分 離 與 定 量P1容 易 沉 積 在 下 方 而 分 層 。 若 還 有 小 氣 泡 , 小 心 以 大 頭 針 刺 破 。4) 靜 置 室 溫 10 min 後 , 以 ELISA reader 測 量 570 nm ( 或 595 nm) 的 吸 光 值 。1.4 結 果 與 報 告1.4.1 蛋 白 質 分 離a) 以 條 列 方 式 , 把 你 的 分 離 過 程 及 步 驟 , 照 實 況 寫 下 , 勿 直 接 抄 襲 1.2.3 節 。b) 請 說 明 在 你 操 作 過 程 中 , 可 能 的 任 何 問 題 , 以 及 所 觀 察 的 特 殊 現 象 。1.4.2 蛋 白 質 定 量a) 在 作 圖 紙 上 畫 出 標 準 品 的 校 正 線 , 並 決 定 樣本 溶 液 的 濃 度 ( 如 圖 P1-3)。b) 請 說 明 本 分 析 方 法 的 原 理 , 並 特 別 以 蛋 白 質構 造 來 說 明 。c) 一 般 緩 衝 液 或 試 劑 中 , 何 種 添 加 物 會 影 響Bradford 法 的 呈 色 ?Absorbance, 570 nmd) 請 列 出 本 分 析 方 法 的 各 操 作 步 驟 中 , 哪 些 會影 響 分 析 的 準 確 度 ?e) 還 有 哪 些 蛋 白 質 的 定 量 方 法 ? 並 請 比 較 其優 劣 點 。0Protein圖 P1-3 繪 製 標 準 品 校 正 線1.5 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 116, 140, 193蘇 仲 卿 張 珍 田 莊 榮 輝 (1981) 利 用 親 和 層 析 法 分 離 猪 胰 臟 蛋 白 質 水 解 酵 素 trypsin 和chymotrypsin 之 中 間 規 模 試 驗 。 中 國 農 業 化 學 會 誌 。19: 218-226Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.89生 物 化 學 實 驗 P1-7

Affinity ChromatographyP2 親 和 層 析 法莊 榮 輝親 和 層 析 法 有 點 像 在 釣 魚 。 釣 竿 是 蟹 殼 幾 丁 質 , 釣 餌 是 上 次 純 化 的 CHOM, 用 來釣 胰 臟 抽 取 液 中 的 胰 蛋 白 trypsin; 這 是 因 為 CHOM 對 trypsin 有 專 一 性 吸 引 力 。蛋 白 質 間 的 專 一 性 吸 引 力 , 已 成 為 最 近 生 物 化 學 探 討 的 重 要 主 題 。若 A 與 B 兩 分 子 之 間 , 有 專 一 性 的 親 和 力 , 而 我 們 手 中 已 有 A; 若 欲 由 樣 本混 合 物 中 , 將 所 含 的 B 分 子 分 離 出 來 , 則 最 方 便 的 方 法 , 是 先 把 A 固 定 在 一 固 定 相(solid phase) 上 , 當 樣 本 混 合 物 通 過 此 固 定 相 時 , 其 中 的 B 分 子 即 被 A 吸 附 到 固 定相 。 俟 洗 去 混 合 物 中 其 它 雜 質 後 , 破 壞 A-B 之 間 的 吸 引 力 , 溶 離 下 B, 即 可 得 到 純質 B。 親 和 層 析 法 是 很 有 效 的 純 化 方 法 , 但 並 非 任 何 物 質 均 可 應 用 此 法 , 因 為 不 一定 能 找 到 對 它 有 親 和 力 的 分 子 。 因 此 , 進 行 親 和 層 析 法 之 第 一 條 件 為 , 尋 找 分 子 之間 具 有 親 和 力 的 配 對 :[A][B]而 其 解 離 常 數 ,K d = ──── ~ 10[AB]A + B = AB [ 式 1]可 以 用 圖 P2-1 說 明 親 和 層 析 法 的 進 行 步 驟 :-4至 10 -8 ; 親 和 力 大 小 須 適 中 。 [ 式 2]AX(1) (2) (3)B Washing ElutionAASampleB固 相 擔 体親 和 基 團配 體XB圖 P2-1 親 和 層 析 法 的 作 用 機 理生 物 化 學 實 驗 P2-1

親 和 層 析 法P21) 分 子 A 已 經 被 結 合 到 固 相 擔 体 上 ( 斜 線 部 份 ), 樣 本 準 備 通 過 之 , 其 中 含 有 所 要 分離 的 B 分 子 (◆) 以 及 雜 質 (●)。2) 當 樣 本 通 過 此 親 和 吸 著 劑 時 , 只 有 B 被 吸 著 住 , 其 餘 雜 質 將 直 接 流 出 。3) 破 壞 AB 分 子 之 間 的 親 和 力 , 即 可 收 穫 得 純 質 B。2.1 親 和 層 析 法 的 各 項 要 素要 成 功 建 立 一 個 良 好 的 親 和 層 析 法 , 必 須 考 慮 幾 個 重 要 因 素 , 以 圖 P2-2 說 明 之 :Ligand (A)(3)CouplingReaction(1)Solid MatrixB(2)Specific BBindingSubstance (B)AElution(4)BB圖 P2-2 親 和 層 析 法 的 各 項 要 素2.1.1 良 好 的 固 相 擔 体 (solid support)固 相 擔 体 的 材 質 要 有 良 好 多 孔 性 , 通 透 性 佳 , 構 成 的 分 子 骨 架 本 身 穩 定 , 無 太大 的 非 專 一 性 吸 附 ; 最 重 要 的 是 要 具 有 相 當 活 性 的 官 能 基 (functional group),以 便 與 其 它 分 子 鍵 結 。 通 常 用 作 擔 体 的 材 質 有 : 洋 菜 醣 (agarose)、 聚 丙 烯 醯胺 (polyacrylamide)、 幾 丁 質 (chitin)、 聚 苯 乙 烯 (polystyrene)。2.1.2 Ligand 及 其 專 一 性 結 合 分 子配 體 (ligand, 即 鍵 結 在 固 相 擔 体 上 分 子 之 統 稱 ) 與 其 目 標 分 子 之 間 , 要 有 相 當強 的 親 和 力 ( 如 上 述 ); 例 如 抗 原 - 抗 体 、 酵 素 - 基 質 、 荷 爾 蒙 - 受 体 (receptor)、酵 素 - 抑 制 因 子 ( 如 trypsin 與 CHOM)。 一 般 把 較 容 易 得 到 的 分 子 做 為 餌 , 結合 到 固 相 擔 体 上 , 成 為 親 和 吸 著 劑 (affinity adsorbent)。2.1.3 Ligand 與 固 相 擔 体 間 之 的 耦 合 反 應Ligand 與 固 相 擔 体 之 間 , 須 有 官 能 基 可 供 鍵 結 反 應 ..固 相 擔 体 -X + Y-Ligand → 固 相 擔 体 -x-y-Ligand [ 式 3]常 用 的 耦 合 反 應 如 下 列 幾 種 :P2-2 Biochemistry Laboratory

親 和 層 析 法P2a) 以 carbodiimide 進 行 脫 水 反 應 , 連 結 胺 基 與 酸 基 。b) 以 CNBr 活 化 agarose 醣 分 子 上 的 醇 基 , 可 接 上 蛋 白 質 的 胺 基 。c) 固 相 接 有 N-hydroxysuccinimide ( 可 看 作 活 化 的 酸 基 ), 可 與 胺 基 反 應 。d) 以 glutaraldehyde ( 分 子 上 有 雙 醛 基 ) 為 中 間 架 橋 物 , 可 連 接 兩 個 胺 基 。2.1.4 可 溶 離 下 所 要 分 離 之 目 標 分 子可 改 變 溶 離 的 pH、 離 子 強 度 或 其 它 方 法 ; 注 意 某 些 方 法 可 能 會 使 ligand 或 所欲 純 化 之 分 子 , 受 到 不 同 程 度 的 破 壞 。 因 此 , 所 選 用 的 親 和 性 配 對 , 兩 者 間 的親 和 力 也 不 能 太 大 , 否 則 很 難 把 結 合 上 去 的 蛋 白 質 溶 離 下 來 。2.1.5 實 驗 大 綱P2 親 和 層 析 法P1CHOM親 和 吸 著 劑Glutaraldehyde幾 丁 質親 和 層 析 法胰 臟 抽 取 液PX PX親 和 吸 著 劑酸 溶 離清 洗未 吸 著 部 份活 性 分 析TrypsinBradfordmethodS3 酵 素 動 力 學 S2 免 疫 轉 印S1 免 疫 電 泳P3 膠 體 電 泳 P4 膠 體 過 濾圖 P2-3 製 備 親 和 吸 著 劑 與 親 和 層 析 法 流 程先 做 好 親 和 吸 著 劑 , 裝 入 管 柱 後 通 入 胰 臟 抽 取 液 , 再 以 酸 溶 離 出 所 要 的 酵 素 。 如 此 所的 到 的 酵 素 純 度 很 高 , 將 應 用 在 後 面 的 許 多 實 驗 , 是 個 非 常 關 鍵 的 步 驟 。生 物 化 學 實 驗 P2-3

親 和 層 析 法P22.2 實 驗 操 作本 實 驗 先 製 備 幾 丁 質 親 和 吸 著 劑 , 然 後 再 加 入 胰 臟 抽 取 液 , 進 行 親 和 層 析 法 。 所 有操 作 前 , 請 檢 查 所 有 試 劑 及 儀 器 , 並 確 實 瞭 解 其 使 用 及 操 作 方 法 。2.2.1 儀 器 設 備a) 小 型 塑 膠 管 柱 (0.5×5 cm) 或 用 注 射 針 筒 亦 可 。b) 分 劃 收 集 器 (Pharmacia 或 Gilson): 若 無 分 劃 收 集 器 , 以 液 體 高 度 估 計 體 積 。c) 小 試 管 20 支 及 試 管 架 。c) ELISA 光 度 計 (Dynatech)。d) 微 量 滴 定 盤 (96-well microtiter plate)。2.2.2 藥 品 試 劑a) Chitin ( 幾 丁 質 ).. 蟹 殼 曬 乾 , 磨 粉 過 篩 後 , 以 強 酸 、 強 鹼 處 理 得 之 。b) CHOM ( 雞 卵 白 粘 多 醣 蛋 白 )..P1 實 驗 所 純 化 的 CHOM 溶 液 。c) Glutaraldehyde ( 戊 二 醛 30%).. 具 雙 官 能 基 的 連 結 劑 。d) Tris-HCl 緩 衝 液 (0.1 M, pH 7.5)。f) 胰 臟 抽 取 液 (PX) 每 組 8 mL: 取 pancreatin 5 g 溶 於 200 mL Tris-HCl 緩 衝 液 ,充 分 攪 拌 後 , 加 入 5 g 矽 藻 土 , 並 以 過 濾 得 到 清 澈 的 PX 溶 液 。g) Coomassie Brilliant Blue G-250.. 蛋 白 質 定 量 呈 色 用 ( 見 P1, 1.3)。h) 甲 酸 液 (0.1 M, pH 2.05).. 改 變 pH 以 便 溶 離 trypsin 下 來 。i) BAPNA 合 成 基 質 液 (benzoyl-arginine p-nitroanilide): 可 被 trypsin 水 解 呈 黃 色 。配 製 法 : 取 BAPNA 43.5 mg 加 入 1 mL DMSO 懸 濁 均 勻 , 等 約 1 h 完 全 溶 解 ,慢 慢 滴 入 100 mL Tris (0.05 M, pH 8.2, 含 20 mM CaCl 2 ) 同 時 快 速 攪 拌 。2.2.3 親 和 吸 著 劑 之 製 備1) 取 幾 丁 質 2 g, 盡 量 除 去 水 分 , 置 於 15 mL 塑 膠 離 心 管 中 。2) 加 入 4 mL CHOM 液 , 均 勻 懸 著 之 ( 剩 下 的 CHOM 請 保 留 起 來 )。3) 加 0.1 mL 25% glutaraldehyde, 封 口 後 混 合 均 勻 。4) 在 室 溫 反 應 30~60 min, 不 時 輕 輕 上 下 倒 轉 , 均 勻 混 合 。5) 以 傾 倒 法 用 蒸 餾 水 洗 若 干 次 , 最 後 加 適 量 Tris-HCl 緩 衝 液 懸 濁 之 。6) 裝 入 管 柱 , 俟 沉 降 後 用 10 mL 緩 衝 液 流 洗 , 讓 Tris-HCl 慢 慢 通 過 , 洗 約 數 分 鐘後 備 用 。P2-4 Biochemistry Laboratory

親 和 層 析 法P22.2.4 親 和 層 析 法 之 操 作1) 如 上 準 備 好 親 和 層 析 管 柱 , 在 Tris-HCl 緩 衝 液 平 衡 完 全 後 , 塞 住 出 口 , 吸 去 吸著 劑 上 方 的 液 体 , 但 勿 使 吸 著 劑 乾 掉 。2) 小 心 加 入 8 mL 之 胰 臟 抽 取 液 (PX), 不 可 弄 亂 吸 著 劑 表 面 。3) 打 開 出 口 , 調 整 流 速 約 每 4 s 一 滴 。◆ 請 事 先 作 好 收 集 試 管 的 準 備 : 取 4 mL 水 置 入 試 管 中 , 並 在 其 液 面 高 度 做 記 號 ,然 後 以 所 收 集 流 出 液 的 高 度 , 作 為 每 一 分 劃 的 依 據 。4) 馬 上 收 集 流 出 液 , 大 約 每 4 mL ( 或 80 滴 ) 收 一 支 , 約 收 8 支 試 管 ; 同 時 注 意 勿使 吸 著 劑 乾 掉 , 當 PX 完 全 沒 入 吸 著 劑 表 面 後 , 小 心 追 加 Tris-HCl。5) 收 集 8 支 試 管 後 , 關 住 出 口 ; 每 支 分 別 取 樣 50 μL, 以 Bradford method 檢 測 蛋白 質 的 量 , 到 後 面 的 試 管 應 該 已 經 完 全 洗 淨 , 若 尚 未 洗 淨 , 再 洗 數 支 試 管 。◆ 若 有 必 要 , 可 以 收 集 蛋 白 質 濃 度 較 高 的 幾 隻 試 管 , 再 通 過 一 次 親 和 管 柱 。6) 再 次 吸 去 吸 著 劑 上 方 之 液 体 , 改 加 入 0.1 M 甲 酸 液 (pH 2.05), 打 開 出 口 , 流 速降 為 每 8 s 一 滴 , 馬 上 收 集 流 出 液 , 每 2 mL 收 一 支 , 收 集 4 支 後 暫 停 。7) 每 支 試 管 取 50 μL 以 Bradford method 檢 測 蛋 白 質 量 , 應 在 前 面 一 兩 支 出 現 。8) 同 法 取 樣 50 μL, 在 微 量 滴 定 盤 上 加 入 200 μL BAPNA 液 , 混 合 後 稍 稍 加 溫 ,樣 本 中 若 有 trypsin, 則 呈 黃 色 反 應 ; 以 ELISA 光 度 計 記 下 吸 光 值 (A 405 )。◆ 注 意 : 前 面 所 收 集 的 8 支 試 管 也 可 以 作 BAPNA 活 性 分 析 。9) 吸 著 劑 可 用 0.1 M Tris-HCl 洗 過 後 重 複 使 用 ; 但 本 次 實 驗 完 成 後 丟 棄 之 。10) 取 呈 色 最 深 的 一 或 兩 支 試 管 ( 步 驟 6 中 ) 置 入 一 隻 全 新 15 mL 離 心 管 , 寫 好 組別 後 交 出 , 下 面 實 驗 將 以 電 泳 檢 定 之 ( 分 子 量 及 純 度 )。◆ 若 有 兩 隻 呈 色 相 同 , 可 以 混 合 後 交 出 。2.3 結 果 與 報 告2.3.1 實 驗 結 果a) 以 條 列 方 式 , 把 整 個 實 驗 過 程 及 步 驟 , 一 一 寫 下 來 , 請 勿 直 接 抄 襲 2.2 節 。b) 收 集 所 測 得 的 吸 光 值 作 為 y 軸 , 並 以 各 分 劃 為 x 軸 , 製 作 色 析 圖 譜 。 可 製 作 得兩 條 吸 光 曲 線 , 一 為 蛋 白 質 含 量 , 另 一 為 酵 素 活 性 , 類 似 下 面 圖 P2-4。2.3.2 附 註 說 明 :a) 親 和 層 析 法 的 純 化 效 果 非 常 好 , 但 非 萬 能 , 有 許 多 限 制 與 缺 點 , 應 當 注 意 :1) 並 非 所 有 的 物 質 都 可 找 到 具 有 親 和 力 的 ligand, 也 非 所 有 的 物 質 均 能 有 效生 物 化 學 實 驗 P2-5

親 和 層 析 法P2地 誘 導 出 抗 体 。 請 試 著 舉 出 自 然 界 中 , 所 有 可 能 的 專 一 性 配 對 分 子 。2) 經 常 要 使 用 強 烈 的 條 件 , 去 溶 離 下 所 要 的 物 質 ( 例 如 用 pH 2), 因 而 不 免 破壞 物 質 的 穩 定 性 與 活 性 。 幸 運 的 是 ,trypsin 在 酸 性 環 境 下 相 當 安 定 。3) 有 時 非 專 一 性 吸 附 很 難 避 免 , 純 化 效 果 會 打 折 扣 ; 如 何 避 免 之 ?b) 圖 2-4 為 親 和 層 析 法 的 典 型 溶 離 圖 形 。 以 本 實 驗 為 例 , 先 洗 去 許 多 雜 質 , 可 能有 些 過 量 的 酵 素 活 性 出 現 在 後 端 (*); 再 用 甲 酸 溶 離 ( 箭 頭 處 ), 即 可 收 得 所 要的 trypsin。 為 何 甲 酸 可 以 把 吸 附 上 去 的 蛋 白 質 溶 離 下 來 ?c) 每 一 個 分 離 階 段 的 樣 本 , 都 可 以 收 集 起 來 , 再 以 電 泳 分 析 其 蛋 白 質 成 份 。 圖P2-5 是 圖 P2-4 所 收 得 樣 本 的 電 泳 結 果 , 並 以 兩 種 不 同 電 泳 來 檢 視 所 含 的 蛋 白質 , 請 嘗 試 解 釋 所 得 電 泳 圖 譜 的 意 義 。d) 我 們 將 在 下 一 個 實 驗 進 行 各 種 電 泳 , 分 析 本 實 驗 所 得 到 的 純 化 產 物 。DiscSDS*A B C& D圖 P2-4 典 型 的 親 和 層 析 圖 譜A B C D圖 P2-5 電 泳 分 析 結 果2.4 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 68, 128蘇 仲 卿 張 珍 田 莊 榮 輝 (1981) 利 用 親 和 層 析 法 分 離 猪 胰 臟 蛋 白 質 水 解 酵 素 trypsin 和chymotrypsin 之 中 間 規 模 試 驗 。 中 國 農 業 化 學 會 誌 。19: 218-226Affinity chromatography - Principles and methods, PharmaciaNelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.91Scopes RK (1996) Protein purification - Principles and practice, 3rd ed, Springer-VerlagP2-6 Biochemistry Laboratory

Polyacrylamide Gel ElectrophoresisP3 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 電 泳莊 榮 輝3.1 電 泳 原 理帶 電 分 子 在 電 場 中 能 夠 移 動 , 稱 作 泳 動 , 泳 動 的 程 度 稱 為 泳 動 率 (mobility)..泳 動 率 ~( 所 外 加 電 壓 mV) × ( 分 子 之 淨 電 荷 )──────────────────分 子 與 介 質 間 之 摩 擦 力上 述 之 摩 擦 力 , 決 定 於 此 分 子 之 大 小 、 形 狀 。 分 子 量 大 者 摩 擦 力 大 , 泳 動 率 小 ; 球形 分 子 摩 擦 力 較 小 , 泳 動 率 大 。 而 分 子 在 環 境 pH 的 影 響 下 , 可 能 帶 不 同 淨 電 荷 :當 環 境 pH = 分 子 之 pI 時 , 此 分 子 之 淨 電 荷 為 零 (pI 為 等 電 點 );當 環 境 pH < 分 子 之 pI 時 , 此 分 子 之 淨 電 荷 為 正 ;當 環 境 pH > 分 子 之 pI 時 , 此 分 子 之 淨 電 荷 為 負 。電 泳 系 統 中 , 電 子 由 負 極 流 向 正 極 ; 帶 負 電 的 分 子 往 正 極 跑 , 帶 正 電 的 分 子 往負 極 跑 , 不 帶 電 者 則 不 動 。 大 部 分 電 泳 系 統 的 pH 定 在 8.3, 在 此 pH 下 凡 是 pI 小於 8.3 的 分 子 均 帶 負 電 荷 , 都 可 以 往 正 極 跑 。3.1.1 電 泳 的 發 展電 泳 需 有 一 介 質 , 作 為 電 泳 之 場 所 。 最 早 是 在 溶 液 中 進 行 , 但 因 在 溶 液 擴 散 現象 嚴 重 , 故 改 用 固 相 的 濾 紙 ; 但 又 因 濾 紙 與 分 子 間 摩 擦 力 太 大 , 後 來 多 改 用 半固 態 的 膠 体 , 如 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 (polyacrylamide gel)、 洋 菜 醣 (agarose) 或 澱 粉(starch)。蛋 白 質 電 泳 以 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 應 用 最 廣 , 其 中 又 以 膠 体 有 無 加 入 SDS, 分為 SDS-PAGE 及 non-denaturing PAGE ( 原 態 電 泳 )。 SDS 為 一 種 介 面 活 性 劑 ,會 破 壞 分 子 構 形 , 並 在 分 子 表 面 均 勻 塗 佈 一 層 SDS 負 電 分 子 , 蛋 白 質 分 子 不論 原 來 帶 正 或 負 電 , 均 可 往 正 極 跑 , 泳 動 率 與 分 子 量 成 反 比 。 因 此 SDS-PAGE可 用 來 測 定 蛋 白 質 的 分 子 量 , 但 所 測 得 的 是 變 性 狀 態 (denatured) 之 分 子 量 ,與 原 態 (native) 分 子 量 可 能 不 同 。 不 加 SDS 之 non-denaturing PAGE, 則 泳 動率 與 其 分 子 之 電 荷 、 分 子 大 小 、 分 子 形 狀 等 均 有 關 係 , 較 難 預 測 。生 物 化 學 實 驗 P3-1

膠 體 電 泳 法P33.1.2 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体1) 膠 体 組 成 之 主 要 成 分 : 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 的 形 成 , 是 由 單 体 分 子 經 聚 合 反 應 , 成為 高 分 子 聚 合 物 , 並 以 架 橋 分 子 , 交 錯 連 結 成 三 次 元 的 半 固 体 膠 体 。a) 單 体 (monomer): 丙 烯 醯 胺 (acrylamide),CH 2 =CH-CO-CH 2 。b) 架 橋 (bridge):Bis, [N, N'-methylene-bis(acrylamide)] 可 看 作 兩 個 丙 烯 醯 胺 單体 分 子 連 結 在 一 起 , 可 形 成 分 叉 點 , 以 構 成 立 體 結 構 。c) 自 由 基 (free radical) 產 生 者 : 過 硫 酸 銨 (ammonium persulfate, APS) 或riboflavin ( 即 維 生 素 BB2) 。d) 催 化 劑 :TEMED (tetramethylenediamine) 幫 助 自 由 基 電 子 的 傳 遞 。2) 鑄 膠 (gel casting): 是 一 種 自 由 基 的 聚 合 反 應 , 大 致 有 下 列 幾 個 反 應 。a) 自 由 基 形 成 : 靠 上 述 游 基 產 生 者 自 動 生 成 游 基 , 再 引 發 連 鎖 反 應 。b) 聚 合 反 應 : 單 体 分 子 首 尾 相 接 , 以 連 鎖 反 應 形 成 大 分 子 的 長 鏈 。c) 交 錯 連 結 : 若 架 橋 分 子 Bis 加 入 聚 合 反 應 , 則 可 形 成 網 狀 三 次 元 結 構 。3) 膠 体 的 一 些 性 質 : 構 成 的 網 狀 三 次 元 結 構 膠 体 , 因 為 其 中 所 含 單 体 與 架 橋 分子 濃 度 的 不 同 , 而 有 各 種 不 同 孔 隙 的 膠 体 。 蛋 白 質 分 子 在 膠 体 中 的 泳 動 率 , 會受 膠 体 孔 隙 大 小 的 影 響 。 在 孔 隙 中 的 空 間 , 則 由 緩 衝 液 填 充 , 除 了 維 持 pH 外 ,更 作 為 電 流 之 傳 導 媒 介 。3.1.3 電 泳 系 統 的 解 析1) 以 化 學 組 成 看 來 , 電 泳 系 統 可 分 為 五 個 部 分 :表 P3-1 電 泳 系 統 的 組 成電 泳 系 統 緩 衝 液 pH 膠 体 濃 度1 上 層 ( 負 極 ) 緩 衝 液 Tris-Gly 8.3 無2 樣 本 溶 液 Tris-Gly 8.3 無3 膠 焦 集 膠 体 Tris-HCl 6.9 4%4 体 分 離 膠 体 Tris-HCl 8.9 5~20%5 下 層 ( 正 極 ) 緩 衝 液 Tris-Gly 8.3 無只 有 3, 4 兩 部 分 是 膠 体 ; 各 層 的 緩 衝 液 種 類 不 盡 相 同 , 其 pH 也 有 點 差 異 。 注意 (3) 膠 集 膠 体 的 pH 較 低 (pH 6.9, 是 Gly 的 pI)。 這 些 差 異 造 成 一 個 很 重 要的 效 果 : 在 樣 本 通 過 焦 集 膠 体 時 , 產 生 焦 集 作 用 , 使 原 本 体 積 相 當 大 的 樣 本 溶液 , 聚 集 成 一 薄 層 , 可 增 加 解 析 度 。2) 以 傳 統 的 直 立 式 柱 狀 膠 体 電 泳 為 例 , 電 泳 膠 柱 如 圖 P3-1 所 組 成 , 玻 璃 管 內 的下 方 為 分 離 膠 体 (4), 其 上 則 為 焦 集 膠 体 (3)。 焦 集 膠 体 上 方 的 空 間 (2), 可 供灌 注 樣 本 溶 液 ; 膠 柱 上 下 兩 端 , 分 別 接 兩 極 的 緩 衝 液 槽 (1 及 5) 連 接 電 源 。 除P3-2 Biochemistry Laboratory

膠 體 電 泳 法P3柱 狀 電 泳 外 尚 有 平 板 式 電 泳 , 可 分 直 立 式 或 水 平 式 。 應 用 在 蛋 白 質 時 , 以 直 立平 板 式 的 聚 丙 烯 醯 胺 膠 体 為 多 ; 在 核 酸 則 以 水 平 平 板 式 洋 菜 醣 膠 体 較 普 遍 。3) 焦 集 膠 体 的 焦 集 作 用 及 其 作 用 機 理 : 參 閱 附 圖 P3-2-+Upperchamber-(1)Sample (2)Stacking gel(3)CoolingwaterLowerchamber++(5)Running gel(4)Geltube圖 P3-1 直 立 式 柱 狀 電 泳 裝 置 與 膠 柱 組 成直 立 式 柱 狀 膠 體 電 泳 是 最 早 的 電 泳 方 式 之 一 , 在 玻 璃 管 中 分 別 注 入 分 離 膠 體 與 焦 集 膠體 , 右 下 角 為 膠 柱 的 組 成 方 式 。a) 樣 本 分 子 能 被 焦 集 成 一 薄 層 , 注 意 下 面 三 種 分 子 , 在 電 泳 時 的 表 現 :(1) Glycine: 圖 中 以 深 色 圓 點 ( 當 環 境 pH >6.9 時 Gly 帶 負 電 ) 或 白 色 圓 點( 當 環 境 pH = 6.9 時 為 不 帶 電 之 zwitterion) 表 示 。(2) 樣 本 分 子 ( 有 兩 種 蛋 白 質 , 分 別 以 大 小 兩 種 乳 酪 圖 案 表 示 )。(3) 氯 離 子 , 以 斜 線 部 分 代 表 。b) 注 意 上 述 電 泳 的 五 個 部 分 中 , 膠 体 的 緩 衝 液 含 氯 離 子 , 沒 有 Gly; 然 而 樣本 溶 液 中 含 Gly, 沒 有 氯 離 子 。c) 再 看 樣 本 溶 液 - 焦 集 膠 体 - 分 離 膠 体 三 段 的 pH 是 不 連 續 的 , 其 pH 分 別 為 8.3- 6.9 - 8.9, 注 意 Gly 的 pI 恰 為 6.9。d) 當 電 泳 一 開 始 時 ,Gly 越 入 焦 集 膠 体 後 , 立 刻 變 成 不 帶 電 的 的 分 子 ( 白 點 ),泳 動 率 變 小 ; 同 時 氯 離 子 則 很 快 的 往 正 極 泳 動 , 因 此 在 氯 離 子 與 Gly 之 間有 一 段 缺 乏 離 子 的 空 間 , 電 壓 很 高 。e) 然 而 兩 電 極 之 間 , 一 定 要 有 負 離 子 來 帶 動 電 流 , 此 時 只 有 利 用 蛋 白 質 分 子來 傳 導 , 而 焦 集 膠 体 中 的 孔 隙 又 較 疏 , 於 是 蛋 白 質 分 子 在 此 離 子 缺 乏 空生 物 化 學 實 驗 P3-3

膠 體 電 泳 法P3間 , 快 速 往 正 極 泳 動 , 一 直 碰 到 氯 離 子 的 尾 端 , 而 聚 集 於 斯 , 成 一 薄 層 ,由 側 面 觀 之 則 成 一 細 線 。f) Gly 分 子 慢 慢 通 過 焦 集 膠 体 , 又 變 回 負 離 子 , 離 子 缺 乏 空 間 瓦 解 ; 樣 本 蛋白 質 泳 動 到 分 離 膠 体 , 膠 体 為 正 常 濃 度 , 依 其 分 子 量 、 電 荷 等 因 素 泳 動 。ABC樣本焦集膠体8.36.9離 子 缺 乏 空 間分離膠体8.9+ +圖 P3-2 焦 集 膠 體 的 作 用 原 理由 於 不 連 續 膠 體 能 夠 產 生 一 段 離 子 缺 乏 的 空 間 , 使 得 樣 本 分 子 快 速 泳 動 , 並 且 擠 在 氯離 子 界 限 的 尾 端 , 因 而 焦 聚 成 一 條 直 線 , 產 生 焦 集 的 效 果 。3.1.4 實 驗 大 綱P3 膠 體 電 泳 法鑄 膠電 泳染 色 脫 色P1Trypsin脫 色焦 集 膠 體樣 本 處 理染 色分 離 膠 體電 泳 進 行取 出 膠 體圖 P3-3 原 態 膠 體 電 泳 檢 定 的 進 行 流 程P3-4 Biochemistry Laboratory

膠 體 電 泳 法P33.2 實 驗 方 法兩 組 共 同 鑄 造 兩 片 平 板 原 態 電 泳 膠 片 , 進 行 各 組 trypsin 及 CHOM 的 樣 本 分 析 。3.2.1 儀 器 用 具a) 鑄 膠 套 件 ( 含 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 )。b) 間 隔 條 (spacer, 0.75 mm) 及 樣 本 梳 (comb, 10 well)。c) 垂 直 迷 你 電 泳 槽 (Hoefer SE-250 平 板 式 垂 直 電 泳 槽 )。d) 電 源 供 應 器 (Pharmacia Biotech EPS 200)。e) 微 量 針 管 (Hamilton 80465) 或 電 泳 樣 本 專 用 吸 管 頭 。f) 染 色 脫 色 方 盒 。3.2.2 藥 品 試 劑a) A 液 (T 30%, C 2.6%): 注 意 ! 本 溶 液 有 毒 性 !丙 烯 醯 胺 溶 液 acrylamideBis (N,N’-methylene-bis-acrylamide)加 水 至 50 mL, 若 難 溶 則 稍 微 加 熱 助 溶 之 , 儲 存 於 4℃。14.6 g0.4 gb) B 液 ( 分 離 膠 體 緩 衝 液 ):TrisTEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine)18.2 g0.36 mL用 60 mL 水 溶 解 後 , 以 HCl 調 pH 至 8.8 後 加 水 至 100 mL, 儲 存 於 4℃。c) C 液 ( 焦 集 膠 體 緩 衝 液 ):Tris0.6 gTEMED 40 μL用 8 mL 水 溶 解 後 , 以 HCl 調 pH 至 6.8 後 加 水 至 10 mL, 儲 存 於 4℃。d) 通 用 電 泳 緩 衝 液 (5×):Tris 90 mM×5 54.5 gEDTA·2Na 2.5 mM×5 4.7 gBoric acid 80 mM×5 24.8 g加 水 800 mL 溶 解 , 以 NaOH 調 pH 至 8.4 後 , 加 水 至 1,000 mL, 室 溫 保 存 。使 用 前 要 以 蒸 餾 水 稀 釋 五 倍 。e) APS 溶 液 (ammonium persulfate, 10%):取 0.1 g 溶 於 1 mL 水 , 要 確 實 溶 解 完 全 ; 使 用 前 新 鮮 配 置 , 過 夜 者 不 再 用 。f) 異 丙 醇 。g) 追 蹤 染 料 :Bromophenol Blue (BPB) 1 mg 加 5 mL 水 及 5 mL 甘 油 。生 物 化 學 實 驗 P3-5

膠 體 電 泳 法P3h) CBR 染 色 液 :Coomassie Brilliant Blue R-250 1.5 g 加 入 250 mL 水 後 再 加 250 mL甲 醇 及 50 mL 醋 酸 , 過 濾 去 掉 不 溶 物 , 置 於 排 煙 櫃 中 公 用 。 要 回 收 。i) 脫 色 液 : 甲 醇 (20%) 及 醋 酸 (10%) 的 水 溶 液 , 置 於 排 煙 櫃 中 公 用 。3.2.3 鑄 膠 ( 原 態 膠 體 )表 P3-2 各 種 膠 體 溶 液 的 濃 度 ( 單 位 mL)分 離 膠 体 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% 焦 集 膠 體 4%A 液 2.5 3.4 4.2 5.0 A 液 0.7B 液 2.5 2.5 2.5 2.5 C 液 1.3水 4.9 4.0 3.2 2.4 水 2.9APS 0.1 0.1 0.1 0.1 APS 0.1Total 10.0 10.0 10.0 10.0 Total 5.0分 離 膠 體 每 支 約 需 2~3 mL, 故 一 組 配 製 10 mL 即 可 。1) 將 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 清 洗 淨 後 擦 乾 , 再 以 玻 璃 清 潔 劑 擦 拭 乾 淨 , 選 擇 所 需 厚度 間 隔 條 (spacer) 組 裝 於 鑄 膠 套 件 , 本 課 程 由 助 教 事 先 準 備 架 好 。2) 依 表 P3-2 所 列 的 各 溶 液 比 例 , 選 擇 所 需 的 分 離 膠 體 濃 度 , 本 次 實 驗 使 用 12.5%膠 體 。 配 置 膠 體 溶 液 時 , 其 中 APS 溶 液 必 須 最 後 加 入 , 小 心 混 合 均 勻 , 並 避免 氣 泡 產 生 , 然 後 以 微 量 吸 管 小 心 注 入 鑄 膠 套 件 。3) 膠 體 約 佔 玻 片 的 2/3 至 3/4 高 度 , 加 完 後 儘 快 在 膠 體 液 面 上 方 小 心 加 入 100 μL異 丙 醇 ( 或 蒸 餾 水 ), 以 壓 平 膠 體 液 面 。4) 約 30 min 至 1 h 後 ( 天 冷 須 更 久 ), 凝 膠 完 成 , 倒 出 上 層 的 異 丙 醇 。5) 配 製 焦 集 膠 體 溶 液 , 先 準 備 好 所 需 之 樣 本 梳 (comb), 加 入 溶 液 後 立 刻 插 入 , 整個 過 程 必 須 在 5 min 完 成 , 約 30 min 可 完 成 凝 膠 。6) 拆 下 膠 片 並 清 理 , 將 多 餘 的 凝 膠 去 除 , 鑄 好 的 膠 片 可 置 封 口 袋 中 於 4℃ 保 存 ,但 要 加 入 少 量 蒸 餾 水 防 止 膠 片 乾 裂 , 使 用 期 限 約 兩 週 。 一 組 使 用 一 片 。3.2.4 電 泳1) 若 膠 片 是 在 4℃ 中 保 存 , 須 先 取 出 回 復 室 溫 。 同 時 將 稀 釋 成 一 倍 的 通 用 電 泳 緩衝 液 , 倒 入 電 泳 槽 底 部 。 然 後 把 膠 片 以 45 度 架 到 電 泳 槽 上 , 避 免 附 著 氣 泡 ;當 電 泳 夾 夾 妥 後 , 在 電 泳 玻 片 組 合 的 上 方 槽 內 , 加 入 電 泳 緩 衝 液 。 電 泳 前 , 先以 微 量 針 管 清 洗 各 樣 本 槽 , 避 免 有 凝 膠 不 完 全 的 殘 餘 物 留 在 樣 本 槽 內 。◆ 膠 片 一 定 要 等 回 復 室 溫 後 才 能 架 到 電 泳 槽 , 否 則 玻 片 會 因 熱 漲 而 撐 破 。2) 取 出 trypsin 樣 本 20 μL, 因 其 中 含 甲 酸 溶 液 , 先 加 入 2 μL 1 N NaOH 中 和 之 ,然 後 再 加 10 μL 追 蹤 染 料 , 混 合 均 勻 後 備 用 。CHOM 取 20 μL 只 要 加 入 10 μLP3-6 Biochemistry Laboratory

膠 體 電 泳 法P3追 蹤 染 料 混 合 , 不 須 中 和 。3) 依 圖 P3-4 配 置 , 以 微 量 針 管 小 心 注 入 樣 本 ( 要 記 錄 體 積 ), 避 免 氣 泡 陷 入 。◆ 每 個 樣 本 槽 最 多 容 納 20 μL 樣 本 ,trypsin 樣 本 較 稀 , 儘 量 注 入 多 量 , 而 CHOM 極濃 , 每 槽 注 入 1~3 μL 即 可 。 若 有 多 餘 的 樣 本 槽 , 可 注 入 不 同 濃 度 比 較 。4) 蓋 上 電 泳 槽 的 蓋 子 , 確 認 正 負 電 極 裝 置 正 確 ( 由 負 極 往 正 極 跑 ), 連 接 上 電 源 供應 器 , 定 電 壓 以 100~150 V 進 行 電 泳 , 約 需 1 h。5) 待 追 蹤 染 料 跑 到 底 部 , 關 掉 電 源 , 取 出 膠 片 , 以 解 剖 刀 截 去 右 上 角 做 記 號 。6) 膠 片 接 著 進 行 蛋 白 質 染 色 及 脫 色 如 下 小 節 。M T T C P P C T T M圖 P3-4 樣 本 的 配 置 方 式T 為 trypsin ( 可 能 有 不 同 來 源 的 樣 本 ),C 為 CHOM,P 為 胰 臟 抽 取 液 ,M 為 標 準 蛋 白質 ; 左 右 兩 半 膠 片 可 以 加 入 不 同 量 的 樣 本 , 以 便 適 當 呈 色 。 跑 完 電 泳 後 去 除 焦 集 膠 體後 , 在 右 上 角 切 角 做 記 號 ( 箭 頭 虛 線 ), 然 後 進 行 CBR 染 色 。3.2.4 染 色 及 脫 色1) 將 電 泳 膠 片 浸 入 CBR 染 色 液 中 , 染 色 液 用 量 只 要 覆 蓋 過 膠 片 即 可 , 一 定 要 蓋上 蓋 子 , 置 於 平 台 震 盪 器 上 搖 盪 30 min。2) 倒 出 染 色 液 回 收 , 膠 片 用 自 來 水 沖 洗 後 加 入 脫 色 液 , 脫 色 液 也 一 樣 蓋 過 膠 片 即可 ; 約 10 min 換 第 一 次 脫 色 液 , 然 後 一 直 定 時 換 新 到 背 景 清 澈 透 明 為 止 。3) 若 蛋 白 質 濃 度 較 低 , 染 色 時 間 可 加 長 (1 h) 以 增 加 色 帶 深 度 。4) 脫 色 完 成 的 膠 片 , 可 以 用 玻 璃 紙 三 明 治 乾 燥 之 , 經 護 貝 後 可 永 久 保 存 。生 物 化 學 實 驗 P3-7

膠 體 電 泳 法P33.3 結 果 與 報 告3.3.1 實 驗 結 果a) 膠 體 染 色 結 果 讓 你 目 睹 樣 本 中 所 含 的 各 種 蛋 白 質 , 雖 然 所 有 的 蛋 白 質 都 被 染 成藍 色 , 但 仍 依 照 各 自 分 子 量 及 帶 電 荷 的 大 小 不 同 , 在 其 泳 動 率 上 有 所 差 異 。b) 請 記 錄 下 色 帶 的 位 置 , 可 以 掃 描 或 照 相 , 作 為 記 錄 及 報 告 之 用 。c) 請 注 意 可 以 看 得 到 幾 條 色 帶 ? 其 泳 動 率 如 何 ?d) 若 有 不 同 來 源 的 trypsin, 則 在 電 泳 上 的 差 異 如 何 ?3.3.2 附 註 說 明a) Non-denaturing PAGE 與 SDS-PAGE 的 電 泳 機 制 不 一 樣 , 因 此 同 一 種 樣 品 , 在這 兩 種 電 泳 的 結 果 會 完 全 不 同 ; 我 們 在 S2 免 疫 轉 印 法 才 會 進 行 SDS-PAGE。以 trypsin 實 驗 為 例 , 圖 P3-5 說 明 此 現 象 , 注 意 圖 中 C 與 D 之 比 較 。 討 論 電 泳結 果 , 並 判 斷 所 得 到 的 trypsin 是 否 純 質 。b) CBR 染 色 法 可 染 大 部 分 蛋 白 質 , 約 可 偵 測 數 μg 量 ; 另 有 硝 酸 銀 染 色 法 , 其 靈敏 度 約 提 高 一 百 倍 ; 而 以 Periodic acid-Schiff's (PAS) 試 劑 可 染 出 醣 類 ( 呈 洋 紅色 ), 用 來 偵 測 醣 蛋 白 , 但 其 靈 敏 度 比 CBR 染 色 低 十 倍 。DiscSDSA B C D圖 P3-5 電 泳 分 析 結 果P3-8 Biochemistry Laboratory

膠 體 電 泳 法P33.3.3 複 習 問 題a) 決 定 蛋 白 質 分 子 的 淨 電 荷 為 正 電 或 負 電 , 受 那 些 因 素 影 響 ?b) 那 些 因 素 會 影 響 蛋 白 質 分 子 , 在 電 場 中 的 泳 動 速 率 ?c) 膠 體 溶 液 的 成 分 有 那 些 ? 各 有 什 麼 作 用 ? 那 一 種 有 毒 性 ?d) 焦 集 膠 體 如 何 使 樣 品 蛋 白 質 焦 聚 成 一 薄 層 ?e) 是 否 所 有 蛋 白 質 分 子 均 由 負 極 向 正 極 泳 動 ? 在 什 麼 情 況 下 會 有 例 外 ?f) 電 泳 進 行 時 會 發 熱 , 有 無 必 要 通 冷 水 冷 卻 之 ? 在 何 種 情 況 下 有 此 必 要 ?g) 樣 品 中 若 有 大 量 的 鹽 分 , 對 電 泳 會 有 什 麼 影 響 ?h) SDS-PAGE 與 non-denaturing PAGE 在 原 理 與 應 用 上 , 有 何 異 同 ?3.4 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 147, 205莊 榮 輝 、 蘇 仲 卿 (1987) 蛋 白 質 膠 體 電 泳 檢 定 法 。 電 泳 分 離 技 術 研 討 會 論 文 集 頁 69-77。曾 義 雄 等 人 主 編 。 研 討 會 專 集 ( 九 )。 國 科 會 生 物 中 心Juang RH et al. (1984) Oven-drying method for polyacrylamide gel slab packed in cellophanesandwich, Anal. Biochem. 141: 348-350Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.92-96Scopes RK (1994) Protein purification - Principles and practice, 3rd ed, Springer-Verlag生 物 化 學 實 驗 P3-9

Gel FiltrationP4 膠 体 過 濾 法莊 榮 輝4.1 膠 體 過 濾 法 原 理分 子 大 小 之 不 同 , 可 用 來 作 為 分 離 或 純 化 的 手 段 , 包 括 膠 體 過 濾 法 、 超 微 膜 過 濾法 、 超 高 速 離 心 法 、 膠 體 電 泳 法 等 。 其 中 以 膠 體 過 濾 法 最 為 常 見 , 本 實 驗 使 用Sephacryl S-300 作 為 分 離 介 質 , 對 大 部 分 蛋 白 質 樣 本 均 適 用 , 但 要 稍 提 高 鹽 濃 度 以克 服 其 非 專 一 性 的 吸 附 力 。4.1.1 色 層 分 析 法 原 理膠 體 過 濾 法 是 色 層 分 析 法 (chromatography) 的 一 種 , 色 析 法 廣 泛 被 應 用 來 分 析複 雜 的 成 份 , 也 可 以 純 化 所 要 的 目 標 物 質 。 那 麼 , 色 析 法 是 什 麼 ?色 析 法 都 含 有 兩 種 相 (phase), 液 相 及 固 相 就 可 算 為 兩 相 , 例 如 一 杯 水 中有 一 塊 石 頭 , 水 是 液 相 、 石 頭 是 固 相 ; 若 問 如 何 分 開 水 與 石 頭 ? 非 常 簡 單 ,只 要 把 水 倒 出 , 留 下 石 頭 即 可 。 水 是 流 動 的 , 稱 為 流 動 相 (mobile phase); 石頭 不 動 , 稱 為 固 定 相 (stationary phase)。這 樣 的 兩 相 觀 念 , 應 用 到 色 析 法 , 就 是 看 樣 本 中 的 各 種 分 子 , 是 比 較 喜 歡跟 著 流 動 相 走 , 還 是 喜 歡 留 在 固 定 相 上 , 就 可 以 把 性 質 不 同 的 分 子 分 開 。 而 樣本 分 子 『 極 性 』 程 度 的 大 小 , 最 常 被 用 來 作 為 兩 相 分 離 的 基 本 依 據 ; 同 時 , 流動 相 與 固 定 相 的 極 性 也 不 同 , 通 常 其 一 偏 向極 性 , 而 另 一 則 偏 非 極 性 。 樣 本 中 的 各 種 分子 , 依 其 極 性 程 度 , 選 擇 留 在 固 定 相 , 或 隨著 流 動 相 走 , 完 全 遵 守 『like dissolves like』的 原 則 ( 見 圖 P4-1)。4.1.2 膠 體 過 濾 是 一 種 層 析 法1) 膠 體 過 濾 法 也 是 層 析 法 的 一 種 , 因 此 也 有 兩相 系 統 : 其 流 動 相 就 是 注 入 管 柱 的 緩 衝 液 ,緩 緩 把 樣 本 帶 入 膠 柱 中 ; 而 固 定 相 則 是 裝 填在 玻 璃 管 柱 中 的 膠 球 , 這 些 膠 球 的 本 體 有 無樣 本非 極 性極 性流動固相定相非 極 性極 性圖 P4-1 色 層 分 析 法 的 基 本 機 制生 物 化 學 實 驗 P4-1

膠 體 過 濾 法P4數 小 孔 洞 , 可 以 讓 小 分 子 游 入 其 中 , 而 排 斥 大 分 子 , 完 全 取 決 於 樣 本 分 子 的 分子 量 大 小 。2) 因 此 , 當 樣 本 通 過 管 柱 後 , 分 子 量 大 者 就 會 較 快 流 出 , 而 分 子 量 較 小 者 , 就 會被 延 滯 , 較 慢 流 出 ; 如 此 就 可 以 把 大 小 分 子 分 開 。3) 其 實 , 除 了 分 子 量 之 外 , 分 子 形 狀 也 有 影 響 。 若 兩 個 分 子 的 分 子 量 一 樣 , 而 一個 是 橢 圓 球 形 , 另 一 為 不 規 則 形 狀 , 則 後 者 將 會 比 較 快 流 出 ; 因 為 橢 圓 球 形 比較 容 易 進 入 膠 球 的 孔 道 中 , 不 規 則 形 則 否 。 但 是 因 為 蛋 白 質 的 外 型 , 通 常 大 多是 圓 球 形 , 因 此 可 以 只 考 慮 分 子 量 的 因 素 。4.1.3 膠 球 的 種 類1) 這 種 具 有 孔 道 的 膠 球 , 大 都 是 多 醣 類 的 聚 合 體 , 以 控 制 多 醣 的 密 度 , 來 調 整 所形 成 孔 道 的 大 小 。 最 早 出 現 的 膠 球 , 是 葡 萄 糖 的 聚 合 多 醣 , 稱 為 Sephadex,由 瑞 典 Pharmacia 公 司 所 出 產 。 再 來 是 由 洋 菜 醣 所 衍 生 的 Sepharose, 因 為 洋 菜醣 所 組 合 出 來 的 多 醣 骨 架 很 堅 固 , 以 架 出 較 大 的 孔 道 空 間 , 因 此 可 分 離 較 高 分子 量 的 樣 本 ( 數 百 萬 ), 比 Sephadex 的 分 離 範 圍 ( 數 十 萬 ) 大 很 多 。2) 這 些 膠 球 除 了 可 作 為 膠 體 過 濾 之 外 , 若 在 上 面 連 結 上 離 子 基 團 , 便 可 以 成 為 離子 交 換 介 質 。 常 見 的 是 接 上 DEAE 陽 離 子 基 團 , 成 為 陰 離 子 交 換 介 質 , 可 用 來吸 引 帶 負 電 的 分 子 ; 也 有 接 上 CM 陰 離 子 基 團 , 則 成 為 陽 離 子 交 換 介 質 。4.1.4 實 驗 大 綱P4 膠 體 過 濾 法管 柱 裝 填色 析 操 作分 子 量 測 定標 準 蛋 白 質Trypsin分 子 量標 準 校 正 線膠 體 過 濾分 劃 收 集Bradfordmethod活 性 分 析圖 P4-2 膠 體 過 濾 法 操 作 流 程P4-2 Biochemistry Laboratory

膠 體 過 濾 法P44.2 實 驗 方 法4.2.1 儀 器 用 具a) 層 析 管 柱 (Pharmacia C16 column, 100 cm) 最 好 附 有 adaptor (AC16)。b) 蠕 動 幫 浦 (Pharmacia peristaltic pump P-1)。c) 分 劃 收 集 器 (fraction collector, Gilson 或 Pharmacia) 加 100 支 試 管 。d) ELISA 光 度 計 及 微 量 低 定 盤 。4.2.2 藥 品 試 劑a) 膠 體 Sephacryl S-300 (Pharmacia)。b) 緩 衝 液 Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, 含 0.15 M NaCl。c) 標 準 分 子 量 蛋 白 質 (Bio-Rad 151-1901): Thyroglobulin (670 kD); bovine gammaglobulin (158 kD); chicken ovalbumin (44 kD); equine myoglobin (17 kD); vitaminB-12 (1.35 kD)。d) Trypsin 樣 本 為 你 在 P2 實 驗 純 化 所 得 者 , 約 需 0.2~0.5 mL, 視 其 活 性 而 定 。4.2.3 管 柱 裝 填本 實 驗 的 膠 體 管 柱 , 均 先 由 助 教 裝 填 好 , 同 學 只 要 加 入 樣 本 即 可 ; 但 以 下 也 把膠 柱 的 裝 填 方 法 寫 出 , 以 為 將 來 自 行 裝 填 時 參 考 。 同 學 也 可 事 先 詢 問 助 教 裝填 管 柱 的 時 間 , 以 便 屆 時 在 一 旁 觀 摩 操 作 情 形 。1) 預 先 將 管 柱 洗 淨 、 晾 乾 後 備 用 , 也 要 熟 悉 整 隻 管 柱 的 拆 裝 方 法 。2) 架 起 管 柱 , 以 水 平 儀 調 整 管 柱 , 使 之 與 地 面 垂 直 。3) 於 管 柱 中 加 入 約 一 半 高 度 的 緩 衝 液 , 測 試 管 柱 是 否 有 漏 水 現 象 ; 若 沒 有 漏 水 ,則 讓 緩 衝 液 流 出 , 只 留 約 5 cm 高 的 緩 衝 液 ; 以 塞 子 暫 時 堵 住 下 方 出 口 。4) 取 出 所 要 使 用 的 膠 體 , 先 除 去 所 含 的 20% 酒 精 , 並 平 衡 在 緩 衝 液 中 。◆ 若 是 在 室 溫 中 進 行 層 析 法 , 一 定 要 等 膠 體 的 溫 度 完 全 回 復 室 溫 才 可 裝 填 。5) 將 所 要 裝 填 之 膠 體 搖 盪 均 勻 , 不 要 有 未 散 之 硬 塊 , 也 避 免 氣 泡 產 生 , 若 有 氣 泡產 生 則 以 超 音 波 震 盪 器 (sonicator) 趕 出 , 並 以 抽 氣 去 除 之 。6) 將 上 述 混 合 均 勻 之 膠 體 , 以 玻 棒 沿 管 壁 流 暢 倒 入 管 柱 , 並 且 避 免 使 得 氣 泡 陷 在膠 柱 中 ; 可 在 裝 填 後 , 以 手 電 筒 在 膠 柱 後 方 打 燈 光 檢 查 之 。7) 利 用 重 力 自 然 沈 降 1~2 min 後 , 移 去 管 柱 下 方 軟 管 的 塞 子 , 利 用 流 速 加 快 沈 降 ,注 意 不 可 使 管 柱 上 方 的 液 相 完 全 乾 去 。8) 待 膠 體 已 沈 降 完 全 , 用 塞 子 止 住 下 方 軟 管 , 並 且 以 緩 衝 液 加 滿 管 柱 。生 物 化 學 實 驗 P4-3

膠 體 過 濾 法P49) 取 出 管 柱 的 adaptor 並 接 好 軟 管 及 蠕 動 幫 浦 管 路 , 並 使 整 個 幫 浦 及 軟 管 內 , 完全 充 滿 緩 衝 液 , 不 得 有 任 何 氣 泡 陷 在 裡 面 。10) 小 心 將 adaptor 放 入 管 柱 內 , 往 下 推 至 膠 面 上 方 , 檢 查 有 無 氣 泡 留 滯 在 adaptor下 面 , 然 後 鎖 緊 O-ring。 此 時 adaptor 與 膠 面 間 有 一 小 段 充 滿 緩 衝 液 的 空 間 。11) 移 去 管 柱 下 方 軟 管 的 塞 子 , 用 幫 浦 注 入 緩 衝 液 流 洗 兩 個 管 柱 體 積 。12) 暫 時 停 止 幫 浦 輸 送 , 用 塞 子 止 住 下 方 軟 管 , 放 鬆 幫 浦 使 管 路 呈 流 通 狀 態 , 稍 微旋 開 adaptor 的 O-ring, 將 adaptor 緩 慢 下 壓 , 液 體 會 從 幫 浦 上 端 軟 管 流 回 去 ,當 壓 至 膠 面 時 , 即 旋 緊 O-ring, 鎖 上 幫 浦 門 , 移 去 管 柱 下 方 軟 管 的 塞 子 。13) 以 預 定 流 速 (60 mL/h) 之 150% 流 速 流 洗 1~2 管 柱 體 積 。14) 檢 查 膠 面 是 否 因 高 壓 流 洗 而 下 降 , 若 降 低 則 重 複 步 驟 12) 把 adaptor 往 下 壓 。◆ 若 有 時 間 , 將 安 排 示 範 膠 體 的 裝 填 方 法 。4.2.4 層 析 操 作 與 分 子 量 測 定1) 請 先 測 量 管 柱 的 膠 體 高 度 為 多 少 ? 若 管 柱 底 面 積 為 2 cm 2 , 請 計 算 出 該 管 柱 的膠 體 總 體 積 為 若 干 mL?2) 把 所 純 化 得 之 trypsin 取 適 量 加 入 標 準 蛋 白 質 中 , 一 起 以 幫 浦 注 入 管 柱 , 膠 體 過濾 的 樣 本 體 積 約 為 膠 體 總 體 積 的 1%; 若 兩 者 都 為 0.5 mL, 則 總 共 樣 本 體 積 為1 mL。 注 意 樣 本 的 溫 度 與 膠 體 不 可 相 差 太 多 。◆ 樣 本 通 常 都 由 低 溫 處 取 出 , 其 溫 度 可 能 與 膠 體 有 差 異 。3) 在 注 入 樣 本 後 , 以 預 定 流 速 進 行 溶 離 , 膠 體 過 濾 層 析 法 即 開 始 進 行 , 要 馬 上 啟動 分 劃 收 集 器 ; 所 有 溶 離 物 質 , 應 在 大 約 1.5 倍 管 柱 體 積 之 內 流 出 。◆ 注 意 膠 體 管 柱 絕 對 不 能 吸 入 氣 體 , 因 此 當 樣 本 快 要 吸 盡 時 , 要 適 時 停 止 。◆ 流 速 通 常 為 30~60 mL/h, 每 分 劃 收 集 3 mL, 或 定 滴 數 為 60 滴 。4) 通 常 樣 本 注 入 後 , 即 可 由 幫 浦 自 動 輸 液 , 並 以 分 劃 收 集 器 自 動 收 集 溶 離 液 , 操作 者 在 此 段 時 間 最 好 經 常 回 來 巡 視 , 以 免 幫 浦 或 收 集 器 發 生 故 障 , 影 響 實 驗 進行 。 同 時 , 請 觀 察 標 準 蛋 白 質 的 色 帶 , 如 何 逐 漸 分 離 開 來 。4.3 結 果 與 報 告4.3.1 實 驗 結 果a) 若 一 切 順 利 , 你 將 收 到 約 90 支 試 管 , 請 注 意 後 面 的 幾 支 試 管 , 應 該 出 現 紅 色的 物 質 (vitamin BB12), 否 則 可 能 色 析 操 作 發 生 問 題 。b) 每 支 試 管 進 行 (1) 蛋 白 質 定 量 以 及 (2) trypsin 活 性 測 定 , 得 到 兩 組 數 據 。 以 分劃 管 數 為 橫 座 標 , 蛋 白 質 ( 實 線 ) 或 活 性 測 定 ( 虛 線 ) 的 吸 光 值 為 縱 座 標 , 畫 出P4-4 Biochemistry Laboratory

膠 體 過 濾 法P4色 析 圖 譜 的 結 果 。 實 線 可 能 有 數 個 尖 峰 , 而 虛 線 應 該 只 有 一 個 尖 峰 。c) 辨 別 各 標 準 蛋 白 質 的 尖 峰 , 並 指 出 其 管 數 , 另 做 一 張 標 準 校 正 線 作 圖 : 同 樣 以分 劃 管 數 為 橫 座 標 , 但 以 分 子 量 為 縱 座 標 , 縱 座 標 請 用 幾 何 級 數 刻 度 。 請 注 意也 要 把 vitamin B 12 的 分 子 量 及 管 數 加 入 作 圖 。d) 把 活 性 曲 線 ( 虛 線 ) 尖 峰 的 管 數 , 內 插 到 上 面 的 標 準 校 正 線 , 則 可 求 出 trypsin活 性 出 現 尖 峰 的 分 子 量 。◆ 假 如 兩 個 蛋 白 質 的 分 子 量 幾 乎 相 同 , 那 能 不 能 在 膠 體 過 濾 分 別 出 來 ?6分 子 量10+Sephacryl S-300MW = ? kD3510410Trypsin23101Vitamin B12目 測0Elution Volume圖 P4-3 分 子 量 標 準 校 正 線4.3.2 複 習 問 題a) 在 色 析 過 程 中 , 標 準 蛋 白 質 在 管 柱 內 的 移 動 情 形 如 何 ? 色 帶 是 否 平 整 ?b) 除 了 以 膠 體 過 濾 法 之 外 , 還 有 那 些 方 法 可 測 得 分 子 量 ?c) 若 使 用 膠 體 電 泳 法 測 定 分 子 量 , 與 膠 體 過 濾 法 有 何 異 同 ?d) 有 那 些 問 題 可 能 會 影 響 膠 體 過 濾 法 測 量 分 子 量 的 正 確 性 ?4.4 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 119, 200Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.89-92Scopes RK (1994) Protein purification - Principles and practice, 3rd ed, Springer-Verlag生 物 化 學 實 驗 P4-5

ImmunoelectrophoresisS1 免 疫 電 泳 法莊 榮 輝抗 體 是 非 常 重 要 的 生 物 化 學 工 具 , 因 為 抗 體 與 抗 原 之 間 有 很 強 的 專 一 性 ; 而 且 可 以針 對 某 一 特 定 目 標 抗 原 , 產 生 其 專 一 性 抗 體 , 因 此 應 用 上 非 常 方 便 。1.1 背 景 知 識脊 椎 動 物 体 內 擁 有 後 天 免 疫 系 統 , 可 對 外 來 異 物 產 生 特 定 的 抗 体 , 這 些 異 物 可 為別 種 生 物 來 源 的 大 分 子 , 稱 之 為 抗 原 。1.1.1 抗 體 與 其 專 一 性抗 体 與 抗 原 之 間 的 反 應 , 有 相 當 強 的 專 一 性 (specificity)。 由 抗 原 甲 所 誘 導出 來 的 抗 體 甲 , 只 能 對 抗 原 甲 作 用 , 對 毫 不 相 關 的 抗 原 乙 沒 有 反 應 。 但 若某 抗 原 丙 的 分 子 構 造 與 抗 原 甲 非 常 類 似 , 則 抗 體 甲 可 能 與 抗 原 丙 有 某 些程 度 的 反 應 , 稱 為 交 叉 反 應 性 (cross reactivity)。外 來 蛋 白 質 或 多 醣 等 大 分 子 , 可 作 為 良 好 抗 原 ; 此 分 子 上 可 被 抗 体 確 認 的部 位 , 僅 有 數 個 胺 基 酸 或 單 醣 , 稱 為 抗 原 決 定 基 (antigenic determinant) 或 稱epitope。 在 大 分 子 抗 原 上 , 可 能 有 數 個 抗 原 決 定 基 , 各 誘 導 出 專 一 性 抗 体 ;因 此 所 產 生 的 抗 血 清 , 含 有 對 抗 此 大 分 子 上 , 所 有 抗 原 決 定 基 的 抗 体 。抗 体 是 由 淋 巴 球 (B 細 胞 ) 所 分 泌 , 一 個 B 細 胞 , 只 能 分 泌 一 種 抗 体 , 對抗 專 一 性 抗 原 。 平 常 這 些 B 細 胞 處 於 休 眠 狀 態 , 當 抗 原 入 侵 時 , 才 活 化 起 來 ,增 生 、 成 熟 後 開 始 分 泌 抗 体 。 抗 体 是 一 種 蛋 白 質 ,V region基 本 單 体 分 子 量 約 160,000, 分 子 形 狀 如 Y 字 形( 圖 S1-1)。 與 抗 原 決 定 基 結 合 的 部 分 有 兩 處 , 此 兩處 的 分 子 構 造 完 全 一 樣 , 因 此 可 與 兩 分 子 抗 原 結合 。 抗 体 分 子 中 , 有 較 具 保 守 性 的 C 區 (constantC regionregion), 及 變 異 性 較 大 的 V 區 (variable region)。 C區 維 持 抗 体 分 子 的 基 本 構 形 ,V 區 則 造 成 抗 体 分 子 圖 S1-1 抗 體 分 子 構 造的 多 樣 性 , 能 對 各 種 抗 原 產 生 專 一 性 結 合 。有 兩 個 相 同 的 抗 原 結 合 區 。生 物 化 學 實 驗 S1-1

免 疫 電 泳 法S1抗 体 蛋 白 質 一 般 稱 為 免 疫 球 蛋 白 (immunoglobulins), 簡 稱 Ig; 可 再 細 分 為IgG, IgM, IgA, IgE 及 IgD 等 ; 其 中 IgA 為 二 元 体 ,IgM 為 五 元 体 , 其 餘 為 單 元体 。 各 種 Ig 的 分 子 構 造 在 其 C 區 有 點 差 異 , 稱 為 isotypic variation。 免 疫 動 物後 , 一 般 均 能 產 生 上 述 各 種 Ig。 但 不 同 種 動 物 的 同 一 類 Ig, 構 造 上 會 稍 有 差異 ; 例 如 兔 子 的 IgG 與 山 羊 的 IgG 就 不 完 全 相 同 。 若 把 兔 子 的 IgG 打 入 山 羊內 , 則 山 羊 會 產 生 抗 兔 子 IgG 的 抗 体 , 這 種 抗 体 的 抗 体 稱 為 二 次 抗 体 。 在 同一 動 物 体 內 , 其 所 含 IgG 分 子 也 不 盡 相 同 , 有 無 數 群 族 以 對 付 無 數 抗 原 。 這種 多 樣 性 的 成 因 , 是 由 於 V 區 的 變 異 所 造 成 , 稱 為 idiotypic variation。1.1.2 免 疫 電 泳一 個 抗 体 可 與 兩 個 抗 原 結 合 , 而 每 個 抗 原 分 子 上 , 通 常 不 只 有 一 個 抗 原 決 定基 , 又 可 與 若 干 抗 体 結 合 。 如 此 , 當 許 多 抗 原 與 許 多 抗 体 , 互 相 結 合 在 一 起 ,會 造 成 很 大 的 連 鎖 複 合 体 , 並 在 溶 液 中 沉 澱 下 來 , 稱 為 precipitin。 但 抗 原 -抗 体 反 應 若 要 造 成 沉 澱 晶 格 , 必 須 兩 者 間 的 莫 耳 比 例 適 中 ; 抗 原 或 抗 体 , 若 有一 方 濃 度 太 高 ( 或 太 低 ), 都 足 以 破 壞 晶 格 形 成 。雙 向 免 疫 擴 散 (double diffusion) 可 方 便 地 在 洋 菜 凝 膠 (agar) 上 , 測 試 抗 原與 抗 体 間 的 沉 澱 反 應 。 圖 S1-2A 簡 單 說 明 其 原 理 , 虛 線 代 表 抗 原 或 抗 体 的 濃度 , 因 擴 散 而 向 四 周 漸 減 ; 抗 原 與 抗 体 的 擴 散 範 圍 會 重 疊 , 在 最 適 當 濃 度 之 重疊 處 產 生 沉 澱 線 。 免 疫 電 泳 則 結 合 了 雙 向 免 疫 擴 散 以 及 洋 菜 凝 膠 電 泳 , 其 作法 如 圖 S1-2B 所 示 , 樣 本 先 跑 完 電 泳 , 然 後 再 對 其 抗 体 進 行 免 疫 擴 散 ( 注 意 箭頭 指 示 方 向 )。A沈 澱 線AbAg洋 菜 凝 膠B第 二次 元第 一 次 元抗 原抗 體C樣 本 槽中 央 槽圖 S1-2 雙 向 免 疫 擴 散 及 免 疫 電 泳 原 理 及 設 計S1-2 Biochemistry Laboratory

免 疫 電 泳 法S11.2.3 實 驗 步 驟 :洋 菜 膠 片 製 作1) 載 玻 片 預 先 打 底 ( 若 時 間 不 夠 可 省 略 ): 取 0.5% 洋 菜 溶 液 約 2.5 mL, 均 勻 塗 佈在 載 玻 片 上 , 凝 固 後 放 到 烘 箱 內 烘 乾 。2) 取 出 載 玻 片 , 水 平 放 好 , 有 打 底 的 那 面 朝 上 。3) 準 備 2% 洋 菜 溶 液 , 置 60℃ 水 浴 保 溫 ; 同 時 取 一 支 5 mL 吸 管 , 天 氣 太 冷 時 須以 電 爐 或 吹 風 機 加 溫 , 以 便 在 吸 取 洋 菜 溶 液 時 , 洋 菜 不 致 凝 固 在 吸 管 內 。4) 以 此 吸 管 吸 取 2.5~3.0 mL 洋 菜 溶 液 , 儘 速 依 圖 S1-4A 的 方 式 把 洋 菜 溶 液 均 勻塗 佈 到 載 玻 片 上 。 注 意 要 馬 上 以 吸 管 尖 把 洋 菜 表 面 整 平 , 若 有 氣 泡 立 刻 除 去 。洋 菜 膠 体 開 始 凝 固 時 , 就 不 要 再 去 動 它 。5) 數 分 鐘 後 , 當 膠 体 轉 成 白 色 , 表 示 凝 結 完 成 。6) 以 刀 片 在 膠 体 的 中 央 , 畫 兩 道 平 行 線 如 圖 S1-4B。 引 導 畫 線 的 鐵 尺 , 要 架 在 膠体 上 方 , 但 不 可 觸 及 膠 面 , 可 在 載 玻 片 兩 頭 用 硬 幣 墊 高 , 再 把 鐵 尺 架 在 上 面 ;刀 刻 要 深 及 底 部 , 兩 平 行 線 間 隔 不 可 大 於 2 mm, 約 一 個 硬 幣 的 厚 度 , 暫 時 不可 挖 掉 膠 体 。7) 取 滴 管 在 如 圖 S1-4C 的 位 置 打 洞 , 此 二洞 位 置 要 對 稱 。 打 洞 時 , 先 握 住 橡 皮 頭 ,在 預 定 位 置 上 垂 直 壓 下 , 放 開 橡 皮 頭 ,同 時 快 速 往 上 移 開 滴 管 , 要 注 意 洞 內 的膠 体 有 無 挖 出 。8) 畫 線 及 打 洞 時 , 最 好 先 在 紙 上 畫 好 實 際大 小 的 模 型 , 把 玻 片 放 在 上 面 進 行 。 每人 製 作 一 片 , 每 組 挑 出 一 片 進 行 電 泳 。洋 菜 膠 片 電 泳9) 四 組 共 用 一 個 Mupid 電 泳 槽 , 把 四 片 載玻 片 並 肩 放 到 電 泳 槽 中 , 正 負 極 槽 倒 入barbitone, 放 好 濾 紙 鹽 橋 並 潤 溼 之 , 注 意濾 紙 與 膠 片 要 貼 緊 ( 圖 S1-4D)。10) 以 微 量 注 射 針 筒 在 兩 個 樣 本 槽 分 別 注 入trypsin 及 胰 臟 抽 取 液 , 小 心 勿 溢 出 。ABCD+ -11) 裝 好 電 極 , 注 意 樣 本 由 負 極 ( 黑 色 ) 往 正極 ( 紅 色 ) 跑 , 以 16 mA 電 流 進 行 。圖 S1-4 免 疫 電 泳 膠 片 製 作S1-4 Biochemistry Laboratory

免 疫 電 泳 法S112) 樣 本 中 有 藍 色 染 料 , 俟 藍 色 點 接 近 另 一 端 時 , 終 止 電 泳 ; 小 心 取 出 載 玻 片 。◆ 注 意 : 一 定 要 確 定 電 源 已 關 , 才 可 取 出 載 玻 片 。雙 向 免 疫 擴 散13) 取 一 只 培 養 皿 , 鋪 上 一 層 衛 生 紙 , 以 水 潤 溼 之 ; 把 膠 片 上 洋 菜 的 中 央 槽 挑 空 ,然 後 將 玻 片 置 於 培 養 皿 內 的 衛 生 紙 上 。14) 在 中 央 槽 內 , 加 入 0.1 mL 小 白 鼠 抗 trypsin 抗 血 清 , 並 覆 上 蓋 子 ; 等 到 抗 血 清擴 散 進 入 洋 菜 之 後 , 才 可 攜 回 ; 約 一 日 後 , 可 觀 察 到 白 色 的 沉 澱 線 ( 拿 出 載 玻片 對 著 日 光 燈 看 )。15) 沉 澱 線 可 染 色 , 但 要 先 用 PBS ( 生 理 食 鹽 水 ) 浸 洗 4~5 d, 每 天 換 1~2 次 PBS;然 後 以 CBR 染 色 液 ( 同 膠 體 電 泳 實 驗 所 用 者 ) 染 色 1 h, 再 以 脫 色 液 脫 色 , 每天 至 少 換 一 次 , 持 續 數 日 , 直 到 背 景 呈 現 透 明 。1.3 結 果 與 報 告1.3.1 實 驗 結 果a) 進 行 電 泳 前 , 中 央 槽 為 何 不 先 挖 空 ? 若 先 挖 空 可 能 會 有 那 些 問 題 ?b) 洋 菜 電 泳 的 條 件 如 何 ? 與 聚 丙 烯 醯 胺 電 泳 有 何 不 同 之 處 ?c) 若 沒 有 用 CBR 染 色 , 請 準 確 畫 下 沈 澱 線 的 形 狀 ; 若 有 染 色 , 則 可 拍 照 。d) 討 論 沈 澱 線 的 形 成 , 與 抗 原 的 種 類 有 無 關 係 ?1.3.2 討 論 問 題a) 抗 體 與 其 抗 原 之 間 的 親 和 力 , 由 那 些 作 用 力 構 成 ?b) 抗 體 在 生 化 分 析 或 純 化 上 , 有 何 功 能 或 用 途 ?c) 本 實 驗 技 術 可 應 用 在 什 麼 方 面 ?1.4 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 155, 205, 217Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.174-182Roitt I, Brostoff J, Male D (2001) Immunology (6th ed) Chap. 4, 27生 物 化 學 實 驗 S1-5

Western Transfer and ImmunostainingS2 免 疫 轉 印 法莊 榮 輝膠 體 電 泳 可 以 把 蛋 白 質 依 照 分 子 量 大 小 分 開 , 若 膠 體 內 的 蛋 白 質 色 帶 能 轉 印 到 尼龍 膜 , 則 這 些 蛋 白 質 可 繼 續 以 其 專 一 性 抗 體 來 偵 測 , 成 為 更 強 大 的 解 析 工 具 。2.1 背 景 知 識膠 體 電 泳 的 原 理 與 前 面 P3 實 驗 完 全 一 樣 , 而 蛋 白 質 轉 印 也 是 相 同 的 機 制 , 只 是 轉個 方 向 , 把 膠 片 上 的 色 帶 印 到 尼 龍 膜 。2.1.1 蛋 白 質 轉 印膠 體 電 泳 的 解 析 力 雖 然 很 高 , 可 以 把 複 雜 的 蛋 白 質 混 合 物 分 離 開 來 , 但 是 不 能方 便 地 鑑 別 這 些 色 帶 的 身 分 ; 原 因 之 一 , 是 因 為 膠 體 本 身 易 脆 , 不 容 易 進 一 步操 作 , 因 此 要 先 把 這 些 色 帶 轉 移 到 尼 龍 薄 膜 上 , 再 繼 續 以 其 它 方 法 檢 定 之 ; 而最 常 用 的 方 法 , 便 是 以 抗 體 對 尼 龍 膜 上 的 蛋 白 質 色 帶 進 行 免 疫 偵 測 。A轉 印 三 明 治B塑 膠 夾 板Filter Paper免 疫 染 色 流 程 及 結 果轉 印E抗 體-+GelNitrocellulose海 綿 墊電 泳 膠 體CoomassieBlueStaining轉 印 膜PonceauStaining抗 體 偵 測 呈 色圖 S2-1 蛋 白 質 轉 印 及 免 疫 染 色 的 原 理 機 制生 物 化 學 實 驗 S2-1

免 疫 轉 印 法S2早 期 蛋 白 質 轉 印 法 是 使 用 硝 化 纖 維 紙 (nitrocellulose), 蛋 白 質 可 吸 附 在 紙上 的 硝 基 , 不 易 脫 落 。 後 來 改 用 尼 龍 材 質 的 薄 膜 ( 如 PVDF), 上 面 有 各 種 修 飾基 團 , 可 強 力 地 吸 引 住 蛋 白 質 , 但 降 低 非 專 一 性 的 吸 附 , 使 結 果 更 為 可 靠 。 轉印 膜 在 轉 印 後 的 空 白 部 份 , 通 常 都 要 以 無 關 的 蛋 白 質 覆 蓋 起 來 , 以 免 後 面 操 作所 用 到 的 抗 體 等 物 質 , 吸 附 到 轉 印 膜 上 去 。 通 常 都 使 用 脫 脂 奶 粉 , 我 們 則 比 較常 用 明 膠 , 隨 人 喜 好 而 定 。轉 印 時 , 要 小 心 分 子 量 較 小 的 蛋 白 質 , 可 能 會 穿 過 轉 印 膜 而 損 失 ; 可 在 轉印 緩 衝 液 中 添 加 甲 醇 (10~30%), 以 增 加 轉 印 膜 對 蛋 白 質 的 吸 附 力 量 。 反 之 ,也 有 商 品 標 榜 在 一 次 轉 印 後 , 可 以 同 時 印 出 十 張 相 同 的 轉 印 膜 , 減 少 膠 片 消 耗與 轉 印 時 間 ; 這 在 蛋 白 質 體 學 的 應 用 上 , 有 相 當 大 的 吸 引 力 , 因 為 同 一 張 二 次元 電 泳 的 轉 印 膜 , 可 能 要 進 行 很 多 種 不 同 的 偵 測 反 應 , 因 此 需 要 很 多 張 相 同 的轉 印 膜 。另 外 , 注 意 有 些 在 轉 印 以 後 要 分 離 色 點 , 然 後 進 行 胺 基 酸 定 序 , 若 是 使 用Edman degradation 反 應 的 定 序 儀 , 則 轉 印 緩 衝 液 中 避 免 使 用 帶 有 -NH 2 基 團 的 成份 ( 如 Tris, Gly), 以 免 干 擾 Edman degradation。有 時 候 , 可 以 把 酵 素 轉 印 到 膜 上 , 然 後 直 接 在 上 面 進 行 催 化 反 應 , 若 能 產生 不 溶 性 的 生 成 物 , 原 地 凝 集 在 轉 印 膜 上 , 則 可 做 為 酵 素 的 檢 定 之 用 。 例 如 磷酸 脢 (phosphatase) 或 過 氧 化 氫 脢 (peroxidase), 都 可 直 接 在 轉 印 後 呈 色 。 當 然 ,若 使 用 SDS 膠 體 電 泳 , 則 必 須 在 轉 印 後 , 使 酵 素 充 分 回 復 原 態 及 活 性 。2.1.2 免 疫 染 色膠 體 電 泳 的 高 解 析 力 , 加 上 抗 體 的 高 專 一 性 , 結 合 成 為 一 個 極 為 強 大 的 分 析 工具 。 因 此 , 一 直 到 目 前 , 電 泳 轉 印 加 上 免 疫 染 色 的 流 程 , 都 是 所 有 生 物 科 技 相關 實 驗 室 所 必 備 。一 次 抗 體 有 時 可 以 買 到 商 品 , 但 通 常 都 極 為 昂 貴 ; 較 不 常 見 的 抗 原 , 則 必須 自 行 製 備 抗 體 , 那 就 要 先 準 備 好 純 質 抗 原 。 抗 原 與 佐 劑 (adjuvant) 混 合 成乳 劑 後 , 進 行 動 物 免 疫 , 通 常 使 用 大 白 兔 或 小 白 鼠 。 每 兩 週 免 疫 一 次 , 如 此 進行 追 加 免 疫 約 四 到 六 次 , 試 採 血 檢 測 血 清 效 價 , 若 血 清 稀 釋 1,000 到 10,000 倍 ,仍 然 可 在 轉 印 膜 上 染 出 抗 原 的 色 帶 , 則 免 疫 可 謂 成 功 , 即 可 進 行 採 血 , 製 得 抗血 清 , 其 中 即 含 有 所 要 的 專 一 性 抗 體 。專 一 性 抗 體 會 像 『 巡 弋 飛 彈 』 一 樣 , 自 動 去 找 出 抗 原 色 帶 , 並 且 與 此 色 帶緊 密 結 合 , 然 後 再 利 用 二 次 抗 體 ( 即 第 一 次 所 用 抗 體 的 抗 體 , 可 以 買 到 ) 與 上述 抗 體 結 合 。 圖 S2-2 說 明 此 一 設 計 , 抗 體 上 面 標 有 2 者 即 為 二 次 抗 體 , 後 面連 結 著 標 誌 酵 素 (E); 標 誌 酵 素 多 使 用 上 述 的 磷 酸 脢 或 者 過 氧 化 氫 脢 , 兩 者 在加 入 基 質 後 , 都 可 生 成 具 有 強 烈 呈 色 的 沈 澱 。S2-2 Biochemistry Laboratory

免 疫 轉 印 法S2使 用 二 次 抗 體 與 酵 素 的 連 結 體 , 雖 然 增 多 一 次 操 作 動 作 , 但 也 提 升 了 整 個反 應 的 專 一 性 , 因 為 多 加 一 次 專 一 性 篩 選 步 驟 , 而 且 自 由 的 一 次 抗 體 效 價 較高 。 同 時 也 較 方 便 , 因 為 各 種 一 次 抗 體 都 可 直 接 使 用 , 然 後 用 二 次 抗 體 與 酵 素連 結 體 即 可 , 不 須 各 種 一 次 抗 體 都 得 去 做 酵 素 標 誌 。2.1.3 實 驗 大 綱2E酵 素連 結本 實 驗 分 成 三 個 部 份 ..(1) SDS-PAGE 膠 體 電 泳 、(2) 蛋 白 質 轉 印 、(3) 免 疫 染色 。 樣 本 為 前 面 實 驗 的 trypsin 及 胰 臟 抽 取 液 , 並 使 用 CHOM 為 負 對 照 組 , 然後 以 抗 trypsin 的 抗 體 為 探 針 , 進 行 專 一 性 的 偵 測 。轉印膜不 相 關 蛋 白 質一 次 抗 體二 次 抗 體圖 S2-2 免 疫 染 色 的 設 計S2 免 疫 轉 印 法電 泳蛋 白 質 轉 印免 疫 染 色TrypsinCHOMP1, P2呈 色二 次 抗 體膠 體 電 泳蛋 白 質 轉 印一 次 抗 體圖 S2-3 蛋 白 質 轉 印 及 免 疫 染 色 操 作 流 程生 物 化 學 實 驗 S2-3

免 疫 轉 印 法S22.2 膠 體 電 泳兩 組 鑄 造 兩 片 平 板 SDS 電 泳 膠 片 , 分 別 進 行 各 組 trypsin 樣 本 的 分 析 , 接 著 並 進 行蛋 白 質 轉 印 , 則 請 依 照 下 節 2.3 實 驗 步 驟 操 作 。2.2.1 儀 器 用 具a) 鑄 膠 套 件 ( 含 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 )。b) 間 隔 條 (spacer, 0.75 mm) 及 樣 本 梳 (comb, 10 well)。c) 垂 直 迷 你 電 泳 槽 (Hoefer SE-250 平 板 式 垂 直 電 泳 槽 )。d) 電 源 供 應 器 (Pharmacia Biotech EPS 200)。e) 微 量 針 管 (Hamilton 80465) 或 電 泳 樣 本 專 用 吸 管 頭 。f) 染 色 脫 色 方 盒 。2.2.2 藥 品 試 劑所 用 藥 品 與 原 態 電 泳 類 似 , 但 是 多 了 (e) SDS 及 (f) 樣 本 溶 液 , 整 個 系 統 都 要加 入 SDS; 同 時 有 標 準 分 子 量 的 蛋 白 質 (k), 可 供 比 對 樣 本 的 分 子 量 。a) A 液 (T 30%, C 2.6%): 注 意 ! 本 溶 液 有 毒 性 !丙 烯 醯 胺 溶 液 acrylamideBis (N,N’-methylene-bis-acrylamide)加 水 至 50 mL, 若 難 溶 則 稍 微 加 熱 助 溶 之 , 儲 存 於 4℃。14.6 g0.4 gb) B 液 ( 分 離 膠 體 緩 衝 液 ):TrisTEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine)18.2 g0.36 mL用 60 mL 水 溶 解 後 , 以 HCl 調 pH 至 8.8 後 加 水 至 100 mL, 儲 存 於 4℃。c) C 液 ( 焦 集 膠 體 緩 衝 液 ):Tris0.6 gTEMED 40 μL用 8 mL 水 溶 解 後 , 以 HCl 調 pH 至 6.8 後 加 水 至 10 mL, 儲 存 於 4℃。d) 通 用 電 泳 緩 衝 液 (5×):Tris 90 mM×5 54.5 gEDTA·2Na 2.5 mM×5 4.7 gBoric acid 80 mM×5 24.8 g加 水 800 mL 溶 解 , 以 NaOH 調 pH 至 8.4 後 , 加 水 至 1000 mL, 室 溫 保 存 。使 用 前 要 以 蒸 餾 水 稀 釋 五 倍 , 並 且 加 SDS 成 為 0.1%。e) APS 溶 液 (ammonium persulfate, 10%):S2-4 Biochemistry Laboratory

免 疫 轉 印 法S2取 0.1 g 溶 於 1 mL 水 , 要 確 實 溶 解 完 全 ; 使 用 前 新 鮮 配 置 , 過 夜 者 不 再 用 。f) 10% SDS 水 溶 液 。g) 異 丙 醇 。h) SDS 樣 本 溶 液 (2×):Tris (250 mM)0.3 gEDTA·2Na (4 mM)14.9 mgSDS (4%)0.4 gβ-Mercaptoethanol (10%) 1 mL加 二 次 水 8 mL 溶 解 , 調 pH 至 6.8 之 後 , 再 加 水 至 10 mL。i) 追 蹤 染 料 :Bromophenol Blue (BPB) 1 mg 加 5 mL 水 及 5 mL 甘 油 。j) CBR 染 色 液 :Coomassie Brilliant Blue R-250 1.5 g 加 250 mL 水 後 再 加 250 mL甲 醇 及 50 mL 醋 酸 , 過 濾 去 掉 不 溶 物 , 置 於 排 煙 櫃 中 公 用 。 要 回 收 。k) 脫 色 液 : 甲 醇 (20%) 及 醋 酸 (10%) 的 水 溶 液 , 置 於 排 煙 櫃 中 公 用 。l) 標 準 蛋 白 質 組 合 :預 先 染 色 之 低 分 子 量 標 準 (Novex SeeBlue Pre-stained Standard)ProteinMolecular mass (D)Myosin 250,000Bovine serum albumin 98,000Glutamate dehydrogenase 64,000Alcohol dehydrogenase 50,000Carbonic anhydrase 36,000Myoglobin 30,000Lysozyme 16,000Aprotinin 6,000Insulin B chain 4,0002.2.3 鑄 膠 (SDS-PAGE)表 S2-1 各 種 膠 體 溶 液 的 濃 度 ( 單 位 mL)分 離 膠 体 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% 焦 集 膠 體 4%A 液 2.5 3.4 4.2 5.0 A 液 0.7B 液 2.5 2.5 2.5 2.5 C 液 1.3水 4.8 3.9 3.1 2.3 水 2.810% SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 10% SDS 0.1APS 0.1 0.1 0.1 0.1 APS 0.1Total 10.0 10.0 10.0 10.0 Total 5.0生 物 化 學 實 驗 S2-5

免 疫 轉 印 法S2分 離 膠 體 每 支 約 需 2~3 mL, 故 一 組 配 製 10 mL 即 可 。1) 將 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 清 洗 淨 後 擦 乾 , 再 以 玻 璃 清 潔 劑 擦 拭 乾 淨 , 選 擇 所 需 厚度 間 隔 條 (spacer) 組 裝 於 鑄 膠 套 件 , 本 課 程 由 助 教 事 先 準 備 架 好 。2) 依 照 表 S2-1 所 列 的 各 溶 液 比 例 , 選 擇 所 需 的 分 離 膠 體 濃 度 , 本 次 實 驗 使 用12.5% 膠 體 。 配 置 膠 體 溶 液 時 , 其 中 APS 溶 液 必 須 最 後 加 入 , 小 心 混 合 均 勻 ,以 避 免 氣 泡 產 生 , 然 後 以 微 量 吸 管 小 心 注 入 鑄 膠 套 件 。3) 膠 體 約 佔 玻 片 的 2/3 至 3/4 高 度 , 加 完 後 儘 快 在 膠 體 液 面 上 方 小 心 加 入 100 μL異 丙 醇 , 以 壓 平 膠 體 液 面 。4) 約 30 min 至 1 h 後 ( 天 冷 須 更 久 ), 凝 膠 完 成 , 倒 出 上 層 的 異 丙 醇 。5) 配 製 焦 集 膠 體 溶 液 , 先 準 備 好 所 需 之 樣 本 梳 (comb), 加 入 溶 液 後 立 刻 插 入 , 整個 過 程 必 須 在 5 min 完 成 , 約 30 min 可 完 成 凝 膠 。6) 拆 下 膠 片 並 清 理 , 將 多 餘 的 凝 膠 去 除 , 鑄 好 的 膠 片 可 置 封 口 袋 中 於 4℃ 保 存 ,但 要 加 入 少 量 蒸 餾 水 防 止 膠 片 乾 裂 , 使 用 期 限 約 兩 週 。 一 組 使 用 一 片 。M T T C P P C T T M圖 S2-4 添 加 樣 本 的 配 置 方 式T 為 trypsin ( 可 能 有 不 同 動 物 來 源 的 樣 本 ),C 為 CHOM,P 為 胰 臟 抽 取 液 ,M 為 標 準蛋 白 質 。 跑 完 電 泳 後 由 中 央 切 開 , 右 上 角 各 切 角 做 記 號 ( 箭 頭 虛 線 ); 一 半 進 行 CBR 染色 , 另 一 半 則 馬 上 進 行 轉 印 , 請 接 續 2.3 免 疫 轉 印 法 。2.2.4 電 泳1) 若 膠 片 是 在 4℃ 中 保 存 , 須 先 取 出 回 復 室 溫 。 同 時 將 稀 釋 成 一 倍 的 SDS 通 用 電泳 緩 衝 液 , 倒 入 電 泳 槽 底 部 。 然 後 把 膠 片 以 45 度 架 到 電 泳 槽 上 , 避 免 附 著 氣泡 ; 當 電 泳 夾 夾 妥 後 , 在 電 泳 玻 片 組 合 的 上 方 槽 內 , 加 入 SDS 電 泳 緩 衝 液 。S2-6 Biochemistry Laboratory

免 疫 轉 印 法S2◆ 膠 片 一 定 要 等 回 復 室 溫 後 才 能 架 到 電 泳 槽 , 否 則 玻 片 會 因 熱 漲 而 撐 破 。2) 電 泳 前 先 以 微 量 針 管 清 洗 各 樣 本 槽 , 避 免 有 凝 膠 不 完 全 的 殘 餘 物 留 在 槽 內 。3) 樣 本 處 理 : 取 trypsin 樣 本 20 μL, 因 其 中 含 甲 酸 溶 液 , 先 加 入 2 μL 1 N NaOH中 和 之 , 再 加 入 20 μL SDS 樣 本 溶 液 , 及 20 μL 追 蹤 染 料 BPB 均 勻 混 合 , 在沸 水 浴 煮 沸 10 min 後 放 冷 。CHOM 取 20 μL 如 法 處 理 , 但 不 須 中 和 。 請 在 鑄膠 的 空 檔 時 , 處 理 好 樣 本 。4) 取 適 量 的 樣 本 ( 約 10~15 μL), 依 圖 S2-4 配 置 , 以 微 量 針 管 小 心 注 入 樣 本 槽 ,避 免 氣 泡 陷 入 。 另 外 , 也 注 入 標 準 蛋 白 質 (M) 5 μL, 作 為 分 子 量 之 參 考 。5) 蓋 上 電 泳 槽 的 蓋 子 , 確 認 正 負 電 極 裝 置 正 確 ( 由 負 極 往 正 極 跑 ), 連 接 上 電 源 供應 器 , 定 電 壓 以 100~150 V 進 行 電 泳 。6) 在 電 泳 過 程 中 , 特 別 觀 察 標 準 蛋 白 質 中 各 個 色 帶 的 泳 動 情 形 。6) 待 追 蹤 染 料 跑 出 膠 片 後 , 關 掉 電 源 , 取 出 膠 片 , 並 將 膠 體 平 均 切 成 兩 半 , 各 以解 剖 刀 截 去 右 上 角 做 記 號7) 一 半 進 行 蛋 白 質 染 色 , 另 一 半 馬 上 浸 入 轉 印 緩 衝 液 平 衡 20~30 min, 繼 續 進 行轉 印 , 參 考 下 節 2.3 步 驟 。2.2.4 染 色 及 脫 色1) 將 電 泳 膠 片 浸 入 CBR 染 色 液 中 , 染 色 液 用 量 只 要 覆 蓋 過 膠 片 即 可 , 一 定 要 蓋上 蓋 子 , 置 於 平 台 震 盪 器 上 搖 盪 30 min。2) 倒 出 染 色 液 , 用 自 來 水 沖 洗 後 加 入 脫 色 液 , 脫 色 液 也 一 樣 蓋 過 膠 片 即 可 ; 約 10min 可 換 新 脫 色 液 , 一 直 重 複 到 背 景 呈 現 透 明 為 止 。3) 若 蛋 白 質 濃 度 較 低 , 染 色 時 間 可 加 長 (1 h) 以 增 加 色 帶 深 度 。4) 脫 色 完 成 的 膠 片 , 可 以 用 玻 璃 紙 三 明 治 乾 燥 之 , 經 護 貝 後 可 永 久 保 存 。2.3 蛋 白 質 轉 印首 先 以 迷 你 平 板 膠 體 電 泳 對 樣 本 蛋 白 質 進 行 分 離 , 然 後 轉 印 到 尼 龍 膜 上 去 。2.3.1 儀 器 設 備a) 平 板 迷 你 電 泳 槽 (Hoefer, Mighty Small SE-250) 及 所 有 附 件 。b) 電 泳 轉 印 槽 (Hoefer, TE-22) 及 海 綿 、 卡 夾 各 兩 片 。c) 電 源 供 應 器 ( 可 達 500 mA)。d) 震 盪 器 及 塑 膠 染 色 方 皿 。生 物 化 學 實 驗 S2-7

免 疫 轉 印 法S22.3.2 藥 品 試 劑a) SDS-PAGE 膠 體 , 由 電 泳 實 驗 所 得 之 一 半 SDS-PAGE 膠 片 。b) 轉 印 膜 (Millipore Immobilon, PVDF)、 甲 醇 少 許 。c) 濾 紙 (Whatman 3 mm) 兩 張 。d) 轉 印 緩 衝 液 (blotting buffer, 10×):Tris30.3 gGlycine 144 g加 水 至 800 mL,pH 調 至 8.3 後 , 加 水 至 1,000 mL。 SDS-PAGE 轉 印 時 , 轉印 緩 衝 液 中 須 加 有 10% (v/v) 甲 醇 。e) PBST (PBS 加 0.05% Tween)f) Urea-PBST:Urea (6 M) 36 g加 入 PBST 加 熱 溶 解 後 , 以 PBST 添 加 至 100 mL。2.3.3 實 驗 步 驟 :蛋 白 質 轉 印1) SDS-PAGE 電 泳 膠 片 接 續 2.2 節 電 泳 , 其 中 一 半 進 行 CBR 染 色 , 另 一 半 則 保 留在 本 實 驗 作 為 轉 印 之 用 , 電 泳 後 切 半 馬 上 浸 入 轉 印 緩 衝 液 平 衡 15 min。2) 轉 印 膜 PVDF 要 裁 得 比 膠 片 稍 大 , 因 膠 片 平 衡 後 體 積 會 略 膨 漲 。PVDF 為 疏 水性 , 必 須 先 以 100% 甲 醇 短 暫 溼 潤 後 , 再 浸 入 轉 印 緩 衝 液 (1×) 中 備 用 。3) 取 兩 張 稍 大 的 濾 紙 , 於 轉 印 緩 衝 液 中 浸 潤 備 用 。 取 出 轉 印 卡 夾 , 先 墊 一 張 多 孔性 海 綿 , 鋪 上 一 張 濾 紙 , 再 小 心 鋪 上 膠 片 , 勿 陷 入 任 何 氣 泡 , 鋪 上 轉 印 膜 , 再蓋 上 一 層 濾 紙 及 海 綿 , 再 把 整 個 三 明 治 卡 夾 裝 好 。 可 參 考 圖 S2-1 的 組 合 。4) 置 入 已 裝 有 轉 印 緩 衝 液 (1×) 的 轉 印 槽 中 , 注 意 PVDF 那 面 朝 正 極 , 膠 片 面 朝負 極 。 儘 量 除 去 附 在 卡 夾 外 面 的 氣 泡 , 氣 泡 的 存 在 將 使 轉 印 效 率 變 差 。5) 於 4℃ 中 以 400 mA 進 行 轉 印 , 轉 印 槽 內 要 加 以 攪 拌 , 以 免 溫 度 過 高 或 不 均 ,轉 印 60 min 後 中 止 。6) 取 出 轉 印 膜 , 浸 在 尿 素 (urea-PBST) 中 過 夜 , 次 日 換 成 PBST, 等 到 次 週 繼 續免 疫 染 色 ; 尿 素 可 洗 去 蛋 白 質 分 子 上 的 SDS, 同 時 可 將 一 部 份 蛋 白 質 分 子 恢 復成 原 態 , 以 增 加 抗 體 的 確 認 機 率 。7) 在 電 泳 樣 本 中 若 含 有 pre-stained 標 準 蛋 白 質 , 則 可 作 為 轉 印 效 率 之 參 考 。S2-8 Biochemistry Laboratory

免 疫 轉 印 法S22.4 免 疫 染 色轉 印 膜 上 的 蛋 白 質 繼 續 用 抗 體 偵 測 , 首 先 用 一 次 抗 體 去 結 合 抗 原 色 帶 , 再 加 入 二 次抗 體 與 酵 素 的 結 合 體 , 最 後 抗 原 色 帶 將 會 被 標 上 酵 素 , 以 酵 素 反 應 呈 色 之 。2.4.1 儀 器 設 備a) 平 台 震 盪 器 。2.4.2 藥 品 試 劑a) 明 膠 -NET:Gelatin 0.25% 2.5 gNaCl 0.15 M 8.75 gEDTA·2Na 5 mM 1.8 gTween 20 0.05% 0.5 mLTris 50 mM 6.05 g加 水 800 mL 並 加 熱 至 明 膠 溶 解 , 調 pH 至 8.0, 再 加 水 至 1,000 mL。b) 一 次 抗 體 : ( 小 白 鼠 抗 猪 的 trypsin 抗 體 )通 常 要 免 疫 大 白 兔 或 小 白 鼠 以 製 備 一 次 抗 體 , 一 般 抗 體 的 使 用 濃 度 在 1 : 1,000至 1 : 5,000 之 間 , 視 抗 體 效 價 而 定 , 使 用 前 以 上 述 明 膠 -NET 稀 釋 之 。c) 二 次 抗 體 -HRP 連 結 體 :通 常 都 可 以 購 得 上 述 一 次 抗 體 的 二 次 抗 體 , 並 且 連 結 有 標 誌 酵 素 (horse radishperoxidase, HRP) 或 標 誌 物 ( 如 螢 光 物 或 biotin); 其 使 用 濃 度 請 依 照 廠 商 建 議 ,也 稀 釋 在 明 膠 -NET 中 。d) HRP 呈 色 劑 DAB:Diaminobenzidine (DAB) 5 mgH 2 O 2 30% 10 μL用 100 mL PBS 溶 解 , 必 須 新 鮮 製 備 , 不 可 放 過 夜 ;DAB 是 致 癌 物 質 。e) HRP 螢 光 呈 色 劑 :SuperSignal West Pico Substrate (Pierce)Luminol solution ( 含 enhancer)0.5 mLPeroxide solution0.5 mL上 面 兩 種 溶 液 以 1:1 混 合 後 立 刻 使 用 , 一 整 張 轉 印 紙 約 需 1 mL。2.4.3 實 驗 步 驟 :1) 尿 素 洗 過 的 轉 印 紙 再 以 15 mL PBST 洗 兩 次 , 每 次 5 min。2) 加 入 15 mL 一 次 抗 體 ( 適 當 濃 度 溶 於 明 膠 -NET 中 ), 室 溫 下 反 應 1 h。生 物 化 學 實 驗 S2-9

免 疫 轉 印 法S2◆ 一 般 抗 體 的 使 用 濃 度 是 在 1:1,000 至 1:5,000 之 間 , 視 抗 體 效 價 而 定 。3) 以 15 mL PBST 洗 3 次 , 每 次 約 10 min。4) 加 入 15 mL 二 次 抗 體 -HRP 連 結 體 , 室 溫 下 反 應 1 h。5) 以 15 mL PBST 洗 3 次 , 每 次 約 10 min。6) 倒 入 HRP 呈 色 劑 DAB 15 mL, 褐 色 色 帶 應 很 快 出 現 。7) 呈 色 約 在 1~5 min 內 完 成 , 應 當 在 背 景 開 始 加 深 前 中 止 呈 色 。8) 倒 去 呈 色 液 , 並 以 蒸 餾 水 清 洗 數 次 , 取 出 晾 乾 後 避 光 保 存 。◆ 若 使 用 螢 光 染 色 劑 , 則 上 面 6) 改 加 入 1 mL SuperSignal 呈 色 劑 , 並 在 螢 光 掃 描 儀中 顯 像 至 清 晰 色 帶 出 現 , 弱 一 點 的 色 帶 , 可 能 要 呈 色 10 min 以 上 。2.5 結 果 與 報 告a) 請 以 掃 描 或 拍 照 記 錄 免 疫 染 色 結 果 , 注 意 有 幾 條 色 帶 呈 現 。b) 免 疫 染 色 圖 譜 請 與 CBR 染 色 結 果 詳 細 比 對 。c) 由 結 果 可 推 論 所 用 抗 體 的 專 一 性 如 何 。2.6 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 155, 205, 217Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.180-182Roitt I, Brostoff J, Male D (2001) Immunology (6th ed) Chap. 4, 27S2-10 Biochemistry Laboratory

Enzyme KineticsS3 酵 素 動 力 學莊 榮 輝酵 素 動 力 學 是 以 各 種 濃 度 的 基 質 , 添 加 固 定 量 酵 素 進 行 催 化 , 然 後 檢 定 所 得 到 的生 成 物 多 寡 , 即 可 測 定 在 各 種 不 同 基 質 濃 度 下 , 酵 素 的 表 現 情 形 。 酵 素 抑 制 劑 會 阻礙 酵 素 的 表 現 , 也 可 由 酵 素 動 力 學 的 行 為 觀 察 之 。3.1 背 景 知 識酵 素 與 其 基 質 之 間 , 具 有 專 一 性 的 結 合 與 催 化 關 係 , 這 種 行 為 可 以 用 動 力 學 的 方 法描 述 之 , 求 得 此 酵 素 的 最 高 催 化 速 率 , 以 及 酵 素 與 基 質 間 的 親 和 力 。3.1.1 Michaelis-Menten 動 力 學 公 式酵 素 轉 化 脢 invertase 很 早 就 被 發 現 , 可 以 把 蔗 糖 水 解 成 葡 萄 糖 及 果 糖 , 由 於 反應 前 後 這 幾 種 糖 類 的 旋 光 度 有 很 大 改 變 , 好 像 把 旋 光 度 整 個 轉 化 過 去 , 因 此 稱為 轉 化 脢 。Michaelis 及 Menten 利 用 轉 化 脢 為 工 具 , 添 加 不 同 濃 度 的 蔗 糖 進 行 酵 素 的 催化 反 應 , 然 後 觀 察 所 產 生 單 糖 的 速 率 如 何 。 他 們 發 現 , 當 基 質 的 量 越 高 , 轉 化脢 催 化 反 應 的 速 率 就 越 高 , 最 後 到 達 飽 和 最 高 速 率 ; 他 們 並 且 把 這 個 關 係 , 以數 學 公 式 寫 出 來 , 稱 為 Michaelis-Menten 公 式 , 並 由 作 圖 推 出 一 個 常 數 K m(Michaelis-Menten 常 數 ), 可 指 示 酵 素 與 基 質 之 間 親 和 力 的 大 小 ; 同 時 , 也 可 推得 此 酵 素 的 最 高 催 化 速 率 V max 。 請 複 習 生 物 化 學 課 程 中 的 相 關 文 字 , 試 著 自行 寫 出 Michaelis-Menten 公 式 並 解 釋 其 意 義 。3.1.2 酵 素 抑 制 劑酵 素 有 其 專 一 性 抑 制 劑 , 其 分 子 構 形 大 多 類 似 酵 素 的 基 質 , 酵 素 可 以 與 之 結合 , 但 是 無 法 完 成 正 常 的 催 化 反 應 。生 物 化 學 實 驗 S3-1

酵 素 動 力 學S33.1.3 實 驗 大 綱本 實 驗 分 成 幾 個 部 份 ..(1) 決 定 最 適 當 的 酵 素 濃 度 、(2) 傳 統 的 酵 素 動 力 學 操作 、(3) 決 定 最 適 當 的 抑 制 劑 濃 度 、(4) 添 加 抑 制 劑 的 酵 素 抑 制 動 力 學 。S3 酵 素 動 力 學動 力 學抑 制 劑Trypsin最 適 濃 度動 力 學實 驗+ CHOM最 適 濃 度動 力 學實 驗P2雙 倒 數 作 圖P1雙 倒 數 作 圖K m , V maxK i , V max圖 S2-1 蛋 白 質 轉 印 及 免 疫 染 色 流 程3.2 酵 素 動 力 學要 先 決 定 一 個 適 當 的 酵 素 濃 度 , 能 夠 產 生 足 量 的 生 成 物 以 供 測 量 , 但 又 不 會 催 化 過度 ; 然 後 固 定 使 用 此 酵 素 濃 度 , 加 入 各 種 不 同 量 的 基 質 , 就 可 做 出 動 力 學 曲 線 。3.2.1 儀 器 設 備a) ELISA 光 度 計 。b) 微 量 滴 定 盤 (96-well microtiter plate)。3.2.2 藥 品 試 劑a) Trypsin ( 由 實 驗 P2 所 製 備 者 , 或 者 由 助 教 提 供 )。b) Tris 緩 衝 液 (0.05 M, pH 8.2, 含 20 mM CaCl 2 )。c) BAPNA 合 成 基 質 液 : 可 被 trypsin 水 解 而 呈 黃 色 。配 製 法 : 取 BAPA 43.5 mg 加 入 1 mL DMSO 懸 濁 均 勻 , 等 約 1 h 完 全 溶 解 ,慢 慢 滴 入 100 mL Tris 緩 衝 液 同 時 快 速 攪 拌 , 讓 兩 者 混 合 均 勻 。3.2.3 實 驗 步 驟 :S3-2 Biochemistry Laboratory

酵 素 動 力 學S3決 定 最 適 酵 素 濃 度1) 取 出 你 所 製 備 的 trypsin, 以 Tris 緩 衝 液 做 一 系 列 稀 釋 (1/2, 1/4. 1/8, 1/16 …);請 加 一 空 白 組 , 直 接 以 Tris 緩 衝 液 為 樣 本 。2) 在 微 量 滴 定 盤 上 , 每 個 濃 度 取 樣 50 μL, 加 入 200 μL BAPNA 液 , 混 合 後 反 應10 min, 漸 漸 出 現 黃 色 , 以 ELISA 光 度 計 測 吸 光 值 (A 405 )。3) 取 一 酵 素 濃 度 , 其 ELISA 吸 光 值 最 高 , 但 又 不 超 過 1 以 上 者 , 作 為 下 面 酵 素動 力 學 所 指 定 的 酵 素 濃 度 。酵 素 動 力 學4) 取 BAPNA 基 質 液 , 以 Tris 緩 衝 液 作 一 系 列 稀 釋 (1/2, 1/4. 1/8, 1/16 …)。5) 在 微 量 滴 定 盤 上 , 取 上 面 指 定 濃 度 的 酵 素 50 μL, 加 入 BAPNA 不 同 濃 度 稀 釋 液各 200 μL, 混 合 後 反 應 10 min, 同 法 以 ELISA 光 度 計 測 吸 光 值 (A 405 )。3.3 酵 素 抑 制 動 力 學在 反 應 中 加 入 抑 制 劑 , 會 改 變 酵 素 的 動 力 學 行 為 。 同 樣 地 , 先 決 定 一 個 最 適 的 抑 制劑 濃 度 , 可 以 抑 制 50% 酵 素 活 性 , 然 後 以 此 濃 度 進 行 抑 制 劑 的 動 力 學 實 驗 。3.3.1 儀 器 設 備同 上 一 小 節 。3.3.2 藥 品 試 劑a) CHOM ( 由 實 驗 P1 所 製 備 者 )。b) 同 上 一 小 節 。3.3.3 實 驗 步 驟 :決 定 最 適 CHOM 濃 度1) 取 出 你 所 製 備 的 CHOM, 以 Tris 緩 衝 液 做 一 系 列 稀 釋 (1/2, 1/4. 1/8, 1/16 …);請 加 一 空 白 組 , 直 接 以 Tris 緩 衝 液 為 樣 本 。2) 在 微 量 滴 定 盤 上 , 上 述 CHOM 每 個 濃 度 取 樣 10 μL, 加 入 40 μL 指 定 濃 度 的trypsin 溶 液 , 混 合 均 勻 後 , 在 室 溫 中 靜 置 10 min。3) 加 入 200 μL BAPNA 液 , 混 合 後 反 應 10 min, 漸 漸 出 現 黃 色 , 以 ELISA 光 度 計測 吸 光 值 (A 405 )。4) 取 一 CHOM 濃 度 , 其 ELISA 吸 光 值 最 約 為 空 白 組 吸 光 值 的 一 半 , 作 為 下 面 酵素 抑 制 動 力 學 所 指 定 的 CHOM 濃 度 。生 物 化 學 實 驗 S3-3

酵 素 動 力 學S3酵 素 抑 制 動 力 學5) 取 BAPNA 基 質 液 , 以 Tris 緩 衝 液 作 一 系 列 稀 釋 (1/2, 1/4. 1/8, 1/16 …)。6) 在 微 量 滴 定 盤 上 , 取 上 面 指 定 濃 度 酵 素 40 μL, 指 定 濃 度 CHOM 10 μL, 混 合均 勻 後 在 室 溫 靜 置 10 min。7) 同 樣 製 作 不 加 CHOM 的 反 應 ,CHOM 以 Tris 緩 衝 液 取 代 , 如 法 操 作 。8) 加 入 BAPNA 不 同 濃 度 稀 釋 液 各 200 μL, 混 合 後 反 應 10 min, 同 法 以 ELISA 光度 計 測 吸 光 值 (A 405 )。3.4 結 果 與 報 告3.4.1 酵 素 動 力 學a) 由 動 力 學 實 驗 得 到 一 組 數 據 , 以 基 質 量 的 改 變 為 x 軸 , 以 所 測 得 的 吸 光 值 為 y軸 直 接 作 圖 , 應 可 得 到 一 條 動 力 學 曲 線 。b) 一 樣 的 數 據 , 改 以 基 質 量 的 倒 數 為 x 軸 , 而 以 吸 光 值 的 倒 數 為 y 軸 , 得 到 雙 倒數 作 圖 , 應 該 可 得 到 一 條 直 線 。c) 由 雙 倒 數 直 線 , 應 該 可 推 得 trypsin 的 K m 及 V max , 請 注 意 兩 者 的 單 位 為 何 。3.4.2 酵 素 抑 制 動 力 學a) 由 所 得 到 的 數 據 , 同 樣 做 出 直 接 作 圖 , 以 及 雙 倒 數 作 圖 , 但 各 有 兩 條 線 , 其 依為 酵 素 的 動 力 學 曲 線 , 另 一 為 抑 制 劑 的 抑 制 曲 線 。b) 比 較 兩 條 雙 倒 數 動 力 學 曲 線 , 並 推 得 其 K m 及 V max 。3.5 參 考 文 獻莊 榮 輝 主 編 (2000) 酵 素 化 學 實 驗 。 台 灣 大 學 農 化 系 。 頁 76~81Nelson DL, Cox MM (2005) Lehninger Principles of Biochemistry (4th ed) p.202-213S3-4 Biochemistry Laboratory