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Plate-forme deCytogénétique MoléculaireVégétale ( )Offre actuelle, ContourResp. Olivier CORITONUMR 1349 IGEPPINRA-Agrocampus ouest-Univ Rennes 1INRA Centre de Rennesolivier.coriton@rennes.inra.frNantes, le 28 Mars 2013

Cytogénétique Moléculaire ?

Cytogénétique Moléculaire ?née de la rencontre«Biologie moléculaire»et «Cytogénétique traditionnelle»FISHL’outil principal est l’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur préparationchromosomique permet une« Analyse fine de la structure des chromosomes »

FISHLes outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projetsscientifiques d’études des génomes pour :2 à 5 Mb• Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybridesinterspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification deschromosomes parentaux ou introgression,• Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes,• Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre lacartographie génétique et physique,1 kb• Cartographie physique fine sur chromosomes en méiose (stade pachytène)et sur fibres d’ADN permettant la caractérisation fine de l’ordre du kbautour de locus d’intérêt ou la détection d’un remaniement chromosomique

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH)sur chromosomes1- Préparation des lames-> Pour Mitose : Pointe de racine-> Pour Méiose : Anthère (Etamine)Sélection des lames

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH)sur chromosomes mitoses Multi-espècesNiveau de Polyploïdie :2X2X2X2X2X4X4X6X8X

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH)sur chromosomes en méioseLeptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase IMétaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade• Stade pachytène (les chromosomes sontappariés sur toutes leurs longueurs) Résolution x15• Stade métaphase I

Prestations proposées par la plate-forme• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation deschromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques oupolyploïdes• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)1U 5U5S v6S v

Prestations proposées par la plate-forme• Localisation physique de clones BAC sur chromosomes en mitose et enméiose (BAC-FISH)• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences surfibre d'ADN peignées

Exemple 1 :Technique GISH chez un polyploïdeLe blé tendre, Allohexaploide2n=6X=420,5 MYAAe. speltoidesA-genomeT. urartu10000 YA?B-genomeD-genome

Exemple 1 :Technique GISH chez un polyploideMix sondes ADN GénomiqueD-probe-digoxgénineB-genomeA-genomechromosomes« cible »HybridationA-probe-biotine?B-genomeD-genomeDétectionAnti-dig-FluorescéineAvidin- Texas red

Exemple 1 :Technique GISH chez un polyploïdeFiltre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red

Exemple 1 :Technique GISH chez un polyploideTranslocation4A/7BTranslocation4A/7B

Exemple 2 :Techniques FISH + GISH sur Blé dur,tétraploide (AABB)Chr 1A ou 5A?4A/7B4A/7BChr 1A ou 5A?

Exemple 3 :Technique GISH-like -> Le COLZA, AllotétraploideB. rapaAA, 2n=202000 YAB. oleraceaCC, 2n=18B. napusAACC, 2n=38

Exemple 3 :Technique GISH-like -> Le COLZA, AllotétraploideSonde spécifique du génome CGISH - likeB. rapaAA, 2n=20B. oleraceaCC, 2n=18B. napusAACC, 2n=38

Plate-forme de CytogénétiqueMoléculaire Végétale• Equipement / Personnel• Conditions d’accès• Cout des prestations• Lisibilité• Formations• Démarche Qualité

Plate-Forme de CytogénétiqueMoléculaire VégétaleINRA- UMR 1349 Institut de Génétique,Environnement et Protection des Plantes(IGEPP)- LE RHEU

1- Équipements• Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire• Microscopie* Epifluorescence Axioplan 2 Zeiss* Système d'imagerie• Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ)• Logiciel d'acquisition METAVUE (UNIVERSAL IMAGING)2- Personnel

3- AccèsLa plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes derecherche :Site web : Un appel d’offre accompagné d’une plaquette de présentationPour la prise en charge des prestations en fonction des demandes,nous avons deux niveaux d’engagement :• soit nous répondons à une prestation complète• soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses

4- Cout des prestations• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétée (FISH)= 33 Euros/lame• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation deschromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques oupolyploïdes= 38 Euros/lame• Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH)sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène)= 33 Euros/lame• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquencessur fibre d'ADN peignées (BAC Fiber-FISH) = 33 Euros/lame-> 200 Euros pour 6 lames

5- LisibilitéDepuis 2009« LABELLISATION DES OUTILS COLLECTIFS »L'INRA a prévu de reconnaître 4 types d'outils collectifs en fonction de leurenvergure :1- Plateformes Stratégiques INRA2- Plateformes INRA3- Plateaux Techniques INRA4- Ateliers INRALe collège de direction a rendu son arbitrage identifiant notre outilcomme Plateau Technique (PT) auprès de la CNOC :Outil N°37 « Plate-Forme de cytogénétique moléculaire «

6- FormationsLa plate-forme a également une mission de formation et d'information auprèsdes chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie.Exemples :* Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a étémis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier (Resp. A. D’Hont).-> L’accueil de M. Rodier nous a permis d’échanger et d'optimiser les techniques de marquagedes clones BAC et de détection* Sur Caféier diploïde (C. canephora), nous avons pu mettre au point et formerV. Viader (CIRAD-IRD-Montpellier) à la technique de BAC-FISH

7- QualitéLa PF s’est adossée à la démarche qualité mise enplace par l’unité sous l’animation de deux groupes detravail « AQR » et « Métrologie » en lien avec unanimateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001).Les principales actions « qualité » mises en œuvre sur la PF ont été :(1) Mise en place des cahiers de laboratoires,•(2) Rédaction de 30 Modes Opératoires,(3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l’INRA),(4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT)Contrôle des balancesContrôle annuel des micropipettesMETTLER TOLEDO

FISH chez les plantes?Exemples de projetsdéveloppés au sein de l’unitéEquipe 1 - Biodiversité et PolyploïdieDécrire et structurer la diversité génétique, l’exploitervia la recombinaison homologue et homéologue(Resp. A-M Chèvre)50%Plate forme de cytogénétiqueMoléculaire

[1] Quels sont les mécanismes de spéciation et de régulation desrecombinaisons homologues et homéologues :Phase 1 : Suivi des modifications structurales qui interviennent dans lesgénomes lors de la stabilisation d’espèces allopolyploïdesStratégies :Espèces diploïdes1+1#2Synthétiques4X, 6X?Espèces allopolyploïdes4X, 6X10000 ans 2000 ansANR Biodiversité(AABBDD,2n=6X=42)(AACC, 2n=4X=38)

Quelles sont les différences entre un colza synthétique et un colza naturel ?B. Rapa (Navet)AA, 2n=2X=20xB. Oleracea (choux)CC, 2n=2X=181- Modifications structurales : Le GISH-like a montré d’des irrégularités méiotiques avec des appariements entreles génomes A et C permettant la formation detranslocations dès la 1ere méiose -> Caractérisation desréarrangements a pu être validée par BAC-FISH.S0C1C1A1B. Napus (colza)AACC, 2n=4X=38C1Nicolas et al, 2008, 2009Leflon et al, 2010Szadkowski et al 2010, 2011Ksiazczyk et al, 2011Suay et al, 20132- Modifications fonctionnelles dès l’hybridation. Le chocgénomique se traduit par des modifications au niveau desséquences ribosomiques liées à une régulationépigénétique.ANR BiodiversitéColl Moulon, IJPB-Versailles, URGV-Evry,Univ Rennes1, Brno-Czech Republic

Quelles sont les différences entre un blé synthétique et un blé naturel ?x×1- Stabilité méiotique : le GISH n’a pas montré d’importantesirrégularités, défaut partiel d’appariement homologue conduisantà la formation d’aneuploides,Blé durAABB2n = 4X= 28DD (Aegilopstauschii)2n = 2X= 142- Modifications structurales : aucun réarrangement ouélimination de séquence d’ADN n’a été observé chez les bléssynthétiques au cours des trois premières générations,Blé tendre AABBDD2n = 6X= 42Mestiri et al 2010, 2013Chagué et al, 2010Chelaifa et al, 20133- Expression des gènes (transcrits) : additivité majoritairepas d’effet générationpas d’effet du génome Dpeu de différences avec blé tendreColl URGV-EvryANR Biodiversité

[2] les transferts de gènes entre espècesOptimisationd’introduction degènes d’intérêtLes connaissances acquises permettentMécanismes impliqués dans lastabilisation d’une espècepolyploïdeEvaluation deflux de gènes(AABBDD, 2n=42)(AACC, 2n=38)* Résistance aux nématodes à partir de Aegilops variabilis(Coriton et al, 2009)Effet de la position des(trans)gènes sur le flux1B 6B 5DAddedchromosome* Recombinaison entre chromosomes homéologues de Blé :Caractérisation de lignées isohoméoalléliques pour les gluténines de hautpoids moléculaire (Dumur. J et al, 2009b, 2009b)1A /1D

FISH chez les plantes?Projets développés en collaborationavec des équipes extérieures

La plate-forme est ouverte à 50% de sa capacité :Collaboration à différents projets de recherche extérieursR. Freuda-Agyeman, H. Rahman - University of AlbertaCANADAG. King, C. Ryder– Univ Warwick - UKPFMCVINRA, CNRSUniv- RennesINRA- EvryMUSEUM- ParisINRA- VersaillesINRA- AngersINRA- ColmarA. Kovarik, Academy of Sciences,Brno – CZECH REPUBLICINRA- LusignanINRA- Clermont-FdINRA- BordeauxINRA- ToulouseINRACIRADIRD MontpellierA. Mason, M. Nelson University of QueenslandBrisbane – AUSTRALIA

PROJETS : Structures hybrides interspécifiques oupolyploïdes ?1- UR de Génétique et d'amélioration des plantes fourragères - LUSIGNANProjet : Analyse de la dynamique de la diversité génétique au sein de peuplementde Ray-grass introgressé par la Fétuque2- UMR Diversité et génome des plantes cultivées – MONTPELLIERProjet : Suivi de populations d’Aegilops au contact de blés cultivés et étude desphénomènes d’introgression3- UR 419 sur les Espèces fruitières et la Vigne, « Analyse des génomes de Fragaria » -BORDEAUXProjet : Utilisation de la cartographie physique pour définir l’origine du génomedes espèces polyploïdes au sein du genre Fragaria en particulier chez le fraisiercultivé F. x ananassa (Espèce octoploïde)4 - UMR GenHort – INH ANGERSProjet : Hybridation somatique interspécifique chezpélargonium - caractérisation cytogénétique et moléculaire

PROJETS : Dynamique des génomes chez des espècespolyploïdes- Eléments Transposables5- UMR 1095 Amélioration et Santé des Plantes – CLERMONT-FERRANDProjets : Elements transposables et Histoire évolutive de Triticum sp-6- UR Génomique Végétale (URGV) - EVRYProjets : Etude de l’activation des Éléments transposables chez le blé tendre7- UMR CNRS 6553 Ecobio « Evolution des Genomes et Speciation - RENNESProjet 1: Evaluation de l’implication des rétrotransposons dans lavariation de la taille des génomes chez des espèces de lupinsécologiquement divergentesProjet 2 : Origine de la polyploïdie dans le complexe Hordeum murinum enAfrique du Nord : Diversité et évolution

PROJETS : Cartographie physique fine de locus surchromosomes8- UMR SVQV- Génétique et d'Amélioration de la Vigne - COLMARProjet : Localisation des contigs de séquences de l’assemblage du génome9- UMR619 Biologie du Fruit - BORDEAUXProjet : Etude des conséquences de la polyploïdie sur le fonctionnement et la croissance cellulaire au coursdu développement du fruit10- UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSEProjet : Assignation de BAC par FISH en appui pour le séquençage duchromosome 7 de la Tomate

Exemple de projet de Cartographie PhysiqueUMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE

chrChromosome 7 projectGenomic and Biotechnology of FruitUMR990 INRA/INP-Toulouse FranceFarid Regad, Mondher Bouzayen (Project leader)

Genome Structure• Diploid specie• 12 chromosomes pairs• Genome size 950MB• Repeat sequence 30%• Sequencing of gene-rich euchromatic region - 220MB• Estimated number of BACs to be sequenced: 277

FISH mapping statusFISH :Plate-Forme RennesS. Stack (Colorado, USA)Z. Cheng (Pékin, Chine)050 BACs clones will be or not onthe chromosome 704 situations

(1)(2)BAC LE_ HBa 0104E22 + 309B15BAC LE_ HBa 0006H17 + 309B15BAC LE_ HBa 0224G23 + 309B15(3)(4)BAC LE_ HBa 0027G01 + 309B15BAC LE_ HBa 0173A21+ 309B15BAC LE_ HBa 0116J06

FISH mapping status• BACs are in the process on the chromosome0High-resolution FISH strategieson pachytene chromosomesK7

Infos:15 BACsBAC nameSL_EcoRI0127B09plasmidpIndigoBAC-5Detailsinsertsize(kb)?positioncM?LE_HBa0048M11LE_HBa0140O20pBeloBAC11pBeloBAC11?85,5137 72LE_HBa0018L21pBeloBAC11??LE_HBa0309F18pBeloBAC11129104LE_HBa0102J11pBeloBAC1111856LE_HBa0046G04LE_HBa0195N01pBeloBAC11pBeloBAC11110?63,5?LE_HBa0006H17LE_HBa0030C22LE_HBa0024K03LE_HBa0028P04LE_HBa0224G23pBeloBAC11pBeloBAC11pBeloBAC11pBeloBAC11pBeloBAC1134 52121 ?14754? ?114 22,5LE_HBa0309B15pBeloBAC11K7 subtelomeric site on the long arm ofchromosome 7.11092LE_HBa0057J04Renferme la séquence centromérique TGR4

Mitose-> La résolution des chromosomes en mitose n’est pas suffisante(impossible de visualiser le pool de BAC)

MéioseK7K7Steve stack (US)BAC 309B15Hans deHong (NL)

MéioseK7K7Steve stack (US)BAC 309B15Hans deHong (NL)

Plate-forme deCytogénétique MoléculaireVégétale ( )MERCI DE VOTRE ATTENTIONhttp://www.biogenouest.org/contenu/plates-formes/bio-imagerie/cytogenetique