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3.2 Implication du facteur anticoagulant, protéine S, et de son homoloque structural Gas6 dans la croissance des cultures de CSN issues de la SVZ du cerveau de rongeurs post-natals le co-marquage avec le récepteur Axl). Les noyaux sont marqués par du Topro-3 (en bleu). Barre d’échelle : 25 µm. Nos résultats de RT-PCR et de Western blot montrent que les trois récepteurs de la famille TAM sont exprimés par les cellules de la SVZ in vitro (Figure 30a et b). Par immunocytochimie, nous montrons que les cellules de type glial, de type neuronal et les cellules immatures expriment les récepteurs Mer et Tyro3. Le récepteur Axl est exprimé par les cellules de type neuronal, dans certaines cellules gliales et rarement par les cellules immatures (Figure 30c). L’immunomarquage sur les cellules de la SVZ révèle également la présence d’Axl au niveau du fuseau mitotique, de ses pôles (Figure 31a) ainsi qu’au point de cytodiérèse (Figure 31b). Ces observations ont été faites dans des cellules gliales (GFAP positives), des cellules du lignage neuronal (βIII-tubuline positives) mais aussi dans des cellules immatures (Nestine positives). La protéine Axl est un récepteur tyrosine kinase localisé normalement à la membrane plasmique. Cette localisation abérrante devra faire l’objet d’études ultérieures. Figure 31 : Localisation atypique du récepteur Axl dans les CSN. Détection par immunocytochimie du récepteur Axl (en vert) ainsi que de la GFAP ou de la βIII-tubuline (en rouge) au niveau (a) du fuseau mitotique et (b) au point de cytodiérèse. Les noyaux sont marqués par du Topro-3 (en bleu). Barre d’échelle : 25 µm. Dans un second temps, nous avons vérifié l’activation potentielle des récepteurs TAM par leur ligand. Pour cela les cellules de la SVZ ont été traitées avec la protéine Gas6 ou la protéine S à 140 nM pendant 10 minutes (Figure 32). Nous observons une activation par phosphorylation du récepteur Tyro3 en présence de la protéine S seule ou supplémentée de la protéine Gas6 par rapport aux conditions contrôles. La protéine Gas6 active le récepteur Axl, cette activation est inhibée en présence de la protéine S (Figure 32). Dans nos conditions expérimentales, l’activation du récepteur Mer n’a pas été observée. 94
3.2 Implication du facteur anticoagulant, protéine S, et de son homoloque structural Gas6 dans la croissance des cultures de CSN issues de la SVZ du cerveau de rongeurs post-natals Figure 32 : Activation des récepteurs TAM par la protéine Gas6 et la protéine S. Détection de la phophorylation des récepteurs Tyro3 et Mer par immunoprécipitation (IP) et Western blot (WB) phospho-tyrosine, et de la phosphorylation du récepteur Axl par Western blot par rapport aux récepteurs totaux suite au maintien des cellules 10 minutes dans du SFM seul (C), ou supplémenté de la protéine Gas6 et/ou de la protéine S (PS). Les cellules souches neurales issues de la SVZ de rats nouveau-nés expriment donc les trois récepteurs TAM. Dans nos conditions expérimentales, la protéine Gas6 active le récepteur Axl, et la protéine S active le récepteur Tyro3 et inhibe l’activation du récepteur Axl induite par la protéine Gas6. 3.2.5 La protéine S inhibe la croissance des cellules de la SVZ et réverse l’effet stimulateur de la warfarine in vitro La prolifération des cellules souches neurales issues de la zone sous-ventriculaire pouvant être régulée de manière autocrine et paracrine par les PVKDs, nous avons étudié l’effet d’un apport exogène en protéine Gas6 et en protéine S sur la croissance de ces cellules. Le traitement de cellules issues de SVZ in vitro par la protéine S induit une baisse significative d’environ 20% du nombre de cellules en culture alors que la protéine Gas6 n’a pas d’effet (Figure 33 a et b). De plus, la protéine S réverse l’effet stimulateur de la warfarine sur la croissance des cellules (Figure 33c). La protéine S a donc un effet inhibiteur sur la 95
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THÈSE Pour l’obtention du Grade
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Mes remerciements s’adressent bie
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AVANT-PROPOS La coagulation du sang
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RCS : Royal College of Surgeons RMS
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Gène invalidé Système nerveux Sy
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