Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

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74 2.9 Analyses des données et tests statistiques TOPRO-3. La flurorescence émise est collectée, via un photomultiplicateur, à des longueurs d’onde comprises entre 425 et 475 nm pour le Dapi, 500 et 530 nm pour l’Alexa Fluor 488, 550 et 625 nm pour les Alexa Fluor 555 et 568 et à 650 nm pour l’Alexa Fluor 647 et le TOPRO-3 2.9.2 Mesures Les comptages des cellules immunoréactives pour BrdU, TUNEL, GFAP, βIIItubuline ou O4 sur les cellules de la SVZ ont été réalisés avec un microscope BX60 Olympus à platine motorisée, couplé à un ordinateur et piloté par le logiciel d’analyse d’images Neurolucida (MicrobrightFied Inc., Colchester VT, USA). Le comptage des cellules positives et négatives a été effectué sur chaque lamelle, pour au moins 10 champs analysés à l’objectif 40X. Les données sont présentées sous forme de pourcentage du nombre de cellules positives par rapport au nombre total de cellules comptées dans les champs analysés, ou sous forme de variation du nombre de cellules, en pourcentage par rapport au témoin. Les données obtenues sont exprimées en moyenne ± écart type (SEM). Les comptages sur la rétine et les coupes de cerveaux en fluorescence ont été réalisés à partir de photos prises au microscope confocal et à l’aide du logiciel Image J. La quantification des cellules BrdU positives révélées en DAB a été effectuée directement sous microscope à transmission. 2.9.3 Analyses statistiques Pour une même expérience, chaque condition expérimentale est reproduite dans 4 puits séparés. Sauf indication contraire, pour chaque série, les expériences sont reproduites au moins 3 fois. L’analyse statistique a été réalisée au moyen des logiciels Statview 5.0 ou Graphpad Prism 4. Les résultats obtenus dans les différentes mesures ont été comparés entre les différents groupes expérimentaux en utilisant le test statistique d’analyse de variance ANOVA suivi du test posthoc de Bonferroni ou Mann&Whitney pour des comparaisons 2 à 2. Les données sont considérées significativement différentes pour des valeurs de P
RÉSULTATS et DISCUSSIONS 3.1 L’inhibition de la sécrétion des PVKDs stimule la prolifération des cellules souches neurales issues de la SVZ du cerveau de rongeurs post- natals in vitro et in vivo L’objectif de ce travail a été de mettre en évidence le rôle des protéines vitamine-K dépendantes sur la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales issues de la zone sous-ventriculaire du cerveau de rats nouveaux-nés in vitro et in vivo. Pour cela, nous avons mis au point un modèle expérimental qui consiste à moduler la sécrétion de l’ensemble des PVKDs. L’utilisation de la warfarine nous a permis d’inhiber la sécrétion des PVKDs par les CSN (Wallin and Hutson, 2004), alors que l’ajout de vitamine K1 a au contraire permis de stimuler leur production. Cette étude in vitro a été complétée par une étude in vivo qui a consisté en l’injection intracérébroventriculaire de warfarine dans le ventricule latéral de souris adultes. 3.1.1 Effet des PVKDs sur la prolifération des CSN in vitro 3.1.1.1 Expression et fonctionnalité du système de γ-carboxylation Dans un premier temps, nous avons étudié, par RT-PCR, la présence des acteurs majeurs du complexe enzymatique permettant la réaction de γ-carboxylation dans les cellules de la SVZ de rats nouveau-nés. Cette analyse montre que les CSN expriment l’ARNm de la γcarboxylase, de la VKOR ainsi que de la caluménine (Figure 18a). Ces cellules expriment donc la machinerie enzymatique nécessaire à la γ-carboxylation des protéines vitamine Kdépendantes. Afin de vérifier la fonctionnalité du système de γ-carboxylation et donc de la sécrétion des PVKDs par les CSN, les cellules ont été cultivées pendant 5 jours en conditions basales ou en présence de S-warfarine à 1 µg.ml -1 ou de vitamine K1 à 10 µg.ml -1 . Nous avons ensuite détecté dans le milieu conditionné par les CSN l’ensemble des PVKDs par Western 75
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THÈSE Pour l’obtention du Grade
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Mes remerciements s’adressent bie
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SOMMAIRE Avant-propos .............
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AVANT-PROPOS La coagulation du sang
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RCS : Royal College of Surgeons RMS
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