Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.8 Étude du rôle de la protéine Gas6 dans la rétinogenèse
Les souris sont sacrifiées 3 ou 14 jours après photocoagulation laser. Les yeux sont
immédiatement prélevés, montés dans du Tissue Tek (OCT) (Bayer Diagnostics, Puteaux,
France) et conservés à -80°C jusqu’à l’analyse.
L’analyse immunohistologique des rétines de souris sacrifiées 3 jours après
photocoagulation nous permettrons d’observer, au niveau du site de l’impact, des réactions
cellulaires précoces induites par le laser telles que :
- l’apoptose de photorécepteurs lésés dans l’axe de l’impact (cellules Tunel positives);
- l’infiltration macrophagique (cellules F4/80 positives);
- et la prolifération cellulaire incluant la prolifération de macrophages, de cellules
endothéliales, de cellules vasculaires de muscle lisse, de cellules de l’EPRet d’autres types
cellulaires non identifiés (cellules Ki67 positives) (Espinosa-Heidmann et al., 2005).
L’apparition de néovaisseaux (cellules endothéliales Von Willebrand positives) sera analysée
14 jours après lésion, temps nécessaire à leur organisation (Dot et al., 2009). Ces données ne
seront pas présentées dans ce manuscrit.
2.8.2 Mesure des réactions cellulaires induites par la photocoagulation laser
2.8.2.1 Détection des antigènes Ki67 et F4/80
Des coupes en série de 10 µm des yeux sont réalisées grâce à l’utilisation d’un cryostat
CM3050S (Leica). Les lésions induites par le laser sont localisées à l’aide d’un microscope.
Toutes les coupes contenant des traces de l’impact sont récupérées sur des lames de verre
superfrost et conservées à -20°C jusqu’à leur utilisation.
Durant les 7 jours suivant la photocoagulation, le processus de réparation de la lésion
est caractérisé par l’infiltration de macrophages (cellules F4/80 positives) et la prolifération
cellulaire (cellules Ki67 positives). Ces cellules en prolifération sont localisées à l’intérieur de
la choroïde, au niveau de la sclère au centre de la lésion induite par le laser.
La protéine Ki67 est une protéine nucléaire exprimée préférentiellement au cours de
phases actives du cycle cellulaire, sa détection permet donc de quantifier le taux de cellules en
prolifération. La protéine F4/80 est une glycoprotéine de surface exprimée par les
macrophages circulants recrutés en réponse à la lésion ainsi que par les cellules de la
microglie qui représentent les macrophages résidants de la rétine. Afin de révéler ces
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