Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.6 Voies de signalisation intracellulaires impliquées dans l’effet des PVKDs sur les CSNs
issues de la SVZ
(Calbiochem) et d’inhibiteurs de protéases sans EDTA (Roche) puis incubé 10 minutes à
100°C avant le dosage des protéines par la méthode de Lowry. Pour l’immunoprécipitation,
100 µg de protéines totales sont dilués dans du tampon RIPA (50 mM Tris-HCL, 100 mM
NaCl, 0.5% sodium déoxycholate, 1% tergitol, 0.2% SDS), auquels sont ajoutés 1 µg
d’anticorps primaires anti-Tyro3 ou anti-Mer. Les échantillons sont incubés une nuit à 4°C sur
roue rotative. Les complexes immuns sont alors précipités par l’addition de 30 µl de billes
couplées à la protéine G sépharose une heure à température ambiante. L’immunoprécipitat est
ensuite collecté par centrifugation et lavé dans du tampon RIPA avant d’être resuspendu dans
du tampon laemmli. La phosphorylation du récepteur Axl est directement analysée par
Western blot.
Les protéines sont séparées sur un gel SDS-polyacrylamide à 10% et transférées sur
une membrane de PVDF. Les sites d’hybridation non-spécifiques sont bloqués 2 heures dans
une solution de TBS Tween-20 contenant 5% de lait écrémé pour la détection des récepteurs
TAM et 5% de BSA pour la détection des phospho-tyrosines. Les membranes sont ensuite
incubées une nuit à 4°C dans la solution de blocage contenant les anticorps primaires. Le
lendemain, les membranes sont incubées 1 heure à température ambiante avec les anticorps
secondaires couplés à la peroxydase (Tableau IX). Enfin, les complexes immuns sont révélés
par chimioluminescence à l’aide du kit « ECL-plus » sur film.
2.7 Activité phagocytique des CSN issues de la SVZ du cerveau de
rats nouveau-nés.
La phagocytose est impliquée dans une grande variété d’évènements cellulaires,
notamment lors du développement du système nerveux central. Nous nous sommes intéressés
dans un premier temps à vérifier la capacité des CSN de la SVZ à phagocyter et dans un
deuxième temps à examiner la capacité de la protéine Gas6 et la protéine S à moduler ce
processus.
2.7.1 Etude de la phagocytose par microscopie confocale
Cette expérience est réalisée sur des cellules adhérentes à des lamelles de verre. Des
billes de latex d’un diamètre de 1 µm couplées au FITC (Sigma) à une concentration de
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