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2.6 Voies de signalisation intracellulaires impliquées dans l’effet des PVKDs sur les CSNs issues de la SVZ Antigène recherché Tyro3 Axl Mer Phospho- tyrosine Tableau IX : Anticorps utilisés pour la caractérisation des récepteurs TAM dans les cultures de SVZ 2.6.3 Etude de l’activation des récepteurs TAM par la protéine Gas6 et la protéine S Anticorps primaires, fournisseur et dilution WB : chèvre polyclonal ( C-20, Santa cruz), 1/500 ICC : chèvre polyclonal (N-18, Santa cruz), 1/200 WB : chèvre polyclonal (Santa cruz),1/500 ICC : lapin polyclonal (Santa cruz), 1/200 chèvre polyclonal (Santa cruz) WB : 1/500 ICC : 1/200 WB : souris monoclonal (Sigma) 1/5000 Phospho-Axl WB : lapin polyclonal (R&D systems) 1/200 Phospho-Mer WB : lapin polyclonal (Fabgennix) 1/750 Afin de déterminer les voies de signalisation activées suite à une stimulation des cellules par la protéine Gas6 et/ou la protéine S nous avons réalisé une analyse quantitative par immunoprécipitation et par Western blot, de la phosphorylation des récepteurs TAM ainsi que de certaines protéines intracellulaires. Pour cela, les neurosphères obtenues après 5 jours de culture dans du SFM contenant 20 ng.ml -1 d’EGF sont repiquées dans du SFM à une concentration de 5.10 6 cellules.ml -1 dans des tubes eppendorfs. Les cellules sont ensuite incubées en présence de la protéine Gas6 et/ou de 140 mM de protéine S pendant 8 minutes à 37°C sur une roue rotative. Elles sont ensuite centrifugées 2 minutes à 200 g à 4°C après l’ajout de 1 mM d’orthovanadate de sodium par tube. Le culot est resuspendu dans 120 µl de tampon de lyse Laemmli en présence d’un mélange d’inhibiteurs de phosphatases 68 Anticorps secondaires, fournisseur et dilution WB: Âne anti-chèvre peroxydase (Santa cruz), 1/8000 ICC : Âne anti-chèvre Alexa Fluor 568 (Molecular probe), 1/200 WB : Âne anti-chèvre peroxydase(Santa cruz), 1/8000 ICC : chèvre anti-latin Alexa Fluor 488 (Molecular probe), 1/200 WB : Âne anti-chèvre peroxydase(Santa cruz), 1/8000 ICC : Âne anti-chèvre Alexa Fluor 568 (Molecular probe), 1/200 WB : chèvre anti-souris peroxydase (Sigma), 1/80000 WB : chèvre anti-lapin peroxydase (Sigma), 1/20000 WB : chèvre anti-lapin peroxydase (Sigma), 1/20000
2.6 Voies de signalisation intracellulaires impliquées dans l’effet des PVKDs sur les CSNs issues de la SVZ (Calbiochem) et d’inhibiteurs de protéases sans EDTA (Roche) puis incubé 10 minutes à 100°C avant le dosage des protéines par la méthode de Lowry. Pour l’immunoprécipitation, 100 µg de protéines totales sont dilués dans du tampon RIPA (50 mM Tris-HCL, 100 mM NaCl, 0.5% sodium déoxycholate, 1% tergitol, 0.2% SDS), auquels sont ajoutés 1 µg d’anticorps primaires anti-Tyro3 ou anti-Mer. Les échantillons sont incubés une nuit à 4°C sur roue rotative. Les complexes immuns sont alors précipités par l’addition de 30 µl de billes couplées à la protéine G sépharose une heure à température ambiante. L’immunoprécipitat est ensuite collecté par centrifugation et lavé dans du tampon RIPA avant d’être resuspendu dans du tampon laemmli. La phosphorylation du récepteur Axl est directement analysée par Western blot. Les protéines sont séparées sur un gel SDS-polyacrylamide à 10% et transférées sur une membrane de PVDF. Les sites d’hybridation non-spécifiques sont bloqués 2 heures dans une solution de TBS Tween-20 contenant 5% de lait écrémé pour la détection des récepteurs TAM et 5% de BSA pour la détection des phospho-tyrosines. Les membranes sont ensuite incubées une nuit à 4°C dans la solution de blocage contenant les anticorps primaires. Le lendemain, les membranes sont incubées 1 heure à température ambiante avec les anticorps secondaires couplés à la peroxydase (Tableau IX). Enfin, les complexes immuns sont révélés par chimioluminescence à l’aide du kit « ECL-plus » sur film. 2.7 Activité phagocytique des CSN issues de la SVZ du cerveau de rats nouveau-nés. La phagocytose est impliquée dans une grande variété d’évènements cellulaires, notamment lors du développement du système nerveux central. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à vérifier la capacité des CSN de la SVZ à phagocyter et dans un deuxième temps à examiner la capacité de la protéine Gas6 et la protéine S à moduler ce processus. 2.7.1 Etude de la phagocytose par microscopie confocale Cette expérience est réalisée sur des cellules adhérentes à des lamelles de verre. Des billes de latex d’un diamètre de 1 µm couplées au FITC (Sigma) à une concentration de 69
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THÈSE Pour l’obtention du Grade
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Mes remerciements s’adressent bie
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SOMMAIRE Avant-propos .............
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AVANT-PROPOS La coagulation du sang
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RCS : Royal College of Surgeons RMS
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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Mécani
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CHAP 4- CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
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BIBLIOGRAPHIE Abd-el-Basset, E.M.,
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Implication des protéines vitamine
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