Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

More documents

Recommendations

Info

2.5 Détermination du rôle des protéines S et Gas6 dans les CSN issues de la SVZ in vitro de milieux conditionnés produits à partir de cellules HEK 293 qui surexpriment, après une transfection stable, la forme murine de la protéine Gas6. Les cellules HEK sont incubées dans un milieu défini en présence de 10 µg.ml -1 de vitamine K1 pendant 3 jours. Le milieu est prélevé, centrifugé puis concentré sur centricon 30K. Le milieu conditionné concentré est alors précipité à l’aide de citrate de barium, méthode de précipitation sélective des protéines γ-carboxylées (Berkner, 1993). Pour cela, il est supplémenté d’antiprotéases (P2714, Sigma) puis traité avec une solution de citrate de sodium à une concentration de 0,5 M (concentration finale de 20 mM) sur glace pendant 10 minutes. Le citrate chélate les ions Ca 2+ fixés sur le domaine Gla des protéines γ-carboxylées. Une solution de BaCl2 à 1 M (concentration finale de 40 mM) est ensuite ajoutée pendant 2 heures sur glace. Durant cette étape, les ions Ba 2+ se fixent sur le domaine Gla et il se forme un précipité de barium citrate qui absorbe les protéines γ-carboxylées. Enfin, le précipitat est collecté par centrifugation puis lavé deux fois dans un tampon contenant 100 mM de BaCl2 et 100 mM de NaCl afin d'éliminer l'excès d'ions Ba 2+ non fixés au domaine Gla. Il est ensuite ressolubilisé dans 1/10 ème du volume de départ dans une solution de citrate de sodium à 150 mM. Le citrate chélate les ions Ba 2+ fixés sur le domaine Gla ce qui permet la solubilisation du culot. 2.5.2 Mesure de l’effet de la protéine Gas6 et de la protéine S sur la croissance et l’autorenouvellement des cellules issues de la SVZ Les effets de la protéine Gas6 et de la protéine S sur la prolifération et l’autorenouvellement des cellules ont été évalués d’un part en additionnant ces deux PVKDs aux cultures de SVZ et d’autre part en examinant l’effet de l’absence de la protéine Gas6 sur des cultures de SCN issues de souris déficientes pour le gène codant pour la protéine Gas6 (Gas6 -/- ) par rapport à des cellules issues de SVZ de souris sauvages (Gas6 +/+ ). Comme précédemment décrit, les cellules de la SVZ issues de rats nouveau-nés sont mises en culture pendant 5 jours dans du SFM additionné de 20 ng.ml −1 d’EGF supplémenté de la protéine Gas6 ou de la protéine S à 140 nM (Calbiochem). Des cellules issues de la SVZ de souris Gas6 -/- et de souris Gas6 +/+ de même espèce et de même âge sont également mises en culture dans du SFM additionné de 20 ng.ml −1 de EGF. Après comptage des neurosphères primaires et des cellules, celles-ci sont réensemencées à la densité de 3000 cellules.ml -1 . Après 5 jours, le nombre de sphères secondaires ainsi que de cellules vivantes est évalué. 66
67 CHAP 2- PARTIE EXPÉRIMENTALE 2.6 Voies de signalisation intracellulaires impliquées dans l’effet des PVKDs sur les CSN issues de la SVZ 2.6.1 Recherche par RT- PCR de l’expression des ARNm des récepteurs TAM L’extraction des ARNs totaux, la transcription inverse et la PCR sont effectuées comme précédemment décrit. Les ARNs extraits de testicules de rats sont utilisés comme contrôles positifs pour l’expression des récepteurs TAM. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau ci-dessous. Cible Amorces (sens, anti-sens) Température d’hybridation (°C) Taille de la sequence amplifiée (bp) Numéro d’accession Genbank Tyro3 5’-TTTGCGTGTGTGTGCCTCCAAT-3’ 5’-ATGTCCTCTGCCAGCATGCAAT-3’ 54.5 828 8394495 Axl 5’-TGTTCGAGCCAACTGTGGAA-3’ 5’-ACTTGACTGGCATCTTGGCA-3’ 52.0 693 18389318 Mer 5’-AATGCACAATGCCACCTGCACA-3’ 5’-ATCCCGCAACATGCAATTCCGA-3’ 55.5 847 12738846 Tableau VIII : Amorces utilisées lors de la transcription inverse et la réaction de PCR 2.6.2 Recherche de l’expression des récepteurs TAM par Western blot et immunocytochimie Western blot Afin de rechercher la présence des récepteurs TAM dans les lysats de culture de CSN, les lysats cellulaires sont solubilisés dans du tampon Laemmli et sont traités comme précédemment décrit en respectant les dilutions d’anticorps répertoriées dans le tableau IX cidessous Immunocytochimie Les cultures de cellules de SVZ étant constituées de différents types cellulaires, nous nous sommes intéressés à déterminer le profil d’expression des récepteurs TAM par coimmunomarquage en respectant les dilutions d’anticorps répertoriées dans les tableaux IX et V.
Page 1 and 2:
THÈSE Pour l’obtention du Grade
Page 3 and 4:
Mes remerciements s’adressent bie
Page 5 and 6:
SOMMAIRE Avant-propos .............
Page 7 and 8:
AVANT-PROPOS La coagulation du sang
Page 9 and 10:
RCS : Royal College of Surgeons RMS
Page 11 and 12:
10 1.1 Les protéines vitamine K-d
Page 13 and 14:
12 1.1 Les protéines vitamine K-d
Page 15 and 16:
1.1.4 Peptides neurotoxiques 14 1.1
Page 17 and 18: 16 1.2 La γ-carboxylation des PVKD
Page 27 and 28: 26 1.3 La protéine S et la protéi
Page 29 and 30: 1.3 La protéine S et la protéine
Page 33 and 34: Gène invalidé Système nerveux Sy
Page 39 and 40: 1.4 Modèles utilisés pour l’ét
Page 55 and 56: PARTIE EXPÉRIMENTALE 2.1 Culture d
Page 57 and 58: 2.1 Culture des CSN issues de la SV
Page 59 and 60: 2.2 Détermination de l’effet des
Page 61 and 62: 2.2 Détermination de l’effet des
Page 63 and 64: 2.3 Détermination du rôle des PVK
Page 65 and 66: 2.4 Caractérisation des PVKDs pré
Page 67: 2.4 Caractérisation des PVKDs pré
Page 71 and 72: 2.6 Voies de signalisation intracel
Page 73 and 74: 2.7 Activité phagocytique des CSN
Page 75 and 76: 2.8 Étude du rôle de la protéine
Page 77 and 78: RÉSULTATS et DISCUSSIONS 3.1 L’i
Page 79 and 80: 3.1 L’inhibition de la sécrétio
Page 89 and 90: 3.2 Implication du facteur anticoag
Page 101 and 102: 99 3.3 Discussion localement peuven
Page 103 and 104: 101 3.3 Discussion nos résultats,
Page 105 and 106: 103 3.3 Discussion de l’ARNm d’
Page 107 and 108: 3.4 Capacité des cellules souches
Page 117 and 118: 3.5 Implication de la protéine Gas
Page 119 and 120:
3.5 Implication de la protéine Gas
Page 121 and 122:
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Mécani
Page 123 and 124:
CHAP 4- CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Page 125 and 126:
BIBLIOGRAPHIE Abd-el-Basset, E.M.,
Page 127 and 128:
125 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Revesz, R.
Page 129 and 130:
127 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Doetsch, F
Page 131 and 132:
129 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Gritti, A.
Page 133 and 134:
131 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Kaneko, N.
Page 135 and 136:
133 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Mallat, M.
Page 137 and 138:
135 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Palmer, T.
Page 139 and 140:
137 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Seaberg, R
Page 141 and 142:
139 CHAP 5-BIBLIOGRAPHIE Vargas, M.
Page 143 and 144:
ANNEXE 1 Revue 141 CHAP 6-ANNEXES G
Page 145:
Implication des protéines vitamine
show all

Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?