Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...
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2.4 Caractérisation des PVKDs présentes dans les cultures de CSN et de plexus choroïdes in vitro spécifique de l’amorce utilisée, 50 s à 72°C). La PCR se termine par une étape finale d’élongation de 7 min à 72°C. Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose de 1,8%. Les ARNs extraits de plexus choroïdes de rats sont utilisés comme contrôles positifs pour l’expression de l’ARNm de la protéine Gas6 et de la protéine S. Des ARNs isolés de foie sont utilisés comme contrôles positifs pour l’expression de l’ARNm des protéines intervenant dans la cascade de coagulation ainsi que pour les protéines du système de γ-carboxylation. 2.4.2 Recherche de l’expression des PVKDs par Western blot et immunocytochimie dans les cultures de SVZ Western blot La recherche des PVKDs sécrétées dans le milieu conditionné par les CSN est effectuée après concentration séléctive des PVKDs par précipitation au citrate de barium (Berkner, 1993). Cette technique est détaillée dans la partie 2.5.1 de cette partie expérimentale. Les extraits de milieu conditionné concentré ou les lysats cellulaires sont solubilisés dans du Laemmli (0,06 M Tris pH 6,8 ; 2% SDS ; 5% β-mercaptoethanol). Les protéines sont séparées sur un gel SDS-polyacrylamide à 10% et transférées sur une membrane de PVDF (Immobilon-P, Millipore, Bedford, USA). Les sites d’hybridation non spécifiques sont bloqués 2 heures dans un tampon TBS Tween-20 (20 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,1% Tween 20) contenant 5% de lait écrémé. Les membranes sont ensuite incubées une nuit à 4°C dans la solution de blocage contenant les anticorps primaires dirigés contre l’ensemble des PVKDs (anti-γ-carboxyglutamyl (Gla) résidus ou anti-Gla), contre la protéine Gas6 ou contre la protéine S. Le lendemain, les membranes sont incubées 1 heure à température ambiante avec les anticorps secondaires couplés à la péroxydase (Tableau VII). Enfin, les complexes immuns sont révélés par chimioluminescence à l’aide du kit « ECL-plus » (Amersham Biosciences) sur film (BioMax MR film, Kodak). Immunocytochimie L’expression de la protéine Gas6 et de la protéine S ont été recherchées par immunocytochimie. Pour cela, les cultures sont incubées en présence des anticorps primaires pendant une nuit à 4°C. Les anticorps primaires sont révélés à l’aide d’anticorps secondaires couplés à un fluorochrome (Tableau VII). 64
2.4 Caractérisation des PVKDs présentes dans les cultures de CSN et de plexus choroïdes in vitro Antigènes recherchés Anticorps primaires, fournisseur et Résidu d’acide γ- carboxyglutamique (résidus Gla) Gas6 protéine S Tableau VII : Anticorps utilisés pour la caractérisation de l’expression des PVKDs dans les cultures de SVZ 2.4.3 Recherche par Western blot de l’expression des PVKDs dans le milieu conditionné par des plexus choroïdes Les plexus choroïdes des ventricules latéraux ont été prélevés sur des coupes frontales de cerveaux de rats Wistar âgés de 3 à 5 jours (R. Janvier, Le Genest-Saint Isles, France) ou de souris C57B6J adultes. Après rinçage dans du milieu de dissection, ils sont incubés dans du SFM pendant 3 à 5 jours à 37°C. Le milieu conditionné est prélevé, centrifugé, concentré deux fois sur centricon 30K et précipité au citrate de barium avant d’être analysé par Western blot. 2.5 Détermination du rôle des protéines S et Gas6 dans les CSN issues de la SVZ in vitro dilution WB : souris monoclonal (American diagnostica), 1/1000 WB et ICC polyclonal de lapin (don du Dr M. Hall), 1/200 Lapin polyclonal (Dako), WB : 1/4000 ICC : 1/200 2.5.1 Purification de la protéine Gas6 La protéine Gas6 n’étant pas disponible commercialement sous sa forme γ-carboxylée (forme active), nous la purifions régulièrement au laboratoire. La purification se fait à partir 65 Anticorps secondaires, fournisseur et dilution WB : chèvre anti-souris peroxydase (Sigma), 1/15000 WB : chèvre anti-lapin peroxydase (Sigma), 1/20000 ICC : chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (Molecular probe), 1/200 WB : chèvre anti-lapin péroxydase (Sigma), 1/20000 ICC : chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (Molecular probes), 1/200
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2.4 Caractérisation <strong>des</strong> PVKDs présentes <strong>dans</strong> les cultures de CSN et de plexus choroï<strong>des</strong> in<br />
vitro<br />
Antigènes recherchés Anticorps primaires, fournisseur et<br />
Résidu d’acide γ-<br />
carboxyglutamique<br />
(résidus G<strong>la</strong>)<br />
Gas6<br />
protéine S<br />
Tableau VII : Anticorps utilisés pour <strong>la</strong> caractérisation de l’expression <strong>des</strong> PVKDs <strong>dans</strong> les<br />
cultures de SVZ<br />
2.4.3 Recherche par Western blot de l’expression <strong>des</strong> PVKDs <strong>dans</strong> le milieu<br />
conditionné par <strong>des</strong> plexus choroï<strong>des</strong><br />
Les plexus choroï<strong>des</strong> <strong>des</strong> ventricules <strong>la</strong>téraux ont été prélevés sur <strong>des</strong> coupes frontales<br />
de cerveaux de rats Wistar âgés de 3 à 5 jours (R. Janvier, Le Genest-Saint Isles, France) ou<br />
de souris C57B6J adultes. Après rinçage <strong>dans</strong> du milieu de dissection, ils sont incubés <strong>dans</strong><br />
du SFM pendant 3 à 5 jours à 37°C. Le milieu conditionné est prélevé, centrifugé, concentré<br />
deux fois sur centricon 30K et précipité au citrate de barium avant d’être analysé par Western<br />
blot.<br />
2.5 Détermination du rôle <strong>des</strong> <strong>protéines</strong> S et Gas6 <strong>dans</strong> les CSN<br />
issues de <strong>la</strong> SVZ in vitro<br />
dilution<br />
WB : souris monoclonal (American<br />
diagnostica), 1/1000<br />
WB et ICC polyclonal de <strong>la</strong>pin (don<br />
du Dr M. Hall), 1/200<br />
Lapin polyclonal (Dako), WB :<br />
1/4000<br />
ICC : 1/200<br />
2.5.1 Purification de <strong>la</strong> protéine Gas6<br />
La protéine Gas6 n’étant pas disponible commercialement sous sa forme γ-carboxylée<br />
(forme active), nous <strong>la</strong> purifions régulièrement au <strong>la</strong>boratoire. La purification se fait à partir<br />
65<br />
Anticorps secondaires, fournisseur et dilution<br />
WB : chèvre anti-souris peroxydase (Sigma),<br />
1/15000<br />
WB : chèvre anti-<strong>la</strong>pin peroxydase (Sigma),<br />
1/20000<br />
ICC : chèvre anti-<strong>la</strong>pin Alexa Fluor 488<br />
(Molecu<strong>la</strong>r probe), 1/200<br />
WB : chèvre anti-<strong>la</strong>pin péroxydase (Sigma),<br />
1/20000<br />
ICC : chèvre anti-<strong>la</strong>pin Alexa Fluor 488<br />
(Molecu<strong>la</strong>r probes), 1/200
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