Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.4 Caractérisation des PVKDs présentes dans les cultures de CSN et de plexus choroïdes in
vitro
spécifique de l’amorce utilisée, 50 s à 72°C). La PCR se termine par une étape finale
d’élongation de 7 min à 72°C. Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur gel
d’agarose de 1,8%.
Les ARNs extraits de plexus choroïdes de rats sont utilisés comme contrôles positifs
pour l’expression de l’ARNm de la protéine Gas6 et de la protéine S. Des ARNs isolés de foie
sont utilisés comme contrôles positifs pour l’expression de l’ARNm des protéines intervenant
dans la cascade de coagulation ainsi que pour les protéines du système de γ-carboxylation.
2.4.2 Recherche de l’expression des PVKDs par Western blot et
immunocytochimie dans les cultures de SVZ
Western blot
La recherche des PVKDs sécrétées dans le milieu conditionné par les CSN est
effectuée après concentration séléctive des PVKDs par précipitation au citrate de barium
(Berkner, 1993). Cette technique est détaillée dans la partie 2.5.1 de cette partie
expérimentale.
Les extraits de milieu conditionné concentré ou les lysats cellulaires sont solubilisés
dans du Laemmli (0,06 M Tris pH 6,8 ; 2% SDS ; 5% β-mercaptoethanol). Les protéines sont
séparées sur un gel SDS-polyacrylamide à 10% et transférées sur une membrane de PVDF
(Immobilon-P, Millipore, Bedford, USA). Les sites d’hybridation non spécifiques sont
bloqués 2 heures dans un tampon TBS Tween-20 (20 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, pH 7.5,
0,1% Tween 20) contenant 5% de lait écrémé. Les membranes sont ensuite incubées une nuit
à 4°C dans la solution de blocage contenant les anticorps primaires dirigés contre l’ensemble
des PVKDs (anti-γ-carboxyglutamyl (Gla) résidus ou anti-Gla), contre la protéine Gas6 ou
contre la protéine S. Le lendemain, les membranes sont incubées 1 heure à température
ambiante avec les anticorps secondaires couplés à la péroxydase (Tableau VII). Enfin, les
complexes immuns sont révélés par chimioluminescence à l’aide du kit « ECL-plus »
(Amersham Biosciences) sur film (BioMax MR film, Kodak).
Immunocytochimie
L’expression de la protéine Gas6 et de la protéine S ont été recherchées par
immunocytochimie. Pour cela, les cultures sont incubées en présence des anticorps primaires
pendant une nuit à 4°C. Les anticorps primaires sont révélés à l’aide d’anticorps secondaires
couplés à un fluorochrome (Tableau VII).
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