Implication des protéines vitamine K-dépendantes dans la ...

2.3 Détermination du rôle des PVKDs dans la SVZ in vivo
au moins 24 heures à 4°C dans cette même solution. Des coupes coronales d’une épaisseur de
40 μm
sont réalisées à l’aide d’un vibratome et placées à -20°C dans une solution de cryoprotection
(éthylène glycol 30%, glycérol 30%) jusqu’à leur utilisation pour les immunomarquages.
Dans un premier temps les péroxydases endogènes sont bloquées dans une solution de PBS
contenant de l’H2O2 à 3% et du méthanol à 10%. Pour la détection du BrdU, l’ADN est
dénaturé dans une solution de PBS contenant du HCL à une concentration finale de 2N et du
triton X-100 à 0,5% pendant 30 minutes à 37°C, puis l’acidité est neutralisée par une
incubation de 30 minutes à température ambiante dans du tampon borax. Le BrdU est ensuite
révélé en présence de 5 μg.ml −1 d’anticorps monoclonaux rat anti-BrdU (Harlan Sera Lab,
Royaume-Uni) durant une nuit à 4°C. Après rinçages, les coupes sont incubées pendant 1
heure 30 à température ambiante en présence de 7 μg.ml −1 d’anticorps biotinylés de lapin antirat
(Vector). La révélation des peroxydases exogènes a lieu comme décrit précédemment. Le
nombre de cellules en prolifération est évalué dans la SVZ sur 5 coupes espacées
régulièrement entre les coordonnées Bregma + 1,18 mm à + 0,14 mm.
Le phénotype des cellules en prolifération (BrdU positives) suite à l’injection de
warfarine a été caractérisé par immunodétection de la GFAP, exprimée par les astrocytes et la
Dcx, exprimée par les neuroblastes. Dans ce cas, le BrdU a été révélé par immunohistochimie
en utilisant de l’avidine couplée à un fluorochrome. Les coupes sont ensuite placées en
présence des anticorps primaires anti-GFAP (polyclonal de poulet, 1/1000) ou anti- Dcx
(polyclonal de chèvre, 1/1000) pendant une nuit à 4°C. Les coupes de cerveaux sont alors
rincées plusieurs fois avec du PBS puis incubées avec les anticorps secondaires adéquats
couplés à un fluorochrome.
2.3.2 Recherche des PVKDs dans la SVZ et le LCR de souris adulte
La protéine Gas6 et la protéine S ont été recherchées in vivo par immunohistochimie
chez les souris adultes C57Bl/6J sauvages ou chez les souris dont le gène codant pour la
protéine Gas6 a été invalidé. Ces dernières servent par ailleurs de témoins négatifs à
l’immunohistochimie de la protéine Gas6 faite chez les souris sauvages. Après euthanasie, les
animaux sont perfusés par du NaCl 9‰ puis du PFA 4%. Les cerveaux sont prélevés,
postfixés et coupés comme précédemment décrit. Après bloquage des sites non spécifiques et
perméabilisation dans une solution de Triton à 0,3% et BSA à 3% dans du PBS, les coupes
sont incubées en présence des anticorps anti-protéine S (polyclonal de lapin, 1/200, Dako) ou
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